Summary
Cette méthode permet la coloration sélective et quantification de l’ADN en gels en trempant le gel dans un SYBR Green I / Nitro tétrazolium bleu solution et puis exposer au soleil ou une source de lumière bleue. Cela produit un précipité visible et ne nécessite presque aucun équipement, ce qui est idéal pour utilisation sur le terrain.
Abstract
Méthodes de coloration de l’ADN sont très importants pour la recherche biomédicale. Nous avons conçu une méthode simple qui permet la visualisation de l’ADN à le œil nu par la formation d’un précipité de couleur. Il fonctionne en trempant l’acrylamide ou de gel agarose de l’ADN dans une solution de 1 x (équivalent à 2,0 µM) SYBR Green I (SG j’ai) et 0,20 mM nitrobleu de tétrazolium qui produit un violet précipiter de formazan lorsqu’ils sont exposés aux rayons du soleil ou plus précisément la lumière bleue. Aussi, récupération des tests ADN ont été effectuées en utilisant un plasmide ampicillin résistant dans un gel teinté avec notre méthode. Un plus grand nombre de colonies a été obtenu avec notre méthode qu’avec la traditionnelle coloration à l’aide de SG j’ai avec éclairage ultraviolet. La méthode décrite est rapide, précis et non toxique pour la détection de l’ADN, ce qui permet la visualisation des biomolécules à « l’oeil nu » sans un Transilluminateur et est peu coûteux et approprié pour l’utilisation sur le terrain. Pour ces raisons, notre ADN nouvelle coloration méthode a ses avantages potentiels pour la recherche et l’industrie.
Introduction
Avec les progrès de la biochimie et de biologie moléculaire, les études portant sur l’ADN ont exigé des meilleures techniques pour analyser l’ADN. La première méthode pour la coloration de l’ADN a été de coloration, qui est très sensible mais manque de sélectivité à l’argent et ne permet pas la récupération de l’échantillon. Plus tard, le développement de coloration fluorescente d’ADN a permis la quantification sélective de l’ADN avec la possibilité de récupération de l’échantillon. L’un des colorants fluorescents premières utilisées pour la quantification de l’ADN de bromure d’éthidium1, ce qui est mutagène2. Cependant, maintenant il y a des colorants fluorescents améliorés plus sécuritaires et plus sensibles, tels que GelRed et SYBR Green I (SG je)3; mais tous ces colorants fluorescents nécessitent l’utilisation d’un Transilluminateur UV de (UV) ou d’un fluorimètre.
Il existe des autres techniques de coloration visiblement ADN, tels que le bleu de méthylène4 et cristal violet5,6,7,8,9, mais tous d'entre eux souffrent de sensibilité réduite et sélectivité. Les sels de tétrazolium sont sensibles à la réduction des composés organiques et lorsque cela se produit, ils forment un insoluble et coloré de formazan précipiter10,11. Récemment, certains sels de tétrazolium bivalents ont démontré à lier à l’ADN en raison de leurs anneaux de tétrazolium positive12.
Dans une récente publication13a proposé une nouvelle technique visible pour souiller et de quantifier l’ADN en gels de polyacrylamide, en utilisant la réduction d’un sel de tétrazolium bivalent appelé nitrobleu de tétrazolium (NBT) et des colorants fluorescents comme le bromure d’éthidium, GelRed, SYBR Green I et SYBR Gold. Cette réaction a travaillé en présence de lumière bleue ou la lumière du soleil et a permis la récupération de l’échantillon en améliorant la qualité par rapport à l’usage du SG j’ai avec un Transilluminateur UV. L’objectif du présent document est de fournir un protocole détaillé de la technique de coloration à l’aide de tétrazolium sels.
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Protocol
1. préparation et exécution du Gel
- Préparer les gels de polyacrylamide gel de 12 % non-dénaturisation à l’aide de la recette de Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel électrophorèse (SDS-PAGE) trouvé dans Sambrook et Russell14 mais avec de l’eau au lieu de SDS.
