Summary
С высокой эффективностью, небольшое количество периферической крови и низкодозированные Ил-2 был разработан простой метод для получения клоны Т-клеток и NK CAEBV больных.
Abstract
Ряд методов были описаны установить НК/T клеточных линий от пациентов с лимфомой или лимфопролиферативных синдромом. Эти методы подачи клетки, очищенный НК или T клетки как 10 мл крови или высок дозы Ил-2. Это исследование представляет новый метод с мощной и простой стратегии учредить Т-клеток и NK линии путем культивирования периферической крови мононуклеаров (КСДОР) с добавлением рекомбинантный человеческий Ил-2 (rhIL-2) и использует как маленькое как 2 мл цельной крови. Клетки могут размножаться быстро в две недели и поддерживаться более 3 месяцев. С помощью этого метода были созданы 7 НК или Т-клеток линии с высокий уровень успеха. Этот метод является простым, надежным и применимым к созданию линии клетки от больше случаев CAEBV или НК/Т-клеточной лимфомы.
Introduction
Вирус Эпштейна - Барр (EBV) повсеместно и заражает не только B-клетки, но также T и природных убийца (НК) клетки, что приводит ряд связанных EBV НК/T лимфопролиферативных заболеваний (LPD) и лимфома/лейкоз, например EBV-связанные гемофагоцитный лимфогистиоцитоз, hydroa vacciniforme как лимфома, экстранодальных НК/Т-клеточной лимфомы, носовой тип и агрессивным NK клеток лейкемии1,2,3. Среди них заболевание тяжелой хронической активных EBV (SCAEBV), который является инцидент, главным образом в Восточной Азии, и которая теперь считается LPD, вызванные клоновых расширения EBV-инфицированных T или NK клеток4,5,6, 7, но без очевидной иммунодефицита присутствует в инфекционный мононуклеоз (IM)-как симптомы, включая лихорадку, гепатоспленомегалия, лимфаденопатия и дисфункции печени постоянно или периодически, а также высокой EBV-ДНК загрузки в периферической крови8,9. У пациентов с CAEBV плохой прогноз10,11и его патогенез и роль EBV является неясным. Таким образом, мобильных линий, полученных от связанных EBV НК/T лимфопролиферативных заболеваний и лимфом очень полезны как ячейки модели для разъяснения механизма EBV индуцированной НК или Т-клеток распространения и его отношения с высоким уровнем заболеваемости лейкемией или лимфомы.
На сегодняшний день, были созданы несколько клеточных линий с различными методами12,13,14,,1516. Человеческой линии клеток НК, НК-YS, был создан от НК лимфома/лейкоз, совместного культивирования с линией стромальные клетки мыши как фидер и в присутствии rhIL-2 в концентрации 20U за15мл. KAI3 был другой NK клеток линии от больных с тяжелой комаров аллергии или SCAEBV с аутологичной лимфобластоидных клеток линии (LCL), клетки B, преобразованная EBV, как клетки фидера и добавление rhIL-216100У/мл. SNK6 и SNT8 были получены от опухоли тканей носа НК/T клеток больных лимфомами, добавив высок дозы rhIL-2 (700U/мл)12. С подобную технику SNK-1 клетка был от CAEBV больных, культивированный от КСДОР, удалив Т-клеток и добавив 700U/мл rhIL-213,17. SNT13 и SNT15 были созданы путем удаления CD4 + и CD8 + клетки18. Пока другие Т-клеток и NK клеточных линий от EBV-НК/T LPD пациентов были разработаны с этот метод19.
Недостатки существующих методов, упомянутых выше включают занятости клетки фидера, требование высок дозы IL-2, использования как 10 мл цельной крови или очистки НК/Т-клеток, что является весьма сложной в клинике из-за необходимость проверки, какие типы мобильных что EBV латентно заражает перед началом к культуре. Как CAEBV в основном происходит в детей в Азии, 10 мл крови не является легко приобрести во всех регионах. В этом исследовании мы разработали новый простой метод с высокий уровень успеха установить НК и/или Т-клеток линии путем культивирования КСДОР от CAEBV больных с использованием низких доз rhIL2 и объемом 2 мл цельной крови без клетки фидера. Результаты этого метода доказали свою высокую эффективность и экономия времени.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Это исследование был одобрен Комитетом по этике Института генетики и биологии развития, Китайская академия наук, и протокол следует институциональных руководящих принципов для благополучия человека.
