Summary
نحن توضيح طريقة مستقيم إلى الأمام لاشتقاق مورين الضامة الأولية من خلايا نخاع العظام ويرتبط طريقة بسيطة لتحضير الأحماض الدهنية جيش صرب البوسنة. ثم نظهر أن الأحماض الدهنية المشبعة يمكن أن يستحث موت الخلايا بلعم، ومثل موت الخلايا يرتبط إيجابيا مع تراكم مستويات السيراميد الخلوية.
Abstract
أعرب الضامة عالية البروتين ملزمة الأحماض الدهنية البشرة والدهنية الأحماض الدهنية ملزمة البروتين. أنها نشاط امتصاص المشبعة والأحماض الدهنية غير المشبعة، والتي قد تلعب دوراً حاسما في تنظيم وظائفهم المناعية. وأظهرت العديد من الدراسات أن الأحماض الدهنية المختلفة، المشبعة أو غير المشبعة، قد تمتلك تأثيرات مختلفة على نمو الخلايا ووظيفتها. ومع ذلك، تختلف النهج المستخدمة لإعداد الأحماض الدهنية، التي قد تؤدي إلى نتائج غير الفسيولوجية. ألبومين المصل، ناقل طبيعي للأحماض الدهنية في الدم المحيطي الثدييات، يوصي بتشكيل المتقارن معقدة مع ملح الصوديوم للأحماض الدهنية دراسة وظيفة الأحماض الدهنية في خلايا الثدييات، وبالتالي تقليل سمية الصابون الأحماض الدهنية. وهكذا، بسيطة وسريعة نسبيا التدفئة وسونيكاتينج أسلوب تطوير والمقدمة هنا لتشكيل المتقارنة الأحماض الدهنية جيش صرب البوسنة. يمكننا وصف بروتوكول باستخدام الأحماض الدهنية المشبعة، لا سيما دهني الأحماض للحث على موت الخلايا الشديدة في الماوس نخاع العظام المستمدة الضامة. كذلك ندلل على أن موت الخلايا المستحثة بالأحماض الدهنية المشبعة يرتبط ارتباطاً إيجابيا بمستويات السيراميد الخلوية المتراكمة. ويمكن تمديد هذا الأسلوب للدراسات المتعلقة بتأثير الأحماض الدهنية في خلايا الثدييات الأخرى.
Introduction
الأحماض الدهنية تلعب دوراً حاسما في استقلاب الطاقة وفي تركيب غشاء فوسفوليبيدات في أنواع مختلفة من الخلايا. وقد الأحماض الدهنية انخفاض معدلي الذوبان مائي. إعداد مناسبة من الأحماض الدهنية ذات أهمية حاسمة لدراسة الوظائف البيولوجية للأحماض الدهنية في خلايا الثدييات. عندما يتم إعداد الأحماض الدهنية مع الإيثانول، الأحماض الدهنية عديدة قد تظهر آثارها السمية الصابون (المنظفات) على غشاء الخلية، حتى في تركيزات منخفضة نسبيا1. كالناقل الطبيعي، الرئيسية للأحماض الدهنية الحرة في المصل، يعتبر الزلال ناقل جيدة للأحماض الدهنية التسليم في المختبر للأحماض الدهنية الدالة فحوصات2،،من34. ومع ذلك، تفاصيل إعداد المتقارن الأحماض الدهنية والزلال عادة لا تتوفر حتى ولو تم نشر العديد من الأوراق البحثية باستخدام الأحماض الدهنية.
أعرب الضامة عالية البروتين ملزمة الأحماض الدهنية البشرة والدهنية الأحماض الدهنية ملزمة البروتين5،6،،من78. أنها نشاط امتصاص المشبعة والأحماض الدهنية غير المشبعة التي قد تنظم على وظائف المناعة. لدراسة تأثير الأحماض الدهنية في الضامة، والخلايا الأخرى، كانت أساليب مختلفة لإعداد الأحماض الدهنية التطبيقية1،،من79. استخدام الأحماض الدهنية مستعدة على نحو ملائم/مصل الزلال يصرف للتحقيق في تأثير الأحماض الدهنية في الدالة بلعم ذا أهمية حاسمة في الحصول على بيانات ذات مغزى بيولوجيا. يمكن أن توفر دراسات بشأن تأثير الأحماض الدهنية في بلعم الدالة المعرفة الأساسية والأهداف العلاجية المحتملة المتعلقة بالأيض الأحماض الدهنية في أمراض تشترك بلعم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وأقر البروتوكول "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة لويزفيل.