- Pour préparer 5 mL de solution de gel, utiliser 1,7 mL d’eau distillée, 2 mL d’acrylamide/bis acrylamide (30/0,8 % m/v), 1,3 mL de 1,5 M Tris pH 8,8, 0,05 mL de persulfate d’ammonium 10 % et 0,002 mL de TEMED.
- Pour préparer 2 mL de gel de concentration utiliser 1,5 mL d’eau, 0,33 mL d’acrylamide/bis acrylamide (30/0,8 % m/v), 0,25 mL de 1 M Tris pH 6,8, 0,02 mL de persulfate d’ammonium 10 % et 0,002 mL de TEMED. Les dimensions du gel sont 7,3 cm x 8,2 cm x 0.075 cm (l x l x p).
Remarque : Utilisez un peigne bien 15 de 0,75 mm d’épaisseur pour la meilleure sensibilité.
- Verser les quantités appropriées de 6 x chargement mémoire tampon et l’échantillon d’ADN d’un tube de microtubes de 1,5 mL (par ex. utilisation 1 µL de tampon de charge 6 x à 5 µL de l’échantillon d’ADN).
- Placer le gel dans la chambre d’électrophorèse verticale.
- Remplir la chambre avec 750 mL de tampon de x TAE 1 pour exécuter 2 gels. Pour préparer 1 L de 50 x TAE, utilisez 442 g de base Tris, 57,1 mL d’acide acétique glacial et 100 mL de 0,5 M EDTA pH 8. Ajouter de l’eau distillée pour un volume final de 1 L.
- Charger les échantillons dans le gel. Exécutez le gel à 100 V pendant 2 h.
- Vous pouvez également préparer un gel d’agarose 1 x TAE à l’aide de la recette trouvée dans Sambrook14.
- Ajouter 300 mL de 1 x TAE à la chambre d’électrophorèse horizontale. Exécutez le gel pendant 45 min à 100 V.
2. NBT-SG j’ai coloration (Figure 1).
-
L’acrylamide Gel de coloration.
- Préparer les solutions : 0,1 % p/v NBT et 1,2 x SG j’ai.
Remarque : Il est possible d’utiliser du bromure d’éthidium, GelRed et SYBR Gold au lieu de SG j’ai, mais SG j’ai eu les meilleures performances. - Verser 16,75 mL de 1,2 x SYBR vert I solution dans un récipient de taille appropriée.
Remarque : Nous avons utilisé le couvercle d’une boîte de pointe de pipette en tant que conteneur, et ces volumes sont calculés pour couvrir le gel à l’aide de ce conteneur ; ses dimensions sont de 11,6 cm x 7,6 cm x 2,6 cm (l x l x p). - Placer le gel dans la solution. Ajouter 3,25 mL de solution à 0,1 % p/v NBT pour donner 0,2 mM NBT et 1 x (équivalent à 2,0 µM) SG j’ai concentrations finales.
- Fermer le récipient avec un film plastique et enrouler complètement le récipient avec du papier aluminium pour bloquer toute lumière ambiante.
Remarque : Le film plastique est utilisé pour éviter les éclaboussures et pour éviter une réaction de la feuille d’aluminium avec la solution colorante. - Agiter pendant 25 min dans un agitateur orbital à 60 tr/min.
- Enlever en aluminium et en plastique. Exposer au soleil pendant 90 min maximum. Vérifiez toutes les 5 min jusqu'à ce que la bande d’intérêt s’affiche.
- Pour utiliser la lumière bleue, préparer une protoboard avec 3 Diodes électroluminescentes (LED) et placer les LEDs 5 mm environ de la surface du gel (cocher la coloration en continu, comme le temps nécessaire dépend de l’intensité de la source lumineuse de LED).
- Préparer les solutions : 0,1 % p/v NBT et 1,2 x SG j’ai.
-
Gel d’agarose souillant.