Примечание: На рисунке 1 приведена схема рабочего процесса.
1. изоляция КСДОР от больных CAEBV
- Очистить первичной КСДОР от 2 мл цельной крови больных CAEBV градиент (например, Ficoll доска) центрифугирования следуя инструкциям производителя. Кроме того оттепель криоконсервированных КСДОР из жидкого азота с RPMI 1640 среднего.
- Добавить 2 мкл Трипановый синий (0,4%) 18 мкл суспензии клеток, ждать 3 мин запятнать клетки, передачи подвеска к плите счетчиков клеток и измерения концентрации клеток и жизнеспособности с счетчиком автоматизированной клеток.
- Готовят суспензию клеток на 2-3 × 106 клеток/мл дополнена полной RPMI 1640 питательной среды, содержащие 20% сыворотки крови человека (инактивированная на 56 ° C тепла), 2 мм L-глютамином, плотности и антибиотики (100 мкг/мл стрептомицин, пенициллин 100 ед/мл). 1 мл суспензии КСДОР за хорошо семян в 24-ну клетки культуры пластин.
- Добавьте 150 U rhIL-2 на хорошо.
- Поместите пластины для культуры в 5% CO2 инкубатора 37 ° c.
- На 2 день наблюдать морфологию клеток под микроскопом (200 крат); клетки находятся в хорошем состоянии, когда они яркие и круглые.
2. расширение нумерация жизнеспособных клеток и клеток
- Наблюдать за морфологии клеток под микроскопом (увеличение Х 200) и контролировать состояние клеточного роста, Нумерация ячеек перед изменением средних: 2 мкл Трипановый синий (0,4%), до 18 мкл суспензии клеток и рассчитать концентрации клеток (см. 1.2, Рисунок 2).
- Отменить 500 мкл среды в пластине 24-Ну и добавить 500 мкл свежие полной питательной среды. Добавьте 150U rhIL-2 на хорошо.
- Изменения среды дважды в неделю, как в шаге 2.2.
- Нарисуйте кривую роста клеток (рис. 3).
- Когда концентрация жизнеспособных клеток превышает 5 × 106/мл, делят клеток на новые скважины в концентрации 1-2 × 106 клеток/мл в каждую лунку. Этот процесс занимает 2-4 недели.
3. клетки фенотипирование подачей Cytometry
- Когда клетки расширили, соберите 1 × 106 клеток для определения фенотипов клеточных линий. Центрифуга клетки на 240 x g 5 мин при комнатной температуре (НК/T-клетки будет выпадать в осадок в нижней части трубки).
- Отбросить супернатанта, мыть осадков, добавляя 7 мл PBS. Центрифуги для 5 мин на 240 x g при комнатной температуре. Повторите один раз.
- Добавить 200 мкл человеческой сыворотки в каждую пробирку, хорошо перемешать и проинкубируйте втечение 10 мин при комнатной температуре.
- Центрифуга клетки на 240 x g 5 мин при комнатной температуре. Отменить супернатант и вновь приостановить клетки на 1 × 106/мл с холодной PBSA (PBS+0.2%BSA). Разделите ячейки 5 трубок, каждая трубка, содержащая 2 × 105 клеток.
- Центрифуга клетки на 240 x g 5 мин при 4 ° C. Отменить супернатант и вновь приостановить клетки с PBSA буфер или PBSA, содержащие 10 мкл PE (или PE-Cy7) и 10 мкл FITC помечены антител к пятно рецепторы клеток T или NK клеток на льду, как указано на рисунке 4. Клетки, приостановлена с буфером PBSA используются в качестве отрицательного контроля.
- Инкубируйте клетки с антител для 20-30 мин на льду в темноте.
- Вымыть клетки дважды с холодной PBSA, вновь приостановить клетки с 300 мкл холодной PBSA.
- Анализ фенотипа клетки с проточный цитометр.
- Настройка потока цитометр в состоянии «Создать таблицу». Создан экспериментальный шаблон с точкой сюжета, который отображает вперед точечной (FSC) против стороны точечной (SSC).
- Загрузить изотипа управления трубка для оптимизации FSC и SSC напряжений и оптимизировать FSC пороговое значение для ликвидации мусора без мешать с популяции клеток интерес. Удалите все параметры, кроме FSC, ККК, FITC, PE и пе-Cy7.