1-"الماوس نخاع العظام المستمدة الضامة" (بمدمس)
- يوثانيزي CO 2 باستخدام ماوس نوع البرية 6-8 أسبوع وصحية. دبوس وصولاً إلى لوحة رغوة والرش مع الإيثانول 70% حتى يتم استيعابه. إزالة عظام الساق/عظم الفخذ مع ملقط ومقص. وضعها في طبق بتري مع مل 5 1 × مخزنة الفوسفات المالحة (PBS). تنفيذ كافة الإجراءات تحت ظروف معقمة.
- قص فتح طرفي عظم الساق/عظم الفخذ مع مقص في غطاء زراعة الأنسجة عقيمة. مسح العظام بإبرة ز 25 مع برنامج تلفزيوني + 2% مصل بقرى الجنين (FBS) في أنبوب 15 مل.
- الطرد المركزي خلايا نخاع العظام في ز 500 x، 4 درجة مئوية للحد الأدنى 5
- ريسوسبيند بيليه الخلية في 1 مل العازلة تحلل خلايا الدم الحمراء خلايا الدم الحمراء (RBC) لأقل من 1 دقيقة ديلوت فورا مع برنامج تلفزيوني 1 x مل 9. الطرد المركزي مرة أخرى كما في الخطوة 1، 3. صب سوبيرناتانتس-
- ريسوسبيند بيليه الخلية في برنامج تلفزيوني 1 x 10 مل، تصفية تعليق خلية عن طريق شبكة نايلون ميكرومترات 40 عقيمة في أنبوب 15 مل آخر لإزالة الحطام خلية/كتل. الطرد المركزي مرة أخرى كما هو الحال في 1.3. صب سوبيرناتانتس-
- ريسوسبيند بيليه الخلية في 15 مل روزويل بارك التذكاري المعهد المتوسط (ربمي) 1640 مع 5% FBS و 10 ميكروغرام/مل الجنتاميسين، لوحة الخلايا في طبق استنبات الأنسجة 100 ملم في 37 س ج حاضنة لدوامة 60 دقيقة بلطف الطبق، أخرج العائمة الخلايا، والتعويل عليها-
- لوحة 6 × 10 6 خلايا في طبق 100 ملم مع 12 مل بلعم التفريق بين وسائط الإعلام (RPMI 1640 مع 5% FBS والجنتاميسين 10 ميكروغرام/مل، مختلطة مع وسائل الإعلام مكيفة 30% L929 10) مع 10 نانوغرام/مل الماوس المؤتلف بلعم عامل تحفيز مستعمرة (م-CSF) لمدة يومين.
- بعد استزراع لمدة يومين في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5% CO 2، تغذية كل طبق مع 6 مل بلعم الطازجة التفريق بين وسائط الإعلام مع 10 نانوغرام/مل م-CSF.
- في يوم 5، تأخذ 8 مل من وسائط الإعلام القديمة بدون إزعاج الخلايا وإضافة 10 مل بلعم الطازجة التفريق بين وسائط الإعلام مع 10 نانوغرام/مل م-CSF.
- في يوم 7، حصاد الضامة المشتقة من نخاع العظم (بمدمس) باستخدام رافعة خلية.
ملاحظة: الضامة المرفقة يمكن أيضا يمكن فصلها مع 5 مل 1 مم يدتا في 1 x برنامج تلفزيوني لمدة 5 إلى 10 دقائق بعد إزالة خلايا التعويم والغسيل لوحة مرتين مع مل 5 1 x برنامج تلفزيوني. الطرد المركزي الخلايا كما هو الحال في الخطوة 1، 3. وريسوسبيند لهم في بلعم الطازجة التفريق بين وسائط الإعلام، ويعول عليها مع هيموسيتوميتير.- تأكيد بمدمس ' النمط الظاهري بالتدفق الخلوي كوصف 5. إعداد الماوس المستمدة الضامة في تركيز بعض الدراسات التالية.
