Summary
CAEBV 患者から NK と T 細胞クローンを取得するための簡単な方法は、IL-2 の低用量末梢血の少量と高効率開発されました。
Abstract
リンパ腫またはリンパ増殖性症候群の患者から NK/T 細胞ラインを確立する記述されていた方法の数。これらのメソッドは、フィーダー細胞、血液の限り 10 ml 精製 NK または T 細胞または高用量 IL-2 の採用。本研究では、組換えヒト IL-2 (以上より 2)、添加と周辺機器を培養 T 細胞と NK 行血単核球 (PBMC) の確立する強力かつシンプルな戦略と手法を提案し、2 ml 全血の少しを使用しています。細胞は 2 週間で簡単に増殖できるし、3 ヶ月以上維持します。この方法では、高い成功率での 7 NK または T 細胞ラインが設けられています。このメソッドは、単純な信頼性、および CAEBV または NK/T 細胞リンパ腫のより多くのケースから細胞株を確立することに適用できます。
Introduction
エプスタインバー ウイルス (EBV) は、ユビキタスと感染 B 細胞だけでなく、T とナチュラル キラー (NK) 細胞、NK/T の eb ウイルス関連リンパ増殖性疾患 (LPD) とリンパ腫/白血病、eb ウイルス関連血球貪食などの原因となります。症候群、hydroa 水疱症のようなリンパ腫、胃癌 NK/T 細胞リンパ腫、鼻型、アグレッシブ NK 細胞白血病1,2,3。これらの中では重度の慢性アクティブ EBV (SCAEBV) 疾患、東アジアを中心にインシデントであるし、EBV 感染 T または NK 細胞4,5,6,のクローン性増殖によって引き起こされる LPD にいえる7、伝染性単核症 (IM) に存在する明らかな免疫不全なし-高 eb ウイルス DNA と同様に、持続的または反復的に, 発熱やみ、リンパ節腫脹、肝機能障害を含む症状でロードのような末梢血8,9。CAEBV 患者は、予後10,11, とその病因を持ち、EBV の役割は明確。したがって、細胞由来の NK/T の eb ウイルス関連リンパ増殖性疾患、悪性リンパ腫は、白血病の発生率が高いと NK または T 細胞の増殖との関係を誘発する eb ウイルスの機構解明細胞モデルとして非常に役に立つかリンパ腫。
日には、さまざまなテクニック12,13,14,15,16のいくつかの細胞株が設けられています。人間 NK 細胞ライン、NK-イースは、NK 細胞リンパ腫/白血病からフィーダーと 20U mL15あたりの濃度以上より 2 の存在下で、マウス間質細胞ラインと共培養によって設立されました。KAI3 は厳しい蚊刺アレルギー患者または自家リンパ芽球様細胞株 (LCL) と SCAEBV から別に樹立 NK 細胞フィーダー細胞と 100U/mL16以上より 2 の追加として、eb ウイルスによる B 細胞。SNK6 と SNT8 は、以上より 2 (700U/mL)12の高用量を追加することによって鼻 NK/T 細胞リンパ腫患者の腫瘍組織から派生しました。同様の手法で SNK 1 セルから CAEBV 患者の PBMC 培養 T 細胞を除去して 700U/mL 以上より 213,17を追加します。SNT13 と SNT15 は、cd 4 + および cd 8 + 細胞18の取り外しによって設立されました。これまでのところ、EBV-NK/T LPD 患者から他の T 細胞と NK の細胞株は、すべてこのメソッド19開発されました。
上記の既存の方法の欠点は、ためにクリニックでは非常に挑戦的な高用量 IL-2 や NK/T 細胞の浄化、限り 10 mL 全血の使用率の要件フィーダー細胞の雇用を含めるどの種類の細胞その EBV 潜伏を確認の必要性は、文化を始める前に感染します。主にアジアの子供たちに発生する CAEBV と、10 mL の血液はすべての地域で取得する容易ではないです。本研究では、フィーダー細胞せず rhIL2 の低用量と血中の 2 mL の量を使って CAEBV 患者 PBMC を培養 NK および/または T 細胞ラインを確立する高い成功率を持つ新しい単純なメソッドを開発しました。このメソッドの結果は、その高い効率性と時間の節約を証明しています。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