- Выполнение компенсации с использованием изотипа управления и один положительный контроль в каждой группе Анализ 2-цвета.
- Загрузить образцы и создать HLA-DR VS CD19, CD4 VS CD8, CD56 VS CD16 и CD3 VS CD16 точка участки, показаны различные популяция клеток.
Примечание: КСДОР были использованы для выполнения компенсации с помощью отрицательных/изотипа управления и один положительный. 2-цветные иммунофлюоресценции с проточный цитометр обычно использовался для анализа экспрессии поверхностных маркеров. Включены следующие антитела: анти HLA-DR, анти CD4, конъюгированных с флуоресцеин Изотиоцианаты (FITC), анти CD8, анти CD56 анти CD16, CD3, конъюгированных с фикоэритрин (PE) и анти CD19, конъюгированных с PE-Cy7.
4. расширение и криоконсервации клеток НК/T
- Изменение среднего по завершении анализ фенотипа клетки. Тщательно удалить половину супернатант и не прикасайтесь клетки в нижней части пластины. Добавьте такой же объем свежей питательной среды, содержащий 300 ед/мл rhIL-2 для пластин ячейки.
- Изменить половина среды каждые 3 дней (2.2) до ячейки кластеры отчетливо видны под микроскопом (рис. 2). Как правило этот процесс занимает 2-3 недели.
- Передать клетки от 24-ну пластины T25 культуры колбы после смешивания различных скважин по той же линии. Двойной объем питательной среды как она становится желтой до объема среды расширяется до 10-15 мл. Добавьте rhIL-2 с концентрацией 150 ед/мл.
- Изменение средних 24 ч до замораживания после 2-3 недели растет, когда ячейка массы можно наблюдать невооруженным глазом. Измерение концентрации клеток с счетчик соматических клеток.
- Центрифуга суспензию клеток для 5 мин на 240 x g и вновь приостановить Пелле клеток на плотности тарелок 5-10 x 106 клеток/мл с замороженных Стоковый раствор, который содержит плода бычьим сывороточным 90% и 10% диметилсульфоксид (ДМСО). Заморозить со скоростью 1 ° C / мин до-80 ° C, а затем передать непосредственно в жидкий азот.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
После 3 дней культуры во время создания клеточных линий, полиморфные клетки начинают появляться (рис. 2). После 7 дней клетки растут быстро, увеличением числа и жизнеспособность клеток на высокой скорости (рис. 3). После 10-14 дней, растет, когда концентрация клеток может превышать 3-6 × 106четко видны небольшие кластеры клеток. В этот период клетки должен быть расширен путем разделения на два или три скважины плиты культуры. Примерно месяц спустя после ячейку число достигает 3-5 × 107, граф является достаточно высоким для сохранения.
Еще одним важным вопросом является определение фенотипы, когда клетки были успешно культивировали. Наши результаты показывают, что T (L196) и (M296) клетки может быть культивировали методом, описанным выше (Рисунок 4), и клеточных линий может быть создан с этой техникой, как клетки вырос более чем на 3 месяца в хорошем состоянии.
