Summary
骨髄細胞からマウスのプライマリ マクロファージを派生させるストレートなメソッドを示すし、BSA 脂肪酸を準備する簡単な方法が抱合体します。示す飽和脂肪酸がマクロファージの細胞死を引き起こすことができる、このような細胞死はセラミド レベルの細胞集積に積極的に関連付けられました。
Abstract
マクロファージは高い表皮の脂肪酸結合蛋白質と脂肪の脂肪酸結合蛋白質を表現します。彼ら積極的に吸収飽和と不飽和脂肪酸、免疫機能の調節に重要な役割を担う。様々 な脂肪酸が飽和している数多くの研究が示しているなったり不飽和、細胞の成長と機能に関する別の影響を持っています。しかし、脂肪酸の準備に使用する方法が異なります、非生理学的な結果につながる可能性があります。脂肪酸石鹸の毒性を最小限に抑える哺乳類細胞における脂肪酸関数を勉強する共役脂肪酸のナトリウム塩との複合体を形成するため、血清アルブミン、哺乳類の末梢血液中の脂肪酸のための自然なキャリアをお勧めします。したがって、単純な比較的短時間加熱・ sonicating メソッドの開発・ BSA 脂肪酸の酸の共役形成はここで説明しました。飽和脂肪酸、特にステアリン酸マウス骨髄由来マクロファージにおける深刻な細胞死を誘導するためを使用してプロトコルについて述べる。さらに飽和脂肪酸が誘導する細胞死が積極的に蓄積された細胞のセラミド レベルに関連付けられていることを示します。このメソッドは、他の哺乳類細胞の脂肪酸の影響の研究を拡張できます。
Introduction
脂肪酸は、異なる種類の細胞膜リン脂質の合成、エネルギー代謝に重要な役割を果たします。脂肪酸には、低水溶解度があります。脂肪酸の適切な準備は、哺乳類細胞における脂肪酸の生物学的機能を研究するため非常に重要です。脂肪酸はエタノールを使用して、多くの脂肪酸が比較的低濃度1でも細胞膜への有毒な石鹸 (洗剤) 影響が表示されます。血清中遊離脂肪酸の自然、主要なトランスポーター、血清アルブミンは脂肪酸配信体外用脂肪酸機能試金2,3,4良いキャリアが考慮されます。しかし、脂肪酸組成と血清アルブミンの共役の準備の詳細通常ご利用いただけませんにもかかわらず、脂肪酸を使用して多くの研究論文が公開されています。
マクロファージには、表皮の脂肪酸結合蛋白質と脂肪脂肪酸結合タンパク質5,6,7,8高い表現します。彼ら積極的に吸収飽和と不飽和脂肪酸、免疫機能を調節する可能性があります。マクロファージや他の細胞に脂肪酸の影響を研究するには、脂肪酸の準備のさまざまな方法は応用1,7,9.生物学的意味のあるデータを得ることは非常に重要です適切に準備された脂肪酸/血清アルブミン複合体を使用して、マクロファージに脂肪酸の影響を調査します。マクロファージに脂肪酸の影響に関する研究は、基本的な知識とマクロファージが関与する疾患における脂肪酸代謝に関する潜在的な治療上のターゲットを提供できます。
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Protocol
プロトコル制度動物ケアおよび使用委員会 (IACUC)、ルイビル大学の承認されました
。1 です。 マウス骨髄由来マクロファージ (BMDMs)
- 安楽死 CO 2 を使用して 6-8 週齢、健康の野生型マウス。発泡ボードにピンし、それがずぶぬれになるまで、70% エタノールをスプレーします。鉗子、はさみで脛骨・大腿骨骨を削除します。リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x 5 ml 1 シャーレに入れてください。生殖不能の条件の下ですべての手順を実行します 。
- カット滅菌のティッシュ文化フードのハサミで脛骨・大腿骨骨の両端オープン。15 mL チューブに PBS + 2% ウシ胎児血清 (FBS) 25 G 針と骨をフラッシュします 。
- 500 x g、5 分のための 4 ° C で骨髄細胞を遠心分離
- は、1 分未満 9 mL の 1x PBS ですぐに Dilute 赤血球 (RBC) を溶解して 1 mL 赤血球細胞換散バッファーの細胞ペレットを再懸濁します。手順 1.3 のように再度遠心します。培養上清をデカントします 。
- 10 mL の 1x PBS で細胞ペレットを再懸濁します、細胞破片/塊を削除する別の 15 mL チューブに滅菌 40 μ m ナイロン メッシュを通して細胞懸濁液をフィルタ リングします。1.3 のように再度遠心します。培養上清をデカントします 。
- 15 mL ロズウェル パーク記念研究所中 (RPMI) 1640 5 %fbs と 10 μ g/mL ゲンタマイシン、浮動取り出す 60 分ゆっくり旋回、皿の 37 o C インキュベーターで 100 mm 培養皿の細胞板細胞ペレットを再懸濁します。細胞し、それらをカウントします 。
- 10 ng/mL 遺伝子組換えマウスのマクロファージ 12 mL マクロファージ メディア (5 %fbs と 30 %l929 エアコン メディア 10 混合 10 G/ml ゲンタマイシン RPMI 1640) を区別すると 100 mm ディッシュの 6 x 10 6 セルを板します。2 日間のコロニー刺激因子 (M-CSF).
