Summary
我们在这里描述了一个简单和快速的方法, 以隔离的鼠伤寒沙门氏菌-含有吞噬从巨噬细胞涂层细菌与生物素和亲和。
Abstract
鼠伤寒沙门氏菌是一种在人类中引起胃肠炎的兼胞内细菌。入侵后的叶片固有, S.鼠伤寒杆菌细菌被巨噬细胞快速检测和吞噬, 并被称为吞噬的囊泡, 以使其降解。隔离S.包含吞噬的沙门氏菌已被广泛用于研究S.沙门氏菌感染会改变体成熟的过程, 以防止细菌降解。采用蔗糖梯度离心法对含菌吞噬进行了分离。然而, 这个过程是费时的, 需要专门的设备和一定程度的灵巧。这里描述的是一个用于隔离 S 的简单而快速的方法.鼠伤寒-含有吞噬从巨噬细胞通过涂层细菌与生物素-亲和共轭磁珠。通过这种方法获得的吞噬可以悬浮在任何选择的缓冲液中, 使分离的吞噬的使用范围广泛, 如蛋白质、代谢物和脂质分析。总之, 此方法用于隔离S.含有吞噬的鼠伤寒杆菌是特定的、高效的、快速的, 需要最少的设备, 并且比传统的蔗糖梯度离心方法更具通用性。
Introduction
巨噬细胞是循环的专门的吞噬干细胞, 可以检测、吞噬和降解外周组织中的任何外来微粒, 从凋亡细胞到入侵微生物, 如细菌。表面受体介导的病原体特异标记物的识别通常存在于微生物的表面 (称为病原体相关的分子模式或 PAMPs), 巨噬细胞启动一个复杂的细胞膜重组为了包围和吞噬病原体1。
吞噬的病原体然后被巨噬细胞所包含的细胞内囊泡称为体。通过一系列的融合和裂变事件与其他囊泡, 如体和溶酶体, 包含体获得了一套蛋白质, 需要消除 phagosomal 的内容。因此, 体的酶组成在这个过程中是高度可变的, 被称为体成熟的2。
吞噬后不久, multimeric 复合泡 atp 酶 (v atp 酶) 被纳入体膜融合与体3。这个复合体利用 ATP 泵浦质子从胞到腔的体4。体的酸化是必要的为融合事件与其他泡5和为激活许多 pH 依赖性降解酵素6。在体膜上快速组装的另一种 multimeric 酶复合物是氧化酶 (NOX) 复合物。为了产生活性氧 (ROS) 分泌到体腔内, 并大大有助于杀死被吞噬的微生物7, 氮氧化物复合物氧化。
在成熟的初始步骤, 吞噬目前的标记通常如 Rab5 和 Rab7 的早期和晚期体分别与 v 型 atp 酶8的 v-0亚基。吞噬与溶酶体和晚期体的融合导致吞噬病原菌暴露于多种水解酵素, 如蛋白酶蛋白酶、脂肪酶和β-乳糖9。对这些酶的活化也需要管腔的酸化。例如, 蛋白酶 D 的裂解产生活性的短形式是 pH 依赖性的10。这些酶降解病原体, 并调解由巨噬细胞主要组织相容性复合物 (MHC) II 类分子向 T 细胞提出的病原体衍生短肽的产生, 以触发自适应免疫应答11。
因此, 体成熟对先天免疫反应至关重要, 并与免疫系统的先天和适应性武器联系在一起。这并不奇怪, 病原体已经进化的战略, 以克服由巨噬细胞通过上述的体成熟的过程。例如, 胞内细菌结核分枝杆菌和军团肺通过抑制 v atp 酶的组装和相应的流明酸化, 防止体成熟,12,13.其他细菌如李斯特菌或志贺氏杆菌福氏诱导体膜中的孔隙形成, 以逃逸到胞14,15。另一方面,沙门氏菌 enterica螺旋体鼠伤寒杆菌 (S。沙门氏菌)能够修改液泡内体的属性, 将其转换为其复制16的合适位置。此功能使S.沙门氏菌是研究病原体介导的体成熟干预的一个非常有趣的模型。