- Après préparation et en cours d’exécution une agarose à 1 % gel comme décrit dans les sections 1.4 (les dimensions sont de 1 cm x 6,2 cm x 7 cm ; l x l x p), suivez les mêmes étapes que dans 2.1 avec ces modifications :
- Verser 41,9 mL de 1,2 x SG j’ai la solution dans le couvercle d’une boîte de pointe de pipette ; ses dimensions sont de 11,6 cm x 7,6 cm x 2,6 cm (l x l x p). Ajouter 8,1 mL de solution à 0,1 % NBT.
- Fermer le récipient avec un film plastique et puis complètement envelopper le contenant avec du papier aluminium pour bloquer toute lumière ambiante.
- Agiter pendant 1 h dans un agitateur orbital à 60 tr/min.
3. analyse.
-
NBT-SG j’ai des courbes d’étalonnage.
- Obtenir des images de gel par balayage à 1200 dpi.
- Logiciels pour l’analyse de l’image. Redresser les images à l’aide d’un éditeur d’image. Exécutez une densitométrie d’image.
- Calculer l’aire sous la courbe. Préparer un graphique du Signal/SignalMax contre la concentration de l’ADN.
4. ADN récupération.
- Préparer un gel d’agarose de 1 % à 1 x TAE à l’aide de la recette trouvée dans Sambrook14.
- Ajouter 300 mL de 1 x TAE à la chambre d’électrophorèse horizontale. Charger 4 µL de 100 plasmide de15 ng/µL pDJ100 et échelle d’ADN suivant le schéma donné à la Figure 2. Exécutez le gel pendant 1 h à 100 V.
- Marquer et peser les deux tubes de microcentrifuge de 2 mL.
- Coupent le gel par le milieu afin d’avoir les deux moitiés identiques. Chacun d’eux doit contenir l’échelle et le plasmide d’échantillon pour comparer les différentes techniques de coloration. Une représentation schématique est à la Figure 2.
- Colorer une moitié avec NBT-SG j’ai comme dans l’étape 2.
- Découpez la bande de plasmide à l’aide d’un scalpel propre. Enregistrer le morceau de gel dans un tube et peser.
- Tache de l’autre partie du gel avec SG j’ai avec 50 mL de 1 x SG j’ai solution et lentement agiter (60 t/mn) le gel pendant 1 h dans l’obscurité.
- Placer le gel sur une courte longueur d’onde et exposer pendant 2 min. coupe sur la bande de plasmide à l’aide d’un scalpel propre.
- Enregistrer le morceau de gel dans l’autre tube et peser.
Remarque : Le protocole peut être suspendu ici tout en gardant les tubes à-20 ° C.
- Procéder à l’extraction de plasmide utilisant un commercial gel extraction kit.
5. plasmide normalisation.
- Dans un tube de microtubes de 1,5 mL, ajouter 10 µL de l’extrait plasmide et 60 µL d’eau de type I. Mélanger et transférer dans une cuvette de quartz 60 µL ou utiliser 2 µL directement dans un Nanodrop.
- Mesurer les spectres d’absorption entre 230 à 320 nm. Calculer la concentration de plasmide de l’échantillon à l’aide de la formule suivante :
où D est le facteur de dilution (dans ce cas, c’est 70/10), Ax est l’absorption à x nm et 50 est le facteur de conversion en µg/mL pour le dsDNA. - Diluer les échantillons à 9,1 ng/µL.
- Transformer des cellules capables d' Escherichia coli (e. coli) (p. ex. XL10 or) suivant la Inoue transformation procédure16 avec 5 µL de l’échantillon dilué.
- Compter le nombre de colonies sur les boîtes de Pétri et notez la dilution. Calculer les unités formant colonie (UFC) avec la formule suivante17:
où D est le facteur de dilution appliqué de la culture initiale. - Effectuer un test t non apparié.
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Representative Results
Un précipité de formazan violets s’affiche où se trouve l’ADN (vérifié par spectrométrie de masse à13). Dans l’expérience, une échelle d’ADN a été chargée pour faire une courbe d’étalonnage (Figure 3). Le protocole fonctionne pour les gels d’acrylamide et de gel d’agarose, mais il a une plus faible intensité et prend plus de temps dans l’agarose. Cependant, l’utilisation de gels d’agarose permet la récupération de l’échantillon à l’aide d’un kit disponible dans le commerce, et elle n’interfère pas avec l’extraction. Les échantillons récupérés à l’aide de cette méthode par des LED bleues ont une meilleure qualité par rapport aux SG j’ai utiliser un Transilluminateur (Figure 4).