2. جيش صرب البوسنة-الدهنية "حمض مترافق إعداد"
- تحضير 2 مم جيش صرب البوسنة في برنامج تلفزيوني العقيمة. على سبيل المثال، تزن ز 6.65 جيش صرب البوسنة، إضافة 30 مل س 1 برنامج تلفزيوني حل، ثم قم بإضافة برنامج تلفزيوني أكثر حتى 50 مل، قياس المكونات لجعل 2 مم جيش صرب البوسنة في برنامج تلفزيوني س 1-
- تحضير ملح الصوديوم الفردية 5 مم من الأحماض الدهنية في 2 مم جيش صرب البوسنة. الحرارة إلى 37 درجة مئوية أو أعلى، إذا لزم الأمر، و sonicate المزيج من 2 مم جيش صرب البوسنة وملح الصوديوم للأحماض الدهنية حتى يتم الحصول على حل واضح.
ملاحظة: مقارنة بالأحماض الدهنية غير المشبعة، الأحماض الدهنية المشبعة بحاجة إلى درجة حرارة أعلى، والمزيد من الوقت سونيكيشن تذويب.
تصفية - تصفية الحل الدهنية-حمض-جيش صرب البوسنة من خلال 0.22 ميكرومتر، وقاسمه أنابيب إلى 1.5 مل ميكروسينتريفوجي العقيمة، وتخزينها في 4 درجات مئوية لاستخدامها على المدى القصير أو في-20 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل. وينبغي مراعاة لا هطول الأمطار بعد التخزين في 4 درجات مئوية في الثلاجة.
3. المشبعة "الأحماض الدهنية يحفز الخلية الموت من الماوس نخاع العظام المستمدة الضامة"
- لوحة بمدمس في صفيحة زراعة الأنسجة 24-جيدا مع 0.4 × 10 6/mL في بلعم التفريق بين وسائط الإعلام-
- علاج الخلايا مع حمض النخليك 0.4 مم وحمض دهني ح 16 إلى 24 في حاضنة 37 درجة مئوية مع شركة 5% 2. استخدام جيش صرب البوسنة كعنصر سلبي.
- حصاد الخلايا مع رافعة خلية بعد العلاج وتدور أسفل الخلايا في ز x 500، 4 درجة مئوية للحد الأدنى 5
- وصمة عار الخلايا مع 488 الخامس-أليكسا أنيكسين و 7-أمينواكتينوميسين د (7-عاد) في 100 ميكروليتر annexin V ربط المخزن المؤقت لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة-
- تمييع العينة مع 200 ميليلتر من المخزن المؤقت ملزم annexin، تخلط بلطف، ثم تبقى العينات على الجليد بعد فترة الحضانة.
- تحليل الخلايا ملطخة بأسرع طريق التدفق الخلوي 5. أنيكسين 488 الخامس-أليكسا يتم الكشف عن في قناة فيتك ويتم الكشف عن 7-الإغراق في قناة بيركب/بيركب-Cy5.5.
4. داخل الخلايا "تلطيخ السيراميد"
- بعد العلاج الأحماض الدهنية، وحصاد الخلايا كما هو الحال في الخطوة 3، 3. قم بإصلاح الخلايا في بارافورمالدهيد 4% للحد الأدنى 30
- تغسل العينة مع مل 1 1 x برنامج تلفزيوني، وتدور إلى أسفل خطوة في 3.3، وصب المادة طافية.
- وصمة عار في الخلايا التي تحتوي على مكافحة السيراميد جسم الأولية (تخفيف 1: 200) في س 1 ميكروليتر 100 permeabilization المخزن المؤقت ل 30 دقيقة
- المياه والصرف الصحي، وزيادة ونقصان لأسفل الخلايا مرة أخرى كما في الخطوة 4، 2-
- وصمة عار في الخلايا مع الماوس المضادة IgM جسم الثانوي (تخفيف 1: 500) في س 1 ميكروليتر 100 permeabilization المخزن المؤقت ل 30 دقيقة أغسل
- وتدور أسفل الخلايا مرة أخرى كما في الخطوة 4، 2. إضافة 250 برنامج تلفزيوني 1 x ميكروليتر وتحليل الخلايا ملطخة بالتدفق الخلوي 5.