S. 鼠伤寒是一种在人类中引起胃肠炎的兼胞内细菌。在侵入固有后, S.鼠伤寒杆菌快速检测和吞噬的巨噬细胞, 并包含在吞噬17。一些报告以前曾描述过S.沙门氏菌-包含吞噬目前的制造商为体和溶酶体18, 和其他研究发现体-溶融合阻止后, S.鼠伤寒病毒感染19。
最初, 体成熟于S.用免疫荧光显微镜对鼠伤寒杆菌感染进行了研究。在分离细菌的吞噬技术的发展使更准确的研究体的内容, 从 endosome 和溶标记。迄今为止, 用于分离细菌的吞噬的主要方法是蔗糖梯度的亚细胞分馏18,20。然而, 这种方法需要多个离心步骤, 可以造成机械损伤的吞噬, 可能会影响稳定的 phagosomal 组分 (蛋白质和血脂), 是费时。此外, 它还需要使用 ultracentrifuge: 一个专门的设备, 这是无法进入每个实验室。
最近, 一种新的方法已被用于分离细菌含有吞噬, 其中细菌病原体被标记为化 lipopetide (Lipobiotin), 后来提取使用亲和共轭磁珠21.我们提出了一种替代的补充方法, 标记细菌表面胺类大分子与 NHS-生物素后, 亲和共轭磁珠。该方法获得的吞噬在 endosome 和溶标记物中具有很高的丰富性, 可用于多种测定, 从蛋白质分析到学分析。此外, 它不需要专门的设备, 如超速。此外, 通过消除离心步骤, 吞噬的机械损伤和使用的时间都大大减少。这种方法可以很容易地适应隔离的吞噬含有其他细菌, 如革兰氏阳性的金黄色葡萄球菌, 也包括在这份手稿。总之, 此方法用于隔离S.含有吞噬的鼠伤寒杆菌是一种简单、cost-effective 且耗时较传统的蔗糖梯度分离法, 离心, 呈现高浓度的含菌吞噬。
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Protocol
所有涉及使用致病性的步骤 . 沙门氏菌 必须在 BSL-2 或更高的生物安全级别设施中进行。 S 的区域性和涂层 鼠伤寒, 以及骨髓源性巨噬细胞 (BMDMs) 的感染必须在层流罩下进行, 以防止污染。 S 的隔离含有吞噬的 鼠伤寒杆菌 可在任何 BSL-2 实验室的工作台上执行.
从小鼠体内提取骨髓, 将其分化成巨噬细胞, 是按照动物福利机构指南进行的, 并由北莱茵-伐国家自然机构批准,环境和消费者保护 [Landesamt f 和 #252; r Natur、Umwelt 和 Verbraucherschutz (LANUV) Nordrhein-Westfalen;文件编号: 84-02.05.40.14.082 和 84-02.04.2015. A443] 和科隆大学.
1. 培养 鼠伤寒杆菌
- 接种 沙门氏菌 (SL1344 菌株) 从一个单一的细菌菌落到5毫升的脑心灌注 (BHI) 汤使用细菌循环.
- 在37和 #176 的孵化箱中孵育细菌悬浮液; C. 一整夜摇晃.
- 在第二天, 将1毫升的细菌悬浮液转化为19毫升的 BHI 汤, 在圆锥烧瓶中孵育, 在37和 #176; C 在带震动的孵化器中.
- 监视 S. 用分光光度计测量 600 nm (od 600 ) 的光学密度 (od), 以 鼠伤寒杆菌 生长。大约每30分钟测量一次.
- OD 600 达到1.0 时, 从孵化箱中取出细菌悬浮液并将其转移到50毫升管中。离心机细菌在 5400 x g 为15分钟在4和 #176; C.
- 在10毫升无菌磷酸缓冲盐 (PBS) 中去除上清和重.
- 5400 x g 离心15分钟在4和 #176; C.
- 去除上清液, 重4.9 毫升无菌 PBS 中的细菌.