La figure 1. Analyse la coloration et la quantification d’ADN schématique de NBT-SG I. Les étapes sont : A. Ajout SG j’ai et les solutions NBT au gel. B. exposant le gel à la lumière du soleil ou lumière bleue. C. analyse du gel à 1200 dpi. D. analyse de l’image de gel par une traitement logiciel pour obtenir l’intensité de la bande de l’image. E. table à tracer les données dans une intensité contre le complot de la concentration. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 . Schématique du test de comparaison d’ADN récupération et intégrité. A. l’électrophorèse d’ADN de. B. gel de coupe en deux morceaux. C. la coloration avec les deux différentes méthodes de coloration (SG j’ai et NBT-SG j’ai). D. découpe de bande de l’ADN de plasmide. E. l’ADN gel procédure d’extraction à l’aide du kit d’extraction. F. quantification d’ADN par mesure de spectrophotométrie. G. normalisation de concentration ADN pour comparer les deux méthodes. H. la transformation bactérienne avec les échantillons après normalisation colonie I. dépouillement et analyse de données. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 . Courbe d’étalonnage de l’ADN à 1500 bp utilisant NBT-SG I: 12,5 % des gels de polyacrylamide chargé avec différentes concentrations d’échelle d’ADN. Gels ont été exécutés à 100 V pendant 2 h dans 1 x TAE. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 . Comparaison de l’efficacité de la transformation entre ADN visualisé avec SG I et un Transilluminateur et NBT-SG I: le plasmide pDJ100 a été chargé dans un gel d’agarose à 1 % et exécuté à 100 V pendant 1 h à 1 x TAE. Ensuite, le gel a été coupé en deux moitiés. La moitié était taché avec SG I et l’autre moitié du gel avec NBT-SG j’ai. La bande de plasmide a été ensuite extrait le gel à l’aide d’un gel extraction kit. Enfin, le plasmide extrait a été normalisé et servant à transformer les cellules compétentes d’Escherichia coli . Les transformations ont été effectuées de n = 3. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Un sensible et un roman basé sur l’ADN, méthode de coloration sur la réduction de NBT et l’utilisation de SG j’ai présenté dans cet article. L’étape critique dans le présent protocole est le temps d’incubation du gel dans le NBT-SG j’ai solution et la concentration de NBT. Le temps de coloration pour les gels d’agarose est plus long que pour les gels d’acrylamide en raison de la plus grande épaisseur de gels d’agarose. Cette méthode ne fonctionne pas bien en présence de SDS comme NBT précipite en contact avec elle. Si le gel obtient un fond violet, nous recommandons qu’un autre gel prêt et réduire le temps d’exposition à la lumière. Si un gel d’agarose est souillé et il n’y a pas assez de sensibilité, il est recommandé d’augmenter la durée de l’exposition à la lumière. Si il y a un manque de sensibilité et un précipité opalescent est présent dans le gel, cela pourrait être le résultat de la contamination de SDS. Dans ce cas, préparer un nouveau gel et le rincer avant d’ajouter les réactifs de coloration.
La précipitation se fait par un éclairage lumineux bleu, si fournis par la lumière d’une LED bleue ou la lumière bleue présente naturellement dans les rayons du soleil. Pour cette raison, une limitation de la technique est la source de lumière. S’il ne faut aucune source de lumière, une source de lumière bleue, et si la source lumineuse n’est pas homogène, il n’est pas possible de faire une comparaison, et pour la même raison, il n’est pas possible de faire de quantification. Toutefois, les résultats obtenus seront quelque peu dépendants de la source lumineuse utilisée. Si la source lumineuse n’est pas cohérente ou uniforme (p. ex. en raison de changements dans l’intensité de la lumière du soleil pendant la journée ou de la source de lumière bleue non homogènes), il sera plus difficile de des comparaisons directes ou la quantification des différents échantillons à différents fois.