ملاحظة: انظر قائمة كاشف مفصلة في الجدول للمعدات والمواد الكاشفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
السمنة زيادة تركيزات الأحماض الدهنية الحرة في مصل الدم. البالعات المهنية، الضامة نشاط تناول الأحماض الدهنية للحفاظ على التوازن المضيف. خلال هذه العمليات، قد حمل الدهون محمل بشكل زائد بلعم موت الخلية. وتحقيقا لهذه الغاية، نحن مثقف بمدمس في المختبر مع مستويات البدانة الغذائية من الأحماض الدهنية وموت الخلية بلعم المقاسة باستخدام تدفق تلطيخ سيتوميتريك. مقارنة لسيطرة جيش صرب البوسنة، الأحماض الدهنية المشبعة، لا سيما دهني الأحماض، الناجمة عن موت الخلية كبيرة من الخلايا الميتة كانت تظهر كالسكان إيجابية مزدوجة الملون "أننيكسين الخامس" وعاد 7 (الشكل 1 أ-ب) بمدمس.. من المذكرة، لا حمل الأحماض الدهنية غير المشبعة بلعم كبير خلية الموت5. وتشير البيانات إلى التأثير السمي لزيادة مستويات الأحماض الدهنية المشبعة الحرة في الجسم الحي.
وبالمثل، استخدام خط خلية سنخية الجدوى التي كانت عرضه لمعاملة الأحماض النخليك أو دهني الأحماض5، وجدنا أن قابلية الضامة لموت الخلايا التي يسببها حمض النخليك تأثر أيضا بالعدد الخلايا في الثقافة (الشكل 2a). ببساطة، تحت نفس الظروف الثقافية، الضامة أكثر في الآبار، أقل من موت الخلايا الناجمة عن الأحماض الدهنية. وعلاوة على ذلك، كان موت الخلايا التي يسببها حمض النخليك ارتباطاً إيجابيا مع مستويات متراكمة من سيراميد الخلوية (الشكل 2). عندما كانت مثقف الضامة في حالة عالي الكثافة، تم استنفاد المغذيات المتوسط أسرع استقلاب الطاقة، هذه الخلايا كانت أقل عرضه لموت الخلايا التي يسببها حمض النخليك مقارنة بالضامة مثقف في حالة منخفضة الكثافة. وفي المقابل، عند تعرض الخلايا لشرط إثراء المغذيات (مثلاً، السمنة)، يمكن استقلاب الأحماض الدهنية الزائدة لإنتاج سيراميد السامة، مما يؤدي إلى موت الخلايا المستحثة بالأحماض الدهنية. وهكذا، قد تجلب الظروف الثقافية خلية تباين النتائج من موت الخلايا المستحثة بالأحماض الدهنية المشبعة.
رقم 1: تركيز عال من الأحماض الدهنية، ولا سيما دهني الأحماض، الحث على موت الخلايا بلعم. كانت مطلي بمدمس (يوم 7) ك 0.4 × 106/mL في بلعم الطازجة التفريق بين وسائل الإعلام. وبعد مرفق خلية 0.5-1 ح، بمدمس تعامل مع تركيز كل الأحماض الدهنية المعينة ل h. 24 وسائل الإعلام وحدها وجيش صرب البوسنة كانت تستخدم كعناصر سلبية. بعد العلاج، خلايا تم رفع وتحصد، ثم نسج أسفل في 500 غرام لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. كانت ملطخة الخلايا 7-عاد و Annexin 488 أليكسا الخامس في 100 ميكروليتر annexin ملزم من المخزن المؤقت لمدة 15 دقيقة. قم بإضافة آخر 200 ميكروليتر ملزمة أنيكسين المخزن المؤقت لكل عينة قبل تحليل التدفق الخلوي. (أ) إثبات بيانات التدفق الخلوي للخلايا التي يسببها بالأحماض الدهنية. (ب) ملخص لموت الخلايا التي يسببها بالأحماض الدهنية. شريط خطأ يمثل نموذج التنمية المستدامة. موت الخلايا الناجمة