2。用琥珀酰亚胺-生物素/亲和-共轭磁珠的 S. 鼠伤寒杆菌涂层
- 添加100和 #181; L 10 毫克/毫升生物素连接解决方案 (nhs-生物素溶解在二甲基亚砜) 新鲜制备的细菌悬浮在上一步中准备。例如, 将5毫克的 NHS-生物素稀释为0.5 毫升的无菌亚砜。正确混合移多次.
- 将混合料分成五1.5 毫升的管子.
- 在室温 (RT) 的 thermoblock 上孵育2小时, 并在 350 rpm 时持续晃动.
- 在 RT 中离心管在 1.5万 x g 处10分钟并丢弃上清液.
- 重在1毫升的无菌 PBS, 离心在 1.5万 x g 10 分钟的 RT 和丢弃上清.
- 重复步骤2.5 两次, 以完全删除多余的生物素链接解决方案.
- 最后一次洗涤后, 重1毫升的无菌 PBS 中的颗粒.
- 传输100和 #181; 10 毫克/毫升亲和共轭磁珠解决方案成1.5 毫升管, 并留在磁性机架上5分钟.
- 用吸管取出溶剂, 从磁性齿条上取下亲和共轭磁珠溶液, 并在步骤2.7 中重1毫升的生物素涂层-细菌悬浮液.
- 在 RT 上的 thermoblock 上孵育1小时, 持续晃动 350 rpm.
- 将解决方案放在磁性机架上; 等待5分钟, 然后用吸管移除不附着在墙上的细菌 (将其放在标签为和 #34 的试管中; 涂细菌和 #34;)。附着在与磁体接触的管壁上的分数是生物素/亲和涂层细菌.
- 从1毫升的无菌 PBS 中取出含有标签细菌的重.
- 将其再次放置在磁性机架上, 等待5分钟, 然后使用吸管移除 PBS.
- 重复步骤2.13 和2.14 两次, 以删除所有未涂有亲和共轭磁珠的细菌.
- 最后一次洗涤后, 重500和 #181 中的涂布细菌, 并将管状菌和 #34 贴上标签; 涂层细菌和 #34;.
- 计数和 #34 的菌落形成单位 (cfu); 涂细菌和 #34; 和 #34; 涂层细菌和 #34; BHI 琼脂板上电镀系列稀释的解决方案。大约 2 x 10 8 cfu/毫升的涂层细菌是从20毫升的初始细菌悬浮与 OD 600 1.0。将涂膜细菌悬浮液保持在4和 #176; C 在第二天用于感染巨噬细胞.
3。感染 BDMDs
- 在同一天, 当细菌被涂上生物素和亲和共轭磁性珠子时, 盘子完全分化 BMDMs 22 在6厘米的菜肴中密度为 5 x 10 6 细胞每道.
- 在第二天, 离心涂层细菌悬浮在 1.5万 x g 为5分钟在4和 #176; C.
- 在罗斯威尔公园纪念研究所 (RPMI) 培养基中除去上清和重, 并辅以10% 胎牛血清 (FBS), 浓度为 10 x 10 6 cfu/毫升.
- 为了感染巨噬细胞在10的多样性, 去除培养基从 BMDMs 和增加5毫升涂层细菌悬浮准备。最佳的教学语言可以评估每一个细胞类型或实验目的的孤立吞噬.
- 在 RT 孵育10分钟以同步吞噬.
- 孵育在37和 #176; C 在 5% CO 2 孵化器为30分钟开始吞噬。其他细胞类型可能需要不同的孵化时间, 以确保细菌内部化.
- 从盘子中取出含有细菌的培养基, 用 RPMI 三次清洗细胞, 去除 non-internalized 细菌.
- 最后添加10毫升的 RPMI, 包含 10% FBS 和 50 #181; 庆大霉素杀死任何 non-phagocytized 细菌.