Cette méthode n’a pas besoin des instruments spéciaux pour visualiser l’ADN, ce qui est idéal pour utilisation sur le terrain. Pour des résultats quantitatifs, on peut utiliser une caméra à haute résolution ou un scanner de bureau comme l’a montré dans ce travail.
Nous espérons étendre cette technique à l’avenir en les associant éventuellement à la coloration des autres biomolécules par l’utilisation de deux techniques de coloration différentes (p. ex. NBT-SG j’ai avec le bleu de Coomassie) dans le même gel.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par Fondo Nacional de Desarrollo y Científico Tecnológico (Fondecyt), Chili, 11130263 de projet (à la CW), projet CONICYT + NERC + Programa de Colaboración Internacional PCI-PII20150073 (pour CW) et U-inicia depuis le Vicerrectoría de Investigación Universidad de Chile (à CW).
Merci à Tatiana Naranjo-Palma de Majorque pour l’aider dans la phase initiale de ce projet, le Dr Jorge Babul et Diego Quiroga-Roger de discussion utile, Robert Lesch pour réviser le manuscrit et la Dirección de extensión de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas de Universidad de Chile. Merci aussi à Pérez de Marcelo pour éditer la vidéo et Neil Stevens pour corriger le texte et Errol Watson pour la fourniture de la voix-off.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nitro blue tetrazolium | Gold Biotechnology | 298-83-9 | reagent used in the staining |
| SYBR Green I 10000X | Thermo-Fisher | S7563 | reagent used in the staining |
| Gel extraction kit | QIAGEN | 28704 | used to extract plasmid from the gel in integrity assay |
| DNA ladder | Thermo-Fisher | SM 1331 | used to make calibration curves and as reference to cut band in integrity assay |
| Agar Agar | Merck | used to make LB-ampicillin culture plates | |
| sodium chloride | Merck | 1064045000 | used to make LB-ampicillin culture plates |
| yeast extract | Becton, Dickinson and Company | 212750 | used to make LB-ampicillin culture plates |
| peptone | Merck | 72161000 | used to make LB-ampicillin culture plates |
| TEMED | AMRESCO | 761 | used to make polyacrylamide gels |
| ammonium persulfate | Calbiochem | 2310 | used to make polyacrylamide gels |
| acrylamide | invitrogen | 15512-023 | used to make polyacrylamide gels |
| bisacrylamide | SIGMA | 146072 | used to make polyacrylamide gels |
| Tris-base | Merck | 1083821000 | used to make TAE buffer and non-denaturing polyacrylamide gel tris-HCl buffer |
| EDTA | J.T. Baker | 8993-01 | used to make TAE buffer |
| Acetic acid | Merck | 1,000,632,500 | used to make TAE buffer |
| agarose | Merck | 16802 | used to make TAE buffer |
| spectrophotometer | Tecan | infinite 200 pro | used to quantify DNA plasmid |
| water purificatiom unit | Merck | Elix 100 | use to make water type 1 (ASTM) used in spectrophotometry and DNA dilutions\ |
| distilled water | - | used in gels, culture medium, stainings and general solutions | |
| HCl | J.T. Baker | 9535-03 | used to make non-denaturing polyacrylamide gel tris-HCl buffer |
| 6X DNA loading dye | Thermo-Fisher | R0610 | |
| 5 mm Blue LED | Jinyuan electronics | SP-021 | light source used in integrity assay |
| protoboard | KANDH | KH102 | light source support and circuit |
| 9 V battery | Duracell | - | used to power the LED's |
| horizontal electrophoresis chamber | Biorad | 1704486EDU | used to make and run agarose gel in integrity assay |
| vertical electrophoresis kit | Biorad | 1658002EDU | used to run polyacrylamide gels in calibration curves |
| power supply | Biorad | 1645050 | used to power the electrophoresis |
References
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