Рисунок 1: Схематическое представление рабочего процесса. В первый день антикоагулянт кровь была собрана из CAEBV больных, то КСДОР были изолированы и культивируемых с 1640 носитель, содержащий 20% сыворотки крови человека и 150U/мл rhIL-2. НК/Т-клетки были выращены при 37 ° C в присутствии 5% CO2. После 2-4 недели культивирования клетки начали быстро расти. Когда концентрация превышает 5 × 10 6/мл, мы разделены 2-3 скважины в концентрации 2 × 106клеток. Продолжая культуры для 2-3 недели, клетки были переведены из 24-ну пластины в колбу T25 когда кластеры клеток были четко видны под микроскопом. Криоконсервации клеток когда ячейка массы можно наблюдать невооруженным глазом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: клеточные морфологические изменения в процессе культивирования. Клетки культивировали и наблюдается за указанное число дней. Полиморфные клетки (стрелки указывает) были видны под микроскопом ясно после 3-7 дней, и клетки начали быстро расти после 7-14 дней культуры. 200 X исходный масштаб для световой микроскопии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: кривые роста пролиферации клеток. После 7 дней культивирования, клетки начинают быстро расти (A) и с высокой жизнеспособности (B). Концентрация и жизнеспособности клетки были измеряется счетчиком автоматизированные ячейки с помощью следующей процедуры: 2 мкл Трипановый синий (0,4%), до 18 мкл суспензии клеток для окрашивания, подождите 3 минуты, передачи подвеска к плите счетчиков клеток и измерить клетки концентрация и жизнеспособность клеток с счетчиком автоматизированной клеток. Планки погрешностей являются стандартные отклонения трех реплик. L196, Z290, M296, L311 являются имена четырех клеточных линий. Начальная концентрация для измерения кривой роста составляет около 3 × 106. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: представитель стробирования стратегия для анализа потока цитометрии клеточных линий, L196 и M296. КСДОР были использованы для корректировки FSC и SSC напряжений. Кластер лимфоцитов живой и один был закрытого для P1 в FSC и SSC сюжет. Isotype управления и единого позитивные элементы были использованы для выполнения компенсации. Четыре пары 2-цветный иммунофлюоресценции конъюгированных Пятнать антитела были использованы для анализа экспрессии поверхностных маркеров. Анти-HLA-DR и анти CD19 были использованы для выявления клетки B, тогда как анти CD3, анти CD4 и CD8 анти были использованы для выявления Т-клеток. Анти-CD16 и анти CD56 были использованы для определения НК-клеток. (A) является фенотипом L196 CD19-HLA-DR + CD16-CD56 + CD3 + CD4 + CD8 +, тип основной ячейки является CD8 +. (B) M296 является CD19-HLA-DR + CD16 + CD56 + CD3-CD4-CD8 +, тип основной ячейки является CD16 + CD56 +. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом протоколе был разработан Роман технику для создания НК/T клеточных линий из цельной крови больных CAEBV. По сравнению с существующими методами, основным преимуществом данного метода является его простота и его требование лишь небольшого количества крови, в то время как оно exhibits высокий уровень успеха и хорошие условия жизнеспособности клеток. Кроме того НК/T клеточных линий может устанавливаться путем культивирования КСДОР без определения типов клеток EBV латентно инфицированных заранее, как определение будет потреблять больше крови и время до культивирования. Кроме того линии клеток могут быть проанализированы и разные фенотипы клеток могут быть очищены с проточной цитометрии после создания линии клеток. Кроме того метод использует низкие дозы rhIL-2 и потребности не клетки фидера. С помощью этого метода мы разработали 7 клеточных линий от 8 CAEBV больных и замораживают их в течение месяца. Тот, который не был разработан в линию клеток может поддерживаться живым для более чем 5 месяцев без значительного распространения, и причины этого нуждаются в дальнейшем изучении.
Необходимо отметить, что рост клеток строго зависит от наличия рекомбинантный человеческий Ил-2, которая согласуется с предыдущих докладов20,21; с не человека IL-2 клетки умрут в 3 недели. Очевидно высокое качество Ил-2 имеет важное значение для пролиферации клеток, хотя факторы, которые определяют пролиферативный потенциал клеток в пробирке все еще необходимо прояснить. Доза IL-2 требуется переменная среди различных клеточных линий, например, 50У/мл удовлетворительным для поддержания распространения M296. Однако наиболее экономичным и надежным концентрации для установления линии клеток НК/T не была представлена в исследовании; действительно 150 ед/мл достаточно для успеха.
В этом процессе культивирования клеток, элементов, влияющих на рост клеток жизнеспособность первичных КСДОР является наиболее важным. Для обеспечения успеха, КСДОР должно быть как можно более свежей. Несомненно, концентрация клеток является одним из важных факторов, влияющих на успешное выращивание, поэтому пороговое значение должно быть не меньше, чем 105 мл. Если ячейке число изолированных от образца менее 106, используя мини-ну клеток пластины для поддержания адекватного клетки концентрация является альтернативный выбор в первоначальной культуре. Кроме того Т-клеток и NK линия может быть создан с даже ограниченное количество периферической крови при использовании гемолитический реакции обогатить КСДОР, как мы сообщали ранее,22. Как описано в протоколе, сыворотка крови человека является еще одним ключевым фактором для выживания клетки в начале культуры. Мы предположить, что некоторые неизвестные компоненты существуют в сыворотке крови, которые необходимы для пролиферации клеток T/НК и отсутствуют или другой в плода бычьим сывороточным.