- 在37和 #176 中孵育感染的 BMDMs; C 与 5% CO 2 直到所需的时间点。所需的时间点必须根据所用的细菌和细胞类型和分析目的进行实验确定。为研究早期体-endosome 融合事件在 S. 沙门氏菌感染的 BMDMs, 30 分钟孵化建议。对于以后的事件的分析, 吞噬可以提取后2小时或 4 h 的孵化。长时间的巨噬细胞孵育与 S. 超过 24 h 的鼠伤寒导致巨噬细胞死亡。在体提取前扩大细胞内感染可能导致生物素分子的降解。然而, 我们并没有观察到24小时前涂层细菌中生物素的损失.
4。隔离 S. 沙门氏菌 -包含吞噬
- 准备所需的体隔离缓冲区 A (50 毫米管道, pH 值 7, 50 毫米氯化镁 2 , 5 mm EGTA), 加入糖 (德勤), 以最终浓度1毫米, 素 B 为最终10和 #181; M, 蛋白酶和磷酸酶抑制剂的浓度, 由制造商推荐.
注: 必须在使用前立即将素 B 添加到体隔离缓冲区 a 中。素 B 扰乱细胞骨架, 促进细胞膜破裂. - 在所需的时间点, 从受感染的细胞中取出培养基, 用不育的 PBS 加热到 RT.
- 添加750和 #181; phagosome 隔离缓冲每道菜, 在冰上孵育20分钟。在使用不同的单元格号时, 应按比例调整隔离缓冲区 A 的音量.
- 添加250和 #181; 体隔离缓冲器 B (50 毫米管, pH 7, 50 毫米氯化镁 2 , 5 毫米 EGTA, 220 毫米甘露醇, 和68毫米蔗糖)。岩石的板块, 以确保缓冲区达到整个表面的菜。在使用不同的单元格号时, 应按比例调整隔离缓冲区 B 的音量.
- 通过使用橡皮警察轻轻地刮掉盘子里的细胞, 然后把它们转移到 pre-chilled 1.5 毫升的管子上.
- 通过26G 针通过1毫升注射器至少15次 (一个愿望加上一个弹射的细胞悬浮计数作为一次) 的细胞悬浮。这足以释放 BMDMs 的胞浆含量。通过针的次数必须针对每个单元格类型进行优化.
- 将电池悬浮在磁性机架上, 等待5分钟。附着在磁体上的微粒是含有涂层的吞噬- S. 伤寒.悬浮液中含有其余的细胞成分.
- 将悬浮液转换为标记为和 #34 的1.5 毫升管; 胞和 #34;.
- 在1毫升的无菌 PBS 中, 从磁性机架上取下带有隔离吞噬的管, 并重它们.
- 将体悬浮在磁性机架上, 等待5分钟, 然后卸下 PBS.
- 重复步骤4.9 和4.10 以清洗隔离的 . 沙门氏菌 -包含吞噬.
- 最后删除 PBS 并重所需的缓冲区中的吞噬; 例如, 在 radioimmunoprecipitation 分析 (帕) 的缓冲液中进行蛋白质检测。大约50-200 和 #181; 根据本议定书的每个样本获得的蛋白质 g, 取决于细胞的初始数量和感染的莫伊.
