Summary

Acides gras saturés induit la mort des cellules macrophages associées aux céramides

Published: October 31, 2017
doi:

Summary

Nous illustrons une méthode directe pour calculer des macrophages de souris primaires des cellules de la moelle osseuse et une méthode simple pour préparer l’acide gras BSA conjugués. Ensuite, nous démontrons que les acides gras saturés peut induire la mort des cellules macrophages, et la mort de ces cellules est corrélée positivement avec accumulation cellulaire de niveaux de céramide.

Abstract

Les macrophages expriment très épidermique d’acide gras-protéine et protéine acide gras adipeuse. Ils ont activement l’absorption saturés et des acides gras insaturés, qui pourrait jouer un rôle essentiel dans la régulation de leurs fonctions immunitaires. De nombreuses études ont montré que les divers acides gras, saturés ou insaturé, mai possèdent différents impacts sur la croissance cellulaire et la fonction. Toutefois, les approches utilisées pour la préparation de l’acide gras varient, qui peut conduire à des résultats non physiologiques. Albumine sérique, un support naturel pour les acides gras dans le sang périphérique chez les mammifères, est recommandé pour former un complexe avec le sel de sodium des acides gras conjugué pour étudier la fonction acide gras dans les cellules de mammifères, ce qui minimise la toxicité du savon d’acide gras. Ainsi, un simple, relativement rapide, chauffage et sonification méthode est développé et présenté ici pour formation conjuguée de l’acide gras BSA. Les auteurs décrivent un protocole à l’aide d’acides gras saturés, notamment les acides stéarique pour induire la mort cellulaire sévère dans les macrophages de la moelle osseuse provenant de souris. Par ailleurs, nous démontrent que la mort cellulaire d’induite par l’acide gras saturé est corrélée positivement avec des niveaux de céramide cellulaires accumulés. Cette méthode peut être appliquée pour les études de l’impact des acides gras sur les autres cellules de mammifères.

Introduction

Les acides gras jouent un rôle essentiel dans le métabolisme énergétique et dans la synthèse des phospholipides membranaires dans différents types de cellules. Les acides gras ont une faible solubilité dans l’eau. Une préparation appropriée de l’acide gras est d’une importance cruciale pour étudier les fonctions biologiques des acides gras dans les cellules de mammifères. Lorsque les acides gras sont préparés avec de l’éthanol, beaucoup d’acides gras peuvent montrer leur effet toxique savon (détergent) sur la membrane cellulaire, même à des concentrations relativement faibles1. Un transporteur naturel, important pour les acides gras libres dans le sérum, sérum albumine est considéré comme un bon support pour acides gras livraison in vitro d’acides gras fonction essais2,3,4. Toutefois, les détails de la préparation des acides gras et l’albumine sérique conjuguées ne sont habituellement pas disponibles même si les nombreux Articles de recherche à l’aide d’acides gras ont été publiés.

Les macrophages expriment très protéine acide gras épidermique et adipeuse liant les acides gras protéine5,6,7,8. Ils ont activement l’absorption saturés et des acides gras insaturés qui pourrait réguler leurs fonctions immunitaires. Afin d’étudier l’impact des acides gras sur les macrophages et autres cellules, différentes méthodes de préparation d’acides gras ont été appliquées1,7,9. En utilisant convenablement préparé l’acide gras/sérum albumine conjugués d’étudier l’impact des acides gras sur la fonction des macrophages est crucial dans l’obtention des données significatives sur le plan biologique. Études sur l’impact des acides gras sur la fonction des macrophages peuvent fournir des connaissances de base et des cibles thérapeutiques potentielles relatives au métabolisme des acides gras dans les macrophages impliqués maladies.

Protocol

le protocole a été approuvé par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’Université de Louisville. 1. Macrophages dérivés la moelle osseuse de souris (BMDMs) euthanasier une souris de type sauvage âgés de 6 à 8 semaines, en bonne santé à l’aide de CO 2. Épinglez-le vers le bas pour un panneau de mousse et vaporiser avec l’éthanol à 70 % jusqu’à ce qu’il est trempé. Enlever les os de tibia/fémur avec pinces et ciseaux. Mett…

Representative Results

L’obésité augmente les concentrations en acides gras libres dans le sérum. Comme les phagocytes professionnels, macrophages prennent activement des acides gras pour maintenir l’homéostasie de l’hôte. Au cours de ces processus, surchargée de lipides peuvent provoquer la mort des cellules macrophages. À cette fin, nous avons cultivé BMDMs in vitro avec des niveaux d’acides gras alimentaires et la mort des cellules macrophages mesurée à l’aide de coloration de cy…

Discussion

La bonne préparation de solution d’acide gras est d’une importance critique pour étudier la fonction biologique des acides gras. La neutralisation de l’acide gras augmente sa solubilité dans une solution aqueuse. Toutefois, les sels de sodium des acides gras, en particulier les acides gras saturés, sont encore de faible solubilité dans l’eau ou PBS que nous avons observé. Une méthode consiste à utiliser l’éthanol à 95-100 % pour aider à dissoudre les acides gras1. En utilisant…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu partiellement par les fonds de démarrage de l’Université de Louisville et Institut National du Cancer (Bethesda, MD) accorde R01CA177679, R01CA180986.

Materials

CPX Ultrasonic Bath  Bransonic Model 2800
Sodium palmitate (PA) Nu-Chek Prep, Inc. S-1109 M.W. 278
Sodium stearate (SA) Nu-Chek Prep, Inc. S-1111 M.W. 306
Bovine serum albumin (BSA), fatty acid-free Fisher Scientific 9048-46-8
Mouse macrophage colony stimulating factor (mM-CSF)  Cell Signaling Technology,  Inc. 5228
RPMI 1640 VWR International 71002-878
Annexin V, Alexa Fluor 488 conjugate Fisher Scientific A13201
7-AAD BD Biosciences 559925
Monoclonal anti-ceramide antibody (mouse IgM) Sigma C8104-50TST Clone: MID 15B4
Goat Anti-Mouse IgM Antibody, µ chain, FITC conjugate Sigma AP128F
Fixation buffer Biolegend 420801
Permeabilization buffer Ebioscience 4307693
Red Blood Cell Lysis Buffer  Sigma 11814389001
Annexin V Binding Buffer BD Biosciences 556454
L929 cells ATCC CCL-1
Corning Cell Lifter  Fisher Scientific 07-200-364
Note: M.W. is for molecular weight.

References

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Cite This Article
Zhang, Y., Hao, J., Sun, Y., Li, B. Saturated Fatty Acids Induce Ceramide-associated Macrophage Cell Death. J. Vis. Exp. (128), e56535, doi:10.3791/56535 (2017).

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