عن حمض النخليك (السلطة الفلسطينية) وخاصة حمض دهني (SA) يعتد به إحصائيا بالمقارنة مع جيش صرب البوسنة لعنصر التحكم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: توافر وسائل الإعلام المغذيات الآثار الضامة التعرض لحمض النخليك الناجمين عن موت الخلية. (أ) حالة التغذية خلية التأثيرات التسامح للإجهاد الناجم عن الأحماض الدهنية المشبعة. (ب) قابلية الخلية لموت الخلايا المستحثة الأحماض الدهنية المشبعة ارتباطاً قويا بمستويات الخلوية المتراكمة من السيراميد. تحقق التدرج المغذيات وسائل الإعلام باستزراع خط الخلية بلعم نوع البرية في 1 م، م 2، 4 و 8 متر مربع (M = 1 × 106) في أطباق بتري 6 ملم مع 6 مل 1640 RPMI مع 5% FBS و 10 ميكروغرام/مل الجنتاميسين للموارد البشرية 18. اللون وسائل الإعلام أكثر الأصفر بسبب نضوب المغذيات أكثر عندما تستزرع عدد أكبر من الخلايا في الأطباق. أكثر من 90% الخلايا قابلة للتطبيق لا يزال عاليا. خلايا قابلة للتطبيق المرفق رفع بيبيتينج بعد الجلوس في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق وإعادة استزراع فورا في 0.2x106/mL في وسائط جديدة في لوحات 24-جيدا. وعولج الخلايا فورا مع حمض النخليك 0.4 مم ح 18 باستخدام جيش صرب البوسنة كالمراقبة لكل مصدر (المغذيات التدرج) من الخلايا. ثم كافة الخلايا المعالجة تم حصادها والملون مع 7--عاد لموت الخلية أو الملون مع السيراميد داخل الخلايا. موت الخلية عفوية (7-عاد +) النسب المئوية كانت أقل من 8.6%. قدرت موت الخلية المحددة في المعاملة كالفرق % في 7-عاد + بين العلاج ولها جيش صرب البوسنة السيطرة على (أ). وقدرت مستوى السيراميد محددة المعاملة الأسفار يعني كثافة (مؤسسة مونتانيار) الفرق بين العلاج ومراقبة جيش صرب البوسنة الخاصة به (ب). وتكررت هذه التجربة، وعرضت بيانات تمثيلية. شريط خطأ يمثل نموذج التنمية المستدامة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
إعداد الأحماض الدهنية الحل السليم ذات أهمية حاسمة لدراسة الوظيفة البيولوجية للأحماض الدهنية. تحييد الأحماض الدهنية يزيد ذوبانه في محلول مائي. ومع ذلك، أملاح الصوديوم للأحماض الدهنية، وخاصة الأحماض الدهنية المشبعة، لا تزال منخفضة القابلية للذوبان في الماء أو في برنامج تلفزيوني كما لاحظنا. أسلوب واحد استخدام الإيثانول 95-100% للمساعدة على حل الأحماض الدهنية1. باستخدام هذا الأسلوب، يمكن ملاحظة ارتفاع السمية للخلايا حتى في تركيزات أقل للأحماض الدهنية غير المشبعة أقل سمية. طريقة أخرى لتحضير الأحماض الدهنية الحل استخدام الميثيل-β-سيكلوديكسترين كنظام التسليم حيث أن الأحماض الدهنية لها الظروف المثلى، المتبقية في الحل شكل أحادي9،11. الأحماض الدهنية التي أعدت بهذا أسلوب على ما يبدو وظيفة طبيعية، ولكن القيام بالطريقة معقدة. أثر الميثيل-β-سيكلوديكسترين على نمو الخلايا أن التركيز العالي يمكن أن يؤدي إلى وفاة12خلية. للأحماض ستارك وبالميتيك المشبعة، يتم استخدام درجة حرارة عالية (60 سج) للمساعدة في سولوبيليزيشن9.