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Representative Results
通过本议定书隔离含有细菌的吞噬, 需要将细菌的法作为第一步。因此, 我们评估了S.的有效性鼠伤寒杆菌法通过共聚焦显微镜分析 BMDMs 感染化 mCherry-S。沙门氏菌标记为 Cy5-Streptavidin。简言之, BMDMs 在本协议中与 mCherry-S一起被感染。沙门氏菌先前化, 但不与亲和共轭磁珠一起孵育。在37° c 的30分钟孵育后, 细胞用温热的 pbs 洗涤, 用4% 的甲醛固定在 RT 上20分钟. 通过广泛的 pbs 冲洗来停止固定。细胞然后化与3% 海卫一在 PBS 为5分钟在 RT. 感染的 BMDMs 然后孵育与 Cy5-Streptavidin 20 分钟在4° c。经过广泛的洗涤, 样品为分析准备了共焦显微镜 (图 1)。不是化 mCherry-S。鼠伤寒被用作阴性对照。Cy5-Streptavidin 的荧光信号仅在化 mCherry-S中观察到。沙门氏菌, 确认法的细菌是成功的。以 "60X O2 钠: 1.40" 为目标, 在共聚焦显微镜下进行显微分析。荧光的激发波长为 405 nm (DAPI)、559 nm (mCherry) 和 635 nm (Cy5), PMT 电压分别设为574v、565v 和443v。
因为在巨噬细胞中由S触发的免疫应答。沙门氏菌主要依赖于由细菌配体激活的巨噬细胞表面受体, 接下来我们将测试是否有S的涂层。用生物素和亲和共轭磁珠的鼠伤寒沙门氏菌可以改变感染 BMDMs 的先天免疫应答。我们首先评估了是否覆盖了S。沙门氏菌可以通过共聚焦显微镜改变 BMDMs 的吞噬能力。BMDMs 在本协议中与 mCherry-S中描述的一样受到感染。生物素和亲和-共轭磁珠或未涂覆的 mCherry-S的鼠伤寒杆菌。沙门氏菌。在37° c 孵育30分钟后, 细胞用温热的 PBS 洗涤, 用4% 的甲醛固定在 RT 上20分钟。经过对 PBS 的广泛冲洗, 样品进行了共聚焦显微镜分析。如图 2所示, 巨噬细胞吞噬涂层和未涂布的 mCherry-S。沙门氏菌同样。
接下来, 我们分析了由S触发的炎症反应。鼠伤寒涂有生物素和亲和共轭磁珠 (图 3)。清从 BMDMs 感染的涂层和未涂布的S.在 24 h 感染后收集了 interleukin-6 (IL-6) 的酶联免疫吸附试验 (ELISA). S的涂层。鼠伤寒与生物素和亲和共轭磁珠没有显着改变炎症反应的巨噬细胞。
为了评估使用此协议获得的含菌吞噬的纯度, 我们分析了孤立的 mCherry-S。沙门氏菌-包含吞噬的免疫。通过对 mCherry 标记使用特定的抗体, 我们发现显着丰富的 mCherry 表达的S。在隔离的吞噬中鼠伤寒杆菌与从同一样本中获得的胞浆分数比较 (图 4)。包含 mCherry 的独立吞噬- S。以前未涂有生物素的鼠伤寒杆菌被用作阴性对照。这些结果表明, 该协议允许纯化的吞噬, 是高度丰富的细菌。
接下来, 我们对包含S的独立吞噬中的 endosome 和溶标记进行了免疫分析。沙门氏菌(图 5)。大多数的 endosome 和溶标记都清楚地观察到在吞噬孤立的 4 h 感染相比, 30 分钟。对内涵标记物 Rab5 和 Rab7 的富集以及溶标记物 v atp 酶 (v0和 v1亚基) 和蛋白酶 D 进行了观察。有趣的是, 只有蛋白酶 D 的裂解形式在孤立吞噬在4小时感染观察。pro-cathepsin D (48 kDa) 的裂解产生短的活动形式 (33 kDa) 只发生在吞噬, 但不是在胞, 表明该议定书的特殊性体隔离。
由于细胞器中的标记物, 如线粒体或内质网 (ER), 往往被发现在准备细菌包含孤立吞噬, S。用特异抗体对线粒体转运体 Tomm20 和 ER 蛋白 calnexin (图 6) 对含有分离吞噬的鼠伤寒杆菌进行了探讨。我们还测试了他们与抗酵解酶 GAPDH 抗体, 以评估胞浆污染的孤立吞噬。我们在S中发现了线粒体和 ER 标记。沙门氏菌-隔离吞噬但无胞浆污染。