本研究は、遺伝学研究所・発生生物学、中国科学院の倫理委員会によって承認され、プロトコル人間福祉機関のガイドラインに従います。
メモ: ワークフローの模式図の図 1を参照してください。
1. CAEBV 患者の PBMC の分離
- 勾配 (例えば、Ficoll プラーク) による CAEBV 患者の全血の 2 mL からプライマリ PBMC を浄化する遠心分離の製造元の指示に従います。また、雪解けは RPMI 1640 培地と液体窒素から PBMC を凍結しました。
- 細胞を染色し、細胞カウンター プレートに懸濁液を転送細胞の濃度と自動化された細胞カウンターと生存率を測定 3 分待つ、18 μ L 細胞懸濁液 2 μ L のトリパン ブルー色素 (0.4%) を追加します。
- 2-3 × 106セル/mL の 20% ひと血清 (56 ° C で不活化熱)、2 mM L-グルタミンを含む完全な RPMI 1640 培養液を添加した密度の細胞懸濁液を準備、抗生物質 (100 μ g/mL ストレプトマイシン、100 U/mL ペニシリン)。24 ウェルの細胞培養皿によくあたり PBMC を懸濁液の 1 mL の種子。
- ウェルあたり 150 U 以上より 2 を追加します。
- 37 ° C で 5% CO2インキュベーターで培養皿を配置します。
- 2 日目、(200 倍); 顕微鏡下で細胞の形態を観察します。明るく丸い細胞が行き届いています。
2. 細胞および実行可能なセルを番号の拡大
- (200 倍)、顕微鏡下で細胞の形態を観察し、媒体を変更する前に、セルの番号付けによって細胞の成長の条件を監視: 18 μ L 細胞懸濁液にトリパン ブルー (0.4%) の 2 μ L を追加し、セルの濃度を計算 (1.2、参照してください図 2)。
- 24 ウェル プレート中の 500 μ L を破棄し、500 μ L の新鮮な完全な文化媒体を追加します。ウェルあたり 150U 以上より 2 を追加します。
- ステップ 2.2 のように週に 2 回媒体を変更します。
- 細胞成長曲線 (図 3) を描画します。
- 実行可能な細胞の濃度が 5 × 106/mL を超えたら、各ウェルに 1-2 × 106セル/ml の濃度で新しい井戸にセルを分割します。このプロセスは 2-4 週間かかります。
3. 細胞のフローサイトメトリーによる表現型解析
- セルが展開されている場合は、細胞の表現型を決定する 1 × 106細胞を収集します。遠心分離機の部屋の温度で 5 分間 240 x g細胞 (NK/T 細胞を管の下部に沈殿させる)。
- 7 mL の PBS を追加することによって降水量を洗い、上澄みを廃棄します。常温 240 x gで 5 分間遠心します。もう一度繰り返します。
- 各管に 200 μ L の血清を追加、よく混合し、室温で 10 分間インキュベートします。
- 室温で 5 分間 240 x g で細胞を遠心します。上澄みを廃棄し、再 1 × 106/mL と冷たい PBSA (PBS+0.2%BSA) で細胞を中断します。5 チューブ、各チューブ 2 × 105セルを含むセルに分割します。
- 4 ° C で 5 分間 240 × g で遠心分離細胞上澄みを廃棄し、再 PBSA バッファーまたは PBSA 10 μ L PE (または PE Cy7) を含むセルを中断し、10 μ L FITC 標識抗体は、図 4で示されるように氷の上の T または NK の細胞の細胞の受容体を染色します。PBSA バッファーで中断のセルは、ネガティブ コントロールとして使用されます。
- 暗闇の中で氷の上の 20-30 分のための抗体を持つ細胞を孵化させなさい。
- 冷たい PBSA で二回セルを洗浄して、300 μ L で細胞を再停止冷たい PBSA。
- 流れの cytometer 細胞表現型を分析します。
- 「ワークシートを作成する」の状態での流れの Cytometer を設定します。側方散乱 (SSC) 対前方散乱 (FSC) を表示するドット プロットを持つ実験的テンプレートを設定します。
- FSC と SSC の電圧を最適化するアイソタイプ コントロール チューブをロードし、興味のセル人口を妨げることがなくゴミを除去するために FSC のしきい値値を最適化します。FSC、SSC、FITC、PE と PE Cy7 以外のすべてのパラメーターを削除します。