أن الزلال هو بروتين ملزمة الأحماض الدهنية رئيسية في السائل خارج الخلية، مما يساعد في نقل الأحماض الدهنية في أنظمة اللمفاوية والأوعية الدموية، هو يفضل كالناقل الطبيعي للدراسة الفنية من الأحماض الدهنية. لتجنب انخفاض معدلي الذوبان في الأحماض الدهنية الملح في المحلول، sonication سيسهل كثيرا على تصريف الأحماض الدهنية مع جيش صرب البوسنة، مما يساعد في سولوبيليزيشن الأحماض الدهنية. يستغرق أطول كثيرا (ساعات) جعل الأحماض الدهنية المشبعة من الأحماض الدهنية غير المشبعة (30 دقيقة) مع نفس المقدار من حجم وتركيز. وعلى الرغم من التدفئة و sonication الحرجة للاقتران الأحماض الدهنية جيش صرب البوسنة، ارتفاع في درجة حرارة (أقل من 50 سج) يقترح للحصول على وضوح جيش صرب البوسنة والسلطة الفلسطينية، ينصح بشدة الحلول المتقارنة جيش صرب البوسنة-سا، ودرجة حرارة منخفضة سولوبيليزينج الأحماض الدهنية غير المشبعة بسبب تعرضها للأكسدة في درجة حرارة عالية. 6:1 نسبة المولى أن كان نشر7أو 5:2 المولى نسبة الأحماض الدهنية لجيش صرب البوسنة تعتبر جيدة بالمقارنة مع 3:1. وهذا يمكن ضمان أقل الأحماض الدهنية خالية تماما في الحل لتجنب سمية الصابون الأحماض الدهنية. تظهر الأحماض الدهنية جيش صرب البوسنة على استعداد بهذه الطريقة أن تكون حلول مستقرة (لا هطول الأمطار، على الأقل) في 4 درجات مئوية لمدة 3 أشهر على الأقل كما هو موضح في وظائفها على موت الخلية بلعم. ختم غطاء الأنبوبة إذا أعدت الأحماض الدهنية ليس لاستخدامها لفترة طويلة من الزمن.
عندما يتم الحصول على التوصل إلى حل واضح للأحماض الدهنية جيش صرب البوسنة في برنامج تلفزيوني، من الأرجح أن هناك ما يبرر نتائج متسقة من معاملة الأحماض الدهنية. ومع ذلك، الضامة يتضورون جوعاً وتغذية جيدة الاستجابة بشكل مختلف تماما للعلاج الأحماض الدهنية والأحماض الدهنية المشبعة خاصة. الضامة مع المغذيات الزائدة هي أكثر عرضه لموت الخلايا المستحثة بالأحماض الدهنية المشبعة من يتضورون جوعاً أو تجويع منها لأنه يمكن إزالة السموم خلايا هونجيريد أيضي من الأحماض الدهنية المشبعة بسبب طلبهم البقاء على قيد الحياة والنمو. مثل موت الخلايا يرتبط جداً مع مستويات السيراميد الخلوية المتراكمة. من المذكرة، تحدث السمية السيراميد فقط عندما تصل مستويات السيراميد داخل الخلايا إلى عتبة معينة. لضمان تحقيق نتائج متسقة من الأحماض الدهنية تعالج الضامة أو أي نوع آخر من الخلايا، وينبغي أن مثقف الخلايا مع وسائط جديدة مع وفرة المغذيات. يمكن أن يؤدي أي شروط ثقافة الخلية دون المستوى الأمثل في البيانات دون المستوى الأمثل.
وبوجه عام، تقديم هذه البروتوكولات التي تشتد تفاصيل لدراسة تأثير الأحماض الدهنية في الضامة بمختبرات أخرى. ومقارنة بالأساليب الأخرى، يولد هذا النهج المباشر يصرف الأحماض الدهنية جيش صرب البوسنة دون استخدام مذيب إضافية مثل الإيثانول. الخطوة الأكثر تحديا لإعداد دقيق، مستقرة حل الأحماض الدهنية جيش صرب البوسنة لأن سونيكيشن يولد حرارة وأنه من الصعب مراقبة درجة الحرارة. لحسن الحظ، الأحماض الدهنية غير المشبعة سهلة التحضير في فترة زمنية قصيرة، وتبقى مستقرة، بينما تظهر الأحماض الدهنية المشبعة الوقوف على درجات الحرارة المرتفعة نسبيا لأنها مشبعة ومقاومة للأكسدة في مثل هذه حالة. حتى الآن، لا نلاحظ أي قضية أو الحد منها مع يصرف الأحماض الدهنية جيش صرب البوسنة على استعداد بهذه الطريقة. التعديل لأن البروتوكول سيكون ضروريا إذا كانت هناك حاجة إلى تجارب أكثر حساسية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن لا تضارب المصالح المالية.