为了研究含菌吞噬的分离方法的通用性, 将生物素和亲和-共轭磁珠包衣工艺应用于革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌。使用相同的固定和染色协议, 如 mCherry-S所述。沙门氏菌(图 1) 我们确认了绿色荧光蛋白 (GFP) 表达的成功法-金黄色葡萄球菌(图 7)。此外, 我们检测 endosome 标记 Rab7 和溶标记物 v atp 酶 (v0亚基) 和蛋白酶 D 的免疫分析分离的 GFP-S. 金黄色葡萄球菌-包含吞噬 (图 8)。蛋白酶 D 的卵裂为其成熟的形式, 只有在 4 h 感染后, 在孤立的体样本, 而不是在胞浆的分数检测。被隔离的金黄色葡萄球菌-含吞噬无胞浆污染, 如免疫 GAPDH 所示。
总之, 我们已经证明, 我们的体隔离协议能够分离高浓度的含菌吞噬, 不受胞浆污染。分离的体制剂可用于 endosome 和溶标记物的分析研究。gosome 成熟。此外, 该协议还可用于革兰氏阴性菌和革兰氏阳性细菌, 且标记程序不会改变巨噬细胞的免疫应答。
图 1: 化的荧光显微镜分析S 沙门氏菌使用 Cy5-Streptavidin.BMDMs 感染了30分钟的 mCherry-S。化 ("化 S。T."), 如本协议所述。不是化 mCherry-S。沙门氏菌("非化S。T")被用作负控制。在对细胞进行固定和性后, 用 Cy5-Streptavidin 在4° c 下孵育20分钟的样品。来自细胞核的荧光信号 (DAPI), mCherry-S.用共聚焦显微镜分析了鼠伤寒杆菌和 Cy5-Streptavidin。Cy5-Streptavidin 的信号只能在以前用生物素标记的细菌中检测到, 从而确认有效的法。缩放栏 = 10 µm.请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 感染 mCherry 的 BMDMs 的显微分析-S。鼠伤寒涂有生物素和亲和共轭磁性珠子.BMDMs 被感染的 mCherry-S. 鼠伤寒标记与生物素和亲和共轭磁珠如本协议所述。在允许巨噬细胞吞噬细菌30分钟后, 在 RT 中用4% 甲醛固定20分钟。用共焦显微镜分析了巨噬细胞吞噬的涂层细菌。分析表明, 摄入的涂层细菌 ("涂层S.T.)与未标记的 mCherry 细菌的摄入量相媲美 ("不包覆的S.T.), 证明用生物素和亲和共轭磁性珠子标记不会改变吞噬的S。由巨噬细胞沙门氏菌。细胞核用 DAPI 染色, 用于显微可视化。数据显示为平均± S.E.M., 使用学生t测试计算的统计意义表示为 * = p和 #60; 0.05;** = p和 #60; 0.01;= p和 #60; 0.001。缩放栏 = 40 µm.请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: IL-6 分泌的 BMDMs 感染生物素和亲和共轭磁珠, 标记为S。与未标记的S相比, 鼠伤寒杆菌沙门氏菌.BMDMs 感染了S.沙门氏菌涂有生物素和亲和共轭磁珠, 如本协议所述。经过24小时的感染, 清收集, 以进一步分析 IL-6 分泌物 ELISA。清表单 BMDMs 感染了未涂布的S。沙门氏菌用作控件。通过涂层的S诱导 IL-6 分泌物。与未涂布的S相比,伤寒沙门氏菌没有显著差异。沙门氏菌。数据显示为平均± S.E.M., 使用学生 t 测试计算的统计意义表示为 * = p和 #60; 0.05;** = p和 #60; 0.01;= p和 #60; 0.001。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 隔离吞噬中的细菌富集.富 mCherry 标记的S.在30分钟和4小时感染后采集的孤立吞噬中, 与胞浆分数比较,鼠伤寒杆菌。β-肌动蛋白被用作加载控制。负控制是指使用未涂布的S隔离的吞噬。沙门氏菌在30分钟感染。如预期的那样, 使用未标记的 S 的体隔离的最终输出.沙门氏菌不存在大量的 mCherry 或β-肌动蛋白, 表明该协议的特殊性。每样µg 20 的蛋白质。请单击此处查看此图的较大版本.