- 各 2 カラー解析グループにおけるアイソタイプ コントロールと 1 つの肯定的な制御を用いる補正を実行します。
- サンプルを読み込むし、HLA-DR 対 CD19、セルの異なる人口を示す CD4 対 CD8、CD56 対 CD16、CD3 対 CD16 のドット プロットを作成します。
注: PBMC 負/アイソタイプ コントロールと 1 つの肯定的な制御を使用して補正を行うに使用されました。流れの cytometer で 2 色を蛍光抗体法は、表面マーカーの発現を分析する日常的に使用されました。次の抗体が含まれている: 抗 CD19 PE Cy7 と共役、フィコエ リスリン (PE) と共役 CD3 抗 CD16 かに (FITC)、抗 CD8 抗 CD56 共役抗 CD4 抗 HLA-DR。
4. 拡大と NK/T 細胞の凍結保存
- 細胞表現型解析が完了したときは、メディアを変更します。慎重に上澄みの半分を削除し、プレートの底で細胞を触れないでください。セル板に 300 U/mL 以上より 2 を含む新鮮な培地の同じボリュームを追加します。
- 培地の半分を変更するセルまで (2.2) として 3 日ごとクラスターは、(図 2) 顕微鏡の下ではっきりと見える。通常、このプロセスは 2-3 週間かかります。
- 同じ系統の別の井戸を混合後 24 ウェルのプレートからコート t25 フラスコ培養フラスコにセルを転送します。培地量二重媒体のボリュームまで黄色に変わり、10-15 mL に展開します。150 U/mL の濃度以上より 2 を追加します。
- 成長し、2-3 週間後に固定する前に中の 24 時間を変更するときセル質量を肉眼で観察できます。細胞カウンター細胞濃度を測定します。
- 240 x g で 5 分間細胞懸濁液を遠心し、再 5 10 106セル/mL 90% 牛胎児血清と 10% ジメチルスルホキシド (DMSO) を含む冷凍原液で倍の密度で細胞ペレットを中断します。-80 ° C に毎分 1 ° C の割合で凍結し、液体窒素に直接転送。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
3 日間は、細胞株の確立の間に文化、多形性細胞 (図 2) が表示されますを開始します。7 日後セルにつれてすぐに数と細胞の生存率が高い (図 3) で増加しています。細胞の小さなクラスターが成長、細胞濃度を超えることは 3-6 × 106時 10-14 日後明確に表示されます。この期間で細胞培養プレートの分割 2 つまたは 3 つの井戸拡張する必要があります。一ヶ月後、一度セル数に達すると 3-5 × 107カウントは保全のために十分に高い。
もう一つの重要な問題は、細胞が正常に培養されているとき表現型を決定します。我々 の結果はセルにつれ 3 ヶ月以上良好な状態で T (L196) と NK (M296) 細胞を (図 4)、上記の方法で培養することができ、この手法と細胞株の確立でしたを示します。
図 1: ワークフローの略図。最初の日に凝固血は PBMC が分離・ 150U/mL 以上より 2 の 20% 血清を含む 1640 培地で培養し、CAEBV 患者から採取しました。NK/T 細胞は 5% CO2の存在下で 37 ° C で栽培されました。2-4 週間培養後、細胞は、すぐに成長し始めた。濃度が 5 × 106 /mL を超えたら、我々 は 2 × 106の濃度で 2-3 井戸にセルを分割しました。2-3 週間の文化を継続し、セル 24 ウェル プレートからに移った T25 フラスコ細胞塊が顕微鏡の下ではっきりと見える。凍結細胞の場合、細胞質量を肉眼で観察できます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 培養過程で細胞の形態学的変化します。細胞培養、指定された日数の間、観察されました。3-7 日後明らかに多形性細胞 (先のとがった矢印) され、顕微鏡の下で目に見える細胞は 7-14 日培養後迅速に成長し始めた。光学顕微鏡観察の元の倍率は 200 倍だったこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 細胞増殖の成長曲線します。培養 7 日後細胞(A)急速に成長し始めたと高い生存率(B)。