Acknowledgments
بتأييد هذا العمل جزئيا بأموال بدء جامعة لويزفيل، ويمنح المعهد الوطني للسرطان (بيثيسدا، ماريلاند) R01CA177679، R01CA180986.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CPX Ultrasonic Bath | Bransonic | Model 2800 | |
| Sodium palmitate (PA) | Nu-Chek Prep, Inc. | S-1109 | M.W. 278 |
| Sodium stearate (SA) | Nu-Chek Prep, Inc. | S-1111 | M.W. 306 |
| Bovine serum albumin (BSA), fatty acid-free | Fisher Scientific | 9048-46-8 | |
| Mouse macrophage colony stimulating factor (mM-CSF) | Cell Signaling Technology, Inc. | 5228 | |
| RPMI 1640 | VWR International | 71002-878 | |
| Annexin V, Alexa Fluor 488 conjugate | Fisher Scientific | A13201 | |
| 7-AAD | BD Biosciences | 559925 | |
| Monoclonal anti-ceramide antibody (mouse IgM) | Sigma | C8104-50TST | Clone: MID 15B4 |
| Goat Anti-Mouse IgM Antibody, µ chain, FITC conjugate | Sigma | AP128F | |
| Fixation buffer | Biolegend | 420801 | |
| Permeabilization buffer | Ebioscience | 4307693 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Sigma | 11814389001 | |
| Annexin V Binding Buffer | BD Biosciences | 556454 | |
| L929 cells | ATCC | CCL-1 | |
| Corning Cell Lifter | Fisher Scientific | 07-200-364 | |
| Note: M.W. is for molecular weight. |
References
- Martins de Lima, T., Cury-Boaventura, M. F., Giannocco, G., Nunes, M. T., Curi, R. Comparative toxicity of fatty acids on a macrophage cell line (J774). Clin Sci (Lond). 111 (5), 307-317 (2006).
- Simard, J. R., Zunszain, P. A., Hamilton, J. A., Curry, S. Location of high and low affinity fatty acid binding sites on human serum albumin revealed by NMR drug-competition analysis. J Mol Biol. 361 (2), 336-351 (2006).
- Penn, A. H., Dubick, M. A., Torres Filho, I. P. Fatty Acid Saturation of Albumin Used in Resuscitation Fluids Modulates Cell Damage in Shock: In Vitro Results Using a Novel Technique to Measure Fatty Acid Binding Capacity. Shock. , (2017).
- Vusse, G. J. Albumin as fatty acid transporter. Drug Metab Pharmacokinet. 24 (4), 300-307 (2009).
- Zhang, Y., et al. Adipose Fatty Acid Binding Protein Promotes Saturated Fatty Acid-Induced Macrophage Cell Death through Enhancing Ceramide Production. J Immunol. 198 (2), 798-807 (2017).
- Zhang, Y., et al. Epidermal Fatty Acid binding protein promotes skin inflammation induced by high-fat diet. Immunity. 42 (5), 953-964 (2015).
- Wen, H., et al. Fatty acid-induced NLRP3-ASC inflammasome activation interferes with insulin signaling. Nat Immunol. 12 (5), 408-415 (2011).
- Zhang, Y., et al. Fatty acid-binding protein E-FABP restricts tumor growth by promoting IFN-beta responses in tumor-associated macrophages. Cancer Res. 74 (11), 2986-2998 (2014).
- Ulloth, J. E., Casiano, C. A., De Leon, M. Palmitic and stearic fatty acids induce caspase-dependent and -independent cell death in nerve growth factor differentiated PC12 cells. J Neurochem. 84 (4), 655-668 (2003).
- Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH Protoc. , (2008).
- Dansen, T. B., et al. High-affinity binding of very-long-chain fatty acyl-CoA esters to the peroxisomal non-specific lipid-transfer protein (sterol carrier protein-2). Biochem J. 339 (Pt 1), 193-199 (1999).
- Ulloth, J. E., et al. Characterization of methyl-beta-cyclodextrin toxicity in NGF-differentiated PC12 cell death. Neurotoxicology. 28 (3), 613-621 (2007).
