Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Эффективной и простой метод для установления линии Т-клеток у больных с хроническим активный вирус Эпштейна - Барр инфекции и НК

8.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/56515

⸱

30 марта 2018 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 

В этой статье

Краткое содержание

С высокой эффективностью, небольшое количество периферической крови и низкодозированные Ил-2 был разработан простой метод для получения клоны Т-клеток и NK CAEBV больных.

Аннотация

Ряд методов были описаны установить НК/T клеточных линий от пациентов с лимфомой или лимфопролиферативных синдромом. Эти методы подачи клетки, очищенный НК или T клетки как 10 мл крови или высок дозы Ил-2. Это исследование представляет новый метод с мощной и простой стратегии учредить Т-клеток и NK линии путем культивирования периферической крови мононуклеаров (КСДОР) с добавлением рекомбинантный человеческий Ил-2 (rhIL-2) и использует как маленькое как 2 мл цельной крови. Клетки могут размножаться быстро в две недели и поддерживаться более 3 месяцев. С помощью этого метода были созданы 7 НК или Т-клеток линии с высокий уровень успеха. Этот метод является простым, надежным и применимым к созданию линии клетки от больше случаев CAEBV или НК/Т-клеточной лимфомы.

Введение

Вирус Эпштейна - Барр (EBV) повсеместно и заражает не только B-клетки, но также T и природных убийца (НК) клетки, что приводит ряд связанных EBV НК/T лимфопролиферативных заболеваний (LPD) и лимфома/лейкоз, например EBV-связанные гемофагоцитный лимфогистиоцитоз, hydroa vacciniforme как лимфома, экстранодальных НК/Т-клеточной лимфомы, носовой тип и агрессивным NK клеток лейкемии1,2,3. Среди них заболевание тяжелой хронической активных EBV (SCAEBV), который является инцидент, главным образом в Восточной Азии, и которая теперь считается LPD, вызванные клоновых расширения EBV-инф....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Это исследование был одобрен Комитетом по этике Института генетики и биологии развития, Китайская академия наук, и протокол следует институциональных руководящих принципов для благополучия человека.

Примечание: На рисунке 1 приведена схема рабочего процесса.

1. изоляция КСДОР от больных CAEBV

  1. Очистить первичной КСДОР от 2 мл цельной крови больных CAEBV градиент (например, Ficoll доска) центрифугирования следуя инструкциям производителя. Кроме того оттепель криоконсервированных КСДОР из жидкого азота с RPMI 1640 среднего.
  2. Добавить 2 мкл Трипановый синий (0....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

После 3 дней культуры во время создания клеточных линий, полиморфные клетки начинают появляться (рис. 2). После 7 дней клетки растут быстро, увеличением числа и жизнеспособность клеток на высокой скорости (рис. 3). После 10-14 дней, растет, когда концентрация клеток может превышать 3-6 × 106четко видны небольшие кластеры клеток. В этот период клетки должен быть расширен путем разделения на два или три скважины плиты ку.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этом протоколе был разработан Роман технику для создания НК/T клеточных линий из цельной крови больных CAEBV. По сравнению с существующими методами, основным преимуществом данного метода является его простота и его требование лишь небольшого количества крови, в то время как оно exhibits высокий уровень успеха и хорошие условия жизнеспособности клеток. Кроме того НК/T клеточных линий может устанавливаться путем культивирования КСДОР без определения типов клеток EBV латентно инфицированных заранее, как определение будет .......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

D.Z., X.Z. и X.C. являются совместное изобретателей на патентных заявок, охватывающих потенциального использования данного метода для установления НК/T линии клеток и клеточных линий, установленных в настоящем исследовании. D.Z., X.Z. и X.C. объявить не конкурирующих финансовых интересов в этой работе. Остальные авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана ключ проектов Китайской академии наук (KFZD-SW-205), стратегические биологических ресурсов технологии системы поддержки Китайской академии наук (CZBZX-1 и ZSSB-004) и субсидии от национального фонда науки Китая ( 81401640) и Шанхае фонда естественных наук (14ZR1434800).

....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Антитела Hu HLA-DR FITCBDантитела для FACS
Hu CD4 FITCBD555346антитела для FACS
Hu/NHP CD8 PEBD557086антитела для FACS
Hu CD3 PEBD555340антитела для FACS
Hu CD16 FITC 3G8BD555406антитела для FACS
Hu/NHP CD56 PE MY31BD556647антитело для FACS
hu/CD19 PE-Cy7BD560728антитело для FACS
человека IL-2Roche11147528001
сыворотки крови человекаMRCCCC118-125
CO2SANYO
CentrifugeTechcompCT6TЦентрифугационный
микроскопOLYMPUS CKX53CKX53
Автоматизированный счетчик клетокCountstarIC 1000Для подсчета клеток
24 лунки кластер клеточных культурCorning Incorporated3524Полистирольные пластины
25см2 колба для клеточной культурыГнездо707001Полистирол
FBSGibco10270Компонент клеточной среды
RPMI Medium 1640срок службы22400089Для клеточной среды
L-глутаминAmresco374Компонент клеточной среды
100 x стрептомицина пенициллина раствор BioRoYeeBRY-2309BioRoYeeBRY-2309Компонент клеточной среды
Ficoll paque plusGE Healthcare17-1440-03Для выделения in vitro лимфоцитов
DMSO SigmaD2650Для замораживания клеток
проточный цитометрBDBD FACSAria II
программная посудаBDBD FACSДива программная посудаFACS анализ
560944 инкубатор

Ссылки

  1. Cohen, J. I. Epstein-Barr virus infection. N Engl J Med. 343 (7), 481-492 (2000).
  2. Cohen, J. I., Kimura, H., Nakamura, S., Ko, Y. H., Jaffe, E. S. Epstein-Barr virus-associated lymphoproliferative disease in non-immunocompro....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Линии NK T-клетокхроническая активная EBV-инфекциямононуклеарные клетки периферической кровирекомбинантный интерлейкин-2 человека (IL-2)анализ методом проточной цитометрииградиентное центрифугированиеподдержание клеточных культуропределение фенотипамониторинг пролиферации клетокметод криоконсервации