細胞の濃度と生存率は、次の手順で自動化された細胞カウンターにより測定した: 18 μ の汚損のため細胞を懸濁液にトリパン ブルー (0.4%) の 2 μ L を追加、3 分待って、携帯カウンター プレートに懸濁液を転送、測定セルの濃度と自動化された細胞カウンターと細胞生存率。誤差範囲は、3 つのレプリカの標準偏差です。L196、Z290、M296、L311、4 セル行の名前です。成長曲線を測定開始の集中は約 3 × 106です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 代表的な細胞株 L196 および M296 のフローサイトメトリー解析のための戦略をゲートします。PBMC は、FSC と SSC の電圧を調整するために使用されました。ライブおよび単一リンパ球のクラスターは FSC と SSC のプロットで P1 のゲートだった。アイソタイプ コントロールと 1 つの肯定的なコントロールは、補正を実行する使用されました。共役 2 色蛍光抗体染色の 4 つのペアは、表面マーカーの発現を分析する使用されました。抗 CD3、抗 cd4 抗体および抗 CD8 T 細胞の検出に使用されたに対し、抗 HLA-DR と抗 CD19 は B 細胞の検出に使用されました。抗 CD16 とアンチ CD56 は、NK 細胞を定義する使用されました。(A) L196 の表現型は CD19-HLA-DR + CD16-CD56 + CD3 + cd 4 + cd 8 +、主要な細胞のタイプは cd8。(B) M296 は CD19-HLA-DR + CD16 + CD56 + CD3-CD4-cd 8 +、主要な細胞のタイプは CD16 + CD56 +。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
このプロトコルでは NK/T CAEBV 患者の全血から細胞を確立するための新たな手法を開発しました。既存の手法と比較して, この方法の主要な利点はそのシンプルさとその要件への血液の量が少ないの高い成功率と細胞生存率の良い条件を発揮します。さらに、eb ウイルスの定量法として、事前に潜伏感染細胞の種類消費より多くの血液と培養開始前に、の時間を考慮せず PBMC を培養 NK/T 細胞株を確立できます。また、細胞を分析して細胞ライン設立後フローサイトメトリーによる細胞の異なった表現型を浄化することが。その上、メソッドは以上より 2 の低用量を使用し、フィーダー細胞を必要としません。この方法で 8 CAEBV 患者から 7 細胞を開発し、1 ヶ月内でそれらを凍結しました。細胞ラインに開発されていないものは生きている重要な増殖なし 5 ヶ月以上維持することができ、この背後にある理由は、さらに調査を必要があります。
細胞の成長は、以前レポート20,21; と一致している遺伝子組換えヒト IL-2 の存在に厳密に依存する必要があります。ない人間の IL-2 と 3 週間で細胞が死にます。明らかに、IL-2 の高品質は、培養細胞の増殖能力を決定する要因は、まだ明らかにする必要がありますが細胞の増殖に不可欠です。必要な IL-2 の投与量は異なる細胞間で変数、たとえば、50 u/mL は M296 の増殖を維持するために申し分ないです。しかし、NK/T 細胞株を確立するための最も経済的かつ信頼性の高い濃度はありません; 研究で提示されています。確かに、150 U/mL での成功のために十分です。
細胞培養、細胞の成長に影響を与える要素のこのプロセスでは、プライマリ PBMC の生存率が最も重要です。成功を確保するため、PBMC を可能な限り新鮮な必要があります。確かに、細胞濃度、培養に成功に影響を与える重要な要因、しきい値の値が 10 よりも低くする必要がありますしたがって5 mL あたり。サンプルから分離された細胞数が 10 未満の場合6、適切な細胞濃度を維持するためにミニもセル板を用いたは初期文化の代替選択肢です。さらに、我々 は22では以前報告した PBMC を豊かにする溶血反応を使用する場合 NK と T 細胞ラインを末梢血の量を制限も確立でした。プロトコルに従って、ひと血清は別文化の先頭に細胞の生存にとって重要な要素です。ウシ胎児血清で存在しないかどうか、T ・ NK 細胞の増殖に必要な血清にいくつかの未知の成分が存在することが推測された.