图 5: 独立S中的 endosome 和溶标记的分析。鼠伤寒-包含吞噬.endosome 标记物的富集 Rab5 和 Rab7, 溶标记物 v atp 酶 (v0和 v1亚基) 和蛋白酶 D 在孤立的S中进行了分析。沙门氏菌-包含在感染30分钟和4小时后提取的吞噬。β-肌动蛋白被用作加载控制。每样µg 20 的蛋白质。请单击此处查看此图的较大版本.
图 6: 独立S中的线粒体、ER 和胞浆标记的分析。鼠伤寒-包含吞噬.胞浆标记 GAPDH、ER 标记 calnexin 和线粒体标记 Tomm20 在S.用免疫分析了30分钟和 4 h 感染吞噬分离的鼠伤寒杆菌, 并与相应的胞浆组分进行了比较。每样载有20µg 蛋白。请单击此处查看此图的较大版本.
图 7: GFP-金黄色葡萄球菌感染巨噬细胞的显微分析.BMDMs 感染了S。金黄色葡萄球菌表达绿色荧光蛋白 (GFP) 标记为 with 生物素在标记S.的方法中描述沙门氏菌。在允许巨噬细胞吞噬细菌30分钟后, 它们被固定。未涂布的金黄色葡萄球菌("非化s。A.")被用作负控制。在对细胞进行固定和性后, 用 Cy5-Streptavidin 在4° c 下孵育20分钟的样品。来自细胞核的荧光信号 (DAPI), GFP-S。金黄色葡萄球菌和 Cy5-Streptavidin 的共聚焦显微镜分析。来自 Cy5-Streptavidin 的信号只能在以前用生物素标记的细菌中看到, 确认有效的法。缩放栏 = 10 µm.请单击此处查看此图的较大版本.
图 8: 独立S中的 endosome 和溶标记的分析。金黄色葡萄球菌-包含吞噬.S. 免疫 phagosomal 标记 Rab5、Rab7 和 v-atp 酶与相应的胞浆分数相比较, 对含有 30 min、2 h 和 4 h 感染的吞噬进行了分析. 每样载有20µg 蛋白。样本也测试了一个特定的抗体对 GAPDH, 证明孤立的S。含有吞噬的金黄色葡萄球菌无胞浆污染。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
用于隔离S的新方法本文介绍了用生物素和亲和-共轭磁珠吞噬细菌的方法. 在细胞膜的轻微破坏后, 含有细菌的吞噬可以很容易地用磁性齿条来提取。我们表明, 细菌的标记保留了病原体诱导炎症的能力, 不会改变宿主细胞的吞噬特性。重要的是, 这种方法获得的吞噬丰富的细菌和 endosome/溶标记和缺乏胞浆污染。
与传统的采用蔗糖梯度分离法的体分离方法相比, 该方法具有一些优点。它消除了耗时的多重离心步骤, 使研究员可以更少的时间处理更多的样品, 并通过方便地增加洗涤步骤的数量获得纯度体样品。使用此协议消除了对专用和敏感设备 (如离心) 的需要。高速离心法可以改变囊泡的特性, 降低最终产率22, 这在本协议中是避免的。我们还演示了S的涂层沙门氏菌与生物素和亲和共轭磁珠不改变吞噬能力的巨噬细胞。此外, 感染了标记为S的巨噬细胞诱导 IL-6。与未标记细菌感染的巨噬细胞相比,鼠伤寒是不变的。因此, 涂层的S.鼠伤寒杆菌的致病性没有引起明显的变化。对我们的知识, 涂层的S.沙门氏菌不代表使用隔离吞噬进行任何常见实验室分析技术的障碍。
S. 鼠伤寒杆菌-包含的吞噬被这种方法所分离的细菌和目前典型的内涵和溶酶体标记, 如 v atp 亚基 v0和 v1和裂解成熟蛋白酶蛋白酶 D, 只能在孤立的体分数中检测到。另外, 我们在孤立的 S 中发现了线粒体和 ER 标记.沙门氏菌-包含吞噬。吞噬与 er 的相互作用已被广泛研究, 尽管吞噬病原体中 er 的蛋白质含量可能与研究的病原体和细胞类型不同。例如, 包含从非吞噬分离的布鲁氏菌流产的吞噬富含 ER 标记23 , 但不是从巨噬细胞24中分离出来的。以前在 S 中检测到 Calnexin .用蔗糖梯度分离的鼠伤寒吞噬18。与惰性珠含吞噬和线粒体的密切相互作用也先前报告了25, 解释了 Tomm20 在隔离吞噬中的存在。在含有L. 肺26或分枝杆菌27的孤立吞噬中发现线粒体蛋白。然而, 利用蔗糖梯度离心法检测分离的病原体吞噬中的线粒体成分, 常被认为是由于该细胞器的相似密度和包含体的病原体, 因此, 不28。我们的方法避免了这样的污染问题, 并提供了更可靠的信息, 表明线粒体膜可能与 phagosomal 膜混合。综上所述, 由于寄主细胞类型和病原体的不同, 在病原体的分离吞噬制剂中很难避免 ER 和线粒体标记。推荐的方法, 以验证纯度的隔离吞噬是使用标记细菌和特定标记抗体检测细菌的西方印迹。我们还表明, 这种隔离方法可以适应其他微生物与可用的表面胺基团, 可以化。例如, 我们成功地应用了我们的协议来隔离含有吞噬的金黄色葡萄球菌。使用此协议隔离的包含S. 金黄色葡萄球菌的吞噬在溶和 endosome 标记中富集, 如 v atp 酶 (v0亚基) 和 Rab7, 但不呈现胞浆标记, 如 GAPDH。