Есть два ограничения метода. Во-первых, есть несколько вопросов без ответа об этом методе, такие как как и почему EBV заражает НК или T клетки в естественных условиях, механизмы НК/T клетки роста и распространения в пробирке, и какие типы клеток могут быть созданы в клеточных линиях в один пациент. Хотя мы не могли контролировать тип ячейки и чистоты, которые не определяются методом, эти факторы могут быть зависимым от клетки, EBV заражает пациентов. Этот протокол НК и T-клетки могут быть созданы в клеточных линий, хотя этот метод не может преференциально культуры одного типа. Тем не менее является доминирующей группой этих клеток. Во-вторых было сообщение, что Т-клеток и NK клоны от больных с LPD или НК/T лимфомы могут создаваться для клеточных линий, в то время как другие могут сохраняться в течение несколько месяцев17. Клетки, полученные в настоящем исследовании могут размножаться более 3 месяцев, однако ли они могут размножаться бесконечно должна быть проверена.
В резюме, используя этот метод можно легко получить больше клеточных линий от CAEBV или НК/T лимфом с ограниченное количество крови и низкодозированные Ил-2 без клетки фидера. Эти клеточные линии будет способствовать изучению EBV стойкости в НК/Т-клеток и патогенезе EBV связанные лейкемией или лимфомой.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
D.Z., X.Z. и X.C. являются совместное изобретателей на патентных заявок, охватывающих потенциального использования данного метода для установления НК/T линии клеток и клеточных линий, установленных в настоящем исследовании. D.Z., X.Z. и X.C. объявить не конкурирующих финансовых интересов в этой работе. Остальные авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана ключ проектов Китайской академии наук (KFZD-SW-205), стратегические биологических ресурсов технологии системы поддержки Китайской академии наук (CZBZX-1 и ZSSB-004) и субсидии от национального фонда науки Китая ( 81401640) и Шанхае фонда естественных наук (14ZR1434800).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hu HLA-DR FITC | BD | 560944 | antibody for FACS |
| Hu CD4 FITC | BD | 555346 | antibody for FACS |
| Hu/NHP CD8 PE | BD | 557086 | antibody for FACS |
| Hu CD3 PE | BD | 555340 | antibody for FACS |
| Hu CD16 FITC 3G8 | BD | 555406 | antibody for FACS |
| Hu/NHP CD56 PE MY31 | BD | 556647 | antibody for FACS |
| hu/CD19 PE-Cy7 | BD | 560728 | antibody for FACS |
| human IL-2 | Roche | 11147528001 | |
| human serum | MRC | CCC118-125 | |
| CO2 incubator | SANYO | ||
| Centrifuge | Techcomp | CT6T | Centrifugation |
| microscope | OLYMPUS CKX53 | CKX53 | |
| Automated Cell Counter | Countstar | IC 1000 | For cell counting |
| 24 well cell culture cluster | Corning Incorporated | 3524 | Polystyrene plates |
| 25cm2 cell culture flask | Nest | 707001 | Polystyrene |
| FBS | Gibco | 10270 | Component of cell medium |
| RPMI Medium 1640 | life | 22400089 | For cell medium |
| L-Glutamine | Amresco | 374 | Component of cell medium |
| 100 x streptomycin penicillin solution BioRoYeeBRY-2309 | BioRoYee | BRY-2309 | Component of cell medium |
| Ficoll paque plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | For in vitro isolation of lymphocyte |
| DMSO | Sigma | D2650 | For freezing cells |
| flow cytometer | BD | BD FACSAria II | |
| soft ware | BD | BD FACSDiva soft ware | FACS analysis |
References
- Cohen, J. I. Epstein-Barr virus infection. N Engl J Med. 343 (7), 481-492 (2000).
- Cohen, J. I., Kimura, H., Nakamura, S., Ko, Y. H., Jaffe, E. S. Epstein-Barr virus-associated lymphoproliferative disease in non-immunocompromised hosts: a status report and summary of an international meeting, 8-9 September 2008. Ann Oncol. 20 (9), 1472-1482 (2009).
- Oshimi, K. Progress in understanding and managing natural killer-cell malignancies. Br J Haematol. 139 (4), 532-544 (2007).