メソッドの 2 つの制限があります。Eb ウイルス感染 NK または T どのように、なぜ細胞の生体内でNK/T 細胞の成長と増殖の体外、メカニズムおよび使用できる電池の種類など、まず、ありますこの方法についていくつかの疑問のセルラインに設立一人の患者。メソッドによって決定されていない、セルの種類および純度、コントロールできないけれども、これらの要因は EBV 感染患者の細胞に依存しているかもしれません。このプロトコルでは、このメソッドが 1 つのタイプを優先的に文化ないけど NK 細胞を細胞株に確立でした。それにもかかわらず、これらの細胞の支配的なグループがあります。第二に、NK と T 細胞クローンの LPD と患者から報告があったまたは NK/T リンパ腫は、いくつかのヶ月17他維持することができる間、細胞へ確立できます。本研究で得られた細胞は 3 カ月以上も増殖できる、ただしかどうか彼らが無限に増殖を検証する必要があります。
要約すると、このメソッドを使用して、血の限られた量とフィーダー細胞なし IL-2 の低用量 CAEBV または NK/T リンパ腫細胞株より多くを簡単に取得できます。これらの細胞は、NK/T 細胞における eb ウイルス持続性の研究に貢献して eb ウイルスの病因には、白血病やリンパ腫が関連付けられています。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
D.Z. と X.Z.、X.C.、共同発明者に NK/T 細胞と本研究で確立された細胞株を確立するためのこの方法の潜在的な用途をカバーする特許出願中。D.Z.、X.Z.、および X.C. は、この仕事の金融利害関係を宣言しません。残りの著者は、彼らは競合する金銭的な利益があるを宣言します。
Acknowledgments
この仕事だった中国の国立科学財団 (から科学 (KFZD-SW-205)、戦略的な生物資源技術支援システムの中国科学アカデミー (CZBZX-1、ZSSB-004) の中国アカデミーのキーのプロジェクトによっておよび補助金によってサポートされて81401640) 上海自然科学基金 (14ZR1434800)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hu HLA-DR FITC | BD | 560944 | antibody for FACS |
| Hu CD4 FITC | BD | 555346 | antibody for FACS |
| Hu/NHP CD8 PE | BD | 557086 | antibody for FACS |
| Hu CD3 PE | BD | 555340 | antibody for FACS |
| Hu CD16 FITC 3G8 | BD | 555406 | antibody for FACS |
| Hu/NHP CD56 PE MY31 | BD | 556647 | antibody for FACS |
| hu/CD19 PE-Cy7 | BD | 560728 | antibody for FACS |
| human IL-2 | Roche | 11147528001 | |
| human serum | MRC | CCC118-125 | |
| CO2 incubator | SANYO | ||
| Centrifuge | Techcomp | CT6T | Centrifugation |
| microscope | OLYMPUS CKX53 | CKX53 | |
| Automated Cell Counter | Countstar | IC 1000 | For cell counting |
| 24 well cell culture cluster | Corning Incorporated | 3524 | Polystyrene plates |
| 25cm2 cell culture flask | Nest | 707001 | Polystyrene |
| FBS | Gibco | 10270 | Component of cell medium |
| RPMI Medium 1640 | life | 22400089 | For cell medium |
| L-Glutamine | Amresco | 374 | Component of cell medium |
| 100 x streptomycin penicillin solution BioRoYeeBRY-2309 | BioRoYee | BRY-2309 | Component of cell medium |
| Ficoll paque plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | For in vitro isolation of lymphocyte |
| DMSO | Sigma | D2650 | For freezing cells |
| flow cytometer | BD | BD FACSAria II | |
| soft ware | BD | BD FACSDiva soft ware | FACS analysis |
References
- Cohen, J. I. Epstein-Barr virus infection. N Engl J Med. 343 (7), 481-492 (2000).
- Cohen, J. I., Kimura, H., Nakamura, S., Ko, Y. H., Jaffe, E. S. Epstein-Barr virus-associated lymphoproliferative disease in non-immunocompromised hosts: a status report and summary of an international meeting, 8-9 September 2008. Ann Oncol. 20 (9), 1472-1482 (2009).
- Oshimi, K. Progress in understanding and managing natural killer-cell malignancies. Br J Haematol. 139 (4), 532-544 (2007).