内涵/phagosomal 囊泡为病原体的降解提供了独特的环境, 但保留了用于信号自适应免疫系统的抗原。虽然, 吞噬和成熟的过程已被广泛调查, 体的微环境, 在托管各种病原体仍然难以捉摸。还不清楚细胞代谢变化如何改变体的成熟及其含量。因此, 这里详述的协议提供了更多的机会来研究体生物及其在各种病症背景下的功能。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
在罗宾逊实验室的研究得到了来自科隆卓越集团的资助, 这是关于衰老相关疾病的细胞应激反应的支持, 德国科隆大学 (CECAD; 由 DFG 在德国联邦的卓越主动性之内资助和州政府) 和赠款从德意志 Forschungsgemeinschaft (SFB 670), 科隆财富和玛丽亚-Pesch 基金会的德国科隆大学。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EZ-Link NHS Biotin | Thermo Fisher Scientific | 20217 | |
| FluidMag Streptavidin | Chemicell | 4205 | |
| PIPES | Carl Roth | 9156.2 | |
| MgCl2 | Carl Roth | A537.4 | |
| EGTA | Carl Roth | 3054.3 | |
| Sucrose | Carl Roth | 4621.1 | |
| Mannitol | Carl Roth | 4175.1 | |
| DTT | Sigma | 43816 | |
| Halt Protease and Phosphatase inhibitor cocktail | Thermo Fisher Scientific | 1861280 | |
| Cytochalasin B | Sigma | C6762 | |
| DYNAL or DynaMag Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| SmartSpec 3000 Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2501 | |
| Bacterial loop (10µl) | Sarstedt | 86.1562.010 | |
| Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1344 | Leibniz Institute DSMZ-German collection of Microorganisms and Cell Cultures | ||
| RPMI | Biochrom | FG1415 | |
| PBS | Biochrom | L1825 | |
| Cy5-streptavidin | Invitrogen | SA1011 | |
| anti-beta-actin antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-47778 | |
| anti-mCherry antibody | Thermo Fisher Scientific | PA5-34974 | |
| anti-Rab5 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-46692 | |
| anti-Rab7 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-10764 | |
| anti-v-ATPase (V0) antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-28801 | |
| anti-v-ATPase (V1) antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-20943 | |
| anti-cathepsin D antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-6486 | |
| anti-Tomm20 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-17764 | |
| anti-calnexin antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-46669 | |
| anti-GAPDH antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-20357 |
References
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