- Kawa, K., et al. Mosquito allergy and Epstein-Barr virus-associated T/natural killer-cell lymphoproliferative disease. Blood. 98 (10), 3173-3174 (2001).
- Kimura, H. Pathogenesis of chronic active Epstein-Barr virus infection: is this an infectious disease, lymphoproliferative disorder, or immunodeficiency? Rev Med Virol. 16 (4), 251-261 (2006).
- Kimura, H., et al. Clinical and virologic characteristics of chronic active Epstein-Barr virus infection. Blood. 98 (2), 280-286 (2001).
- Ohshima, K., et al. Proposed categorization of pathological states of EBV-associated T/natural killer-cell lymphoproliferative disorder (LPD) in children and young adults: overlap with chronic active EBV infection and infantile fulminant EBV T-LPD. Pathol Int. 58 (4), 209-217 (2008).
- Okano, M. Overview and problematic standpoints of severe chronic active Epstein-Barr virus infection syndrome. Crit Rev Oncol Hematol. 44 (3), 273-282 (2002).
- Straus, S. E. The chronic mononucleosis syndrome. J Infect Dis. 157 (3), 405-412 (1988).
- Jones, J. F., et al. T-cell lymphomas containing Epstein-Barr viral DNA in patients with chronic Epstein-Barr virus infections. N Engl J Med. 318 (12), 733-741 (1988).
- Kikuta, H., et al. Epstein-Barr virus genome-positive T lymphocytes in a boy with chronic active EBV infection associated with Kawasaki-like disease. Nature. 333 (6172), 455-457 (1988).
- Nagata, H., et al. Characterization of novel natural killer (NK)-cell and gammadelta T-cell lines established from primary lesions of nasal T/NK-cell lymphomas associated with the Epstein-Barr virus. Blood. 97 (3), 708-713 (2001).
- Nagata, H., et al. Presence of natural killer-cell clones with variable proliferative capacity in chronic active Epstein-Barr virus infection. Pathol Int. 51 (10), 778-785 (2001).
- Tabata, N., et al. Hydroa vacciniforme-like lymphomatoid papulosis in a Japanese child: a new subset. J Am Acad Dermatol. 32 (2 Pt 2), 378-381 (1995).
- Tsuchiyama, J., et al. Characterization of a novel human natural killer-cell line (NK-YS) established from natural killer cell lymphoma/leukemia associated with Epstein-Barr virus infection. Blood. 92 (4), 1374-1383 (1998).
- Tsuge, I., et al. Characterization of Epstein-Barr virus (EBV)-infected natural killer (NK) cell proliferation in patients with severe mosquito allergy; establishment of an IL-2-dependent NK-like cell line. Clin Exp Immunol. 115 (3), 385-392 (1999).
- Zhang, Y., et al. Common cytological and cytogenetic features of Epstein-Barr virus (EBV)-positive natural killer (NK) cells and cell lines derived from patients with nasal T/NK-cell lymphomas, chronic active EBV infection and hydroa vacciniforme-like eruptions. Br J Haematol. 121 (5), 805-814 (2003).
- Oyoshi, M. K., et al. Preferential expansion of Vgamma9-JgammaP/Vdelta2-Jdelta3 gammadelta T cells in nasal T-cell lymphoma and chronic active Epstein-Barr virus infection. Am J Pathol. 162 (5), 1629-1638 (2003).
- Imadome, K., et al. Novel mouse xenograft models reveal a critical role of CD4+ T cells in the proliferation of EBV-infected T and NK cells. PLoS Pathog. 7 (10), e1002326 (2011).
- Shibuya, A., Nagayoshi, K., Nakamura, K., Nakauchi, H. Lymphokine requirement for the generation of natural killer cells from CD34+ hematopoietic progenitor cells. Blood. 85 (12), 3538-3546 (1995).
- Spits, H., Yssel, H. Cloning of Human T and Natural Killer Cells. Methods. 9 (3), 416-421 (1996).
- Liu, X., Xu, C., Duan, Z. A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines. J Vis Exp. (119), (2017).
- Kawabe, S., et al. Application of flow cytometric in situ hybridization assay to Epstein-Barr virus-associated T/natural killer cell lymphoproliferative diseases. Cancer Sci. 103 (8), 1481-1488 (2012).