- Kawa, K., et al. Mosquito allergy and Epstein-Barr virus-associated T/natural killer-cell lymphoproliferative disease. Blood. 98 (10), 3173-3174 (2001).
- Kimura, H. Pathogenesis of chronic active Epstein-Barr virus infection: is this an infectious disease, lymphoproliferative disorder, or immunodeficiency? Rev Med Virol. 16 (4), 251-261 (2006).
- Kimura, H., et al. Clinical and virologic characteristics of chronic active Epstein-Barr virus infection. Blood. 98 (2), 280-286 (2001).
- Ohshima, K., et al. Proposed categorization of pathological states of EBV-associated T/natural killer-cell lymphoproliferative disorder (LPD) in children and young adults: overlap with chronic active EBV infection and infantile fulminant EBV T-LPD. Pathol Int. 58 (4), 209-217 (2008).
- Okano, M. Overview and problematic standpoints of severe chronic active Epstein-Barr virus infection syndrome. Crit Rev Oncol Hematol. 44 (3), 273-282 (2002).
- Straus, S. E. The chronic mononucleosis syndrome. J Infect Dis. 157 (3), 405-412 (1988).
- Jones, J. F., et al. T-cell lymphomas containing Epstein-Barr viral DNA in patients with chronic Epstein-Barr virus infections. N Engl J Med. 318 (12), 733-741 (1988).
- Kikuta, H., et al. Epstein-Barr virus genome-positive T lymphocytes in a boy with chronic active EBV infection associated with Kawasaki-like disease. Nature. 333 (6172), 455-457 (1988).
- Nagata, H., et al. Characterization of novel natural killer (NK)-cell and gammadelta T-cell lines established from primary lesions of nasal T/NK-cell lymphomas associated with the Epstein-Barr virus. Blood. 97 (3), 708-713 (2001).
- Nagata, H., et al. Presence of natural killer-cell clones with variable proliferative capacity in chronic active Epstein-Barr virus infection. Pathol Int. 51 (10), 778-785 (2001).
- Tabata, N., et al. Hydroa vacciniforme-like lymphomatoid papulosis in a Japanese child: a new subset. J Am Acad Dermatol. 32 (2 Pt 2), 378-381 (1995).
- Tsuchiyama, J., et al. Characterization of a novel human natural killer-cell line (NK-YS) established from natural killer cell lymphoma/leukemia associated with Epstein-Barr virus infection. Blood. 92 (4), 1374-1383 (1998).
- Tsuge, I., et al. Characterization of Epstein-Barr virus (EBV)-infected natural killer (NK) cell proliferation in patients with severe mosquito allergy; establishment of an IL-2-dependent NK-like cell line. Clin Exp Immunol. 115 (3), 385-392 (1999).
- Zhang, Y., et al. Common cytological and cytogenetic features of Epstein-Barr virus (EBV)-positive natural killer (NK) cells and cell lines derived from patients with nasal T/NK-cell lymphomas, chronic active EBV infection and hydroa vacciniforme-like eruptions. Br J Haematol. 121 (5), 805-814 (2003).
- Oyoshi, M. K., et al. Preferential expansion of Vgamma9-JgammaP/Vdelta2-Jdelta3 gammadelta T cells in nasal T-cell lymphoma and chronic active Epstein-Barr virus infection. Am J Pathol. 162 (5), 1629-1638 (2003).
- Imadome, K., et al. Novel mouse xenograft models reveal a critical role of CD4+ T cells in the proliferation of EBV-infected T and NK cells. PLoS Pathog. 7 (10), e1002326 (2011).
- Shibuya, A., Nagayoshi, K., Nakamura, K., Nakauchi, H. Lymphokine requirement for the generation of natural killer cells from CD34+ hematopoietic progenitor cells. Blood. 85 (12), 3538-3546 (1995).
- Spits, H., Yssel, H. Cloning of Human T and Natural Killer Cells. Methods. 9 (3), 416-421 (1996).
- Liu, X., Xu, C., Duan, Z. A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines. J Vis Exp. (119), (2017).
- Kawabe, S., et al. Application of flow cytometric in situ hybridization assay to Epstein-Barr virus-associated T/natural killer cell lymphoproliferative diseases. Cancer Sci. 103 (8), 1481-1488 (2012).