- 5% CO 2 と 37 ° C の定温器で 2 日間培養後 6 mL の新鮮なマクロファージ 10 ng/mL M CSF でメディアの差別化と各料理をフィードします 。
- 5 日セルを妨げないでを古いメディアの 8 mL を取るし、10 mL の新鮮なマクロファージ 10 ng/mL M CSF でメディアの差別化を追加します 。
- 7 日セル リフターを使用して骨髄由来マクロファージ (BMDMs) を収穫します
。 注: 接続されているマクロファージにも分離 5 mL 1 mM EDTA 5 〜 10 分の 1 × PBS のフロートのセルを削除し、5 mL の 1x PBS で 2 回プレートを洗浄した後。手順 1.3 のように細胞を遠心分離機します。 新鮮なマクロファージ、メディアの差別化でそれらを再懸濁します、診断に数を数えます。- 確認、BMDMs ' としてフローサイトメトリーによる表現型に 5 が記述されています。次の研究の特定の濃度でマクロファージ由来のマウスを準備します 。
2。BSA 脂肪酸酸共役準備
- 準備 2 mM BSA 滅菌 PBS。たとえば、50 mL まで多くの PBS を追加、6.65 g BSA に溶かすために、30 mL の 1x PBS を追加重量を量る 1x PBS で 2 mM BSA をするコンポーネントをスケーリングします 。
- 2 mM BSA の脂肪酸の準備 5 mM 個々 のナトリウム塩。必要に応じて、37 ° c 以上の熱し、透明な溶液が得られるまで 2 mM BSA の混合物および脂肪酸のナトリウム塩を超音波照射します
。 注: に比べて不飽和脂肪酸、飽和脂肪酸必要があります高温、超音波処理に多くの時間を溶解するため 。
- フィルター脂肪酸酸 BSA ソリューションを通じて、0.22 μ m フィルター、因数に 1.5 mL 滅菌遠心チューブ、短期使用のための 4 ° c または長期保管のための-20 ° C で保管します。冷蔵庫で 4 ° c の貯蔵の後の沈殿物必要がありますられなかった 。
3。飽和脂肪酸誘導細胞死マウス骨髄由来マクロファージの
- メディアの差別化マクロファージ 10 6/mL × 0.4 で 24 ウェル培養プレートに BMDMs をプレートします 。
- は、0.4 mM パルミチン酸とステアリン酸 5% CO 2 と 37 ° C の定温器で 16 ~ 24 時間のセルを扱います。負の制御として BSA を使用します 。
- 治療後セル リフターと細胞を収穫し 500 x g、4 ° C、5 分で細胞をスピン
- アネキシン V アレクサ 488 と 100 で 7 aminoactinomycin D (7 AAD) で細胞を染色アネキシン V 結合バッファー室温で 15 分間 μ L.
- 200 μ L のアネキシン結合バッファーでサンプルを希釈、優しく、ミックスし、潜伏期間後に氷のサンプルを維持します 。
- は流れ cytometry 5 によってできるだけ早く陽性細胞を分析します。アネキシン V アレクサ 488 が FITC チャンネルで検出され、PerCP/PerCP Cy5.5 チャネルで 7 AAD が検出された 。
4。セラミドの細胞内染色
- 脂肪酸処理後ステップ 3.3 のように細胞を収穫します。30 分 4% パラホルムアルデヒドでセルを修正し、
- 1 mL の 1x PBS でサンプルを洗って、スピン ・ ダウンとしては 3.3 では、ステップし、上清をデカントします 。
- 30 分の 100 μ L 1 x 透過バッファーで対策セラミド一次抗体 (希釈 1: 200) と細胞を染色
- 洗浄とスピン ダウン ステップ 4.2 のようにもう一度セル 。
- 30 分の 100 μ L 1 x 透過バッファーで抗マウス igm 抗体二次抗体 (1: 500 希釈) と細胞を染色
- 洗って、スピン ステップ 4.2 のように再びセルをダウンします。250 μ L 1 × PBS を追加し、流れの cytometry の 5 によって染色の細胞を分析します
。 メモ: は、機器や試薬のテーブルの詳細な試薬リストを参照してください 。
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Representative Results
肥満では、血清中遊離脂肪酸濃度を増加させます。プロの食としては、マクロファージは、ホストの恒常性を維持するために積極的にで脂肪酸を取る。これらのプロセスの間にオーバー ロードされた脂質は、マクロファージの細胞死を引き起こす可能性があります。このためには、我々 BMDMs 培養体外肥満レベルの脂肪酸と流れフローサイトメトリーによる染色を使用して測定されたマクロファージ細胞死。BSA の制御、飽和脂肪酸と比較して特にステアリン酸、死んだ細胞はアネキシン V と 7 AAD (図 1 ab) に染まる二重肯定的な集団として示されていた BMDMs の重要な細胞死誘導。注記のうち、不飽和脂肪酸は重要なマクロファージ細胞死5を誘発しなかった。生体内で飽和脂肪酸の増加レベルの毒性の影響が示唆されました。
同様に、我々 の発見にその生存率はパルミチン酸やステアリン酸5の治療を受けやすいマクロファージ細胞株を用いた、パルミチン酸が誘導する細胞死に大食細胞の感受性は細胞数に受けます文化 (図 2 a)。簡単に言えば、同じ文化的な条件下での脂肪酸による以下の細胞死の井戸よりマクロファージ。また、パルミチン酸によって誘導される細胞死は積極的に細胞セラミド (図 2 b) の蓄積レベルと関連付けられました。マクロファージは、高密度条件で培養した、エネルギー代謝の中の栄養素が高速枯渇、これらの細胞は、低密度の状態で培養マクロファージに比べるとパルミチン酸が誘導する細胞死により少なく敏感だった。対照的に、細胞は、栄養強化の条件 (例えば肥満) にさらされた、それにより脂肪酸によって誘導される細胞死に至る毒性のセラミドを生成する過剰な脂肪酸が代謝します。したがって、細胞培養条件は飽和脂肪酸による細胞死の結果に変化をもたらす可能性があります。
図 1: 脂肪酸、特にステアリン酸の高濃度は、マクロファージの細胞死を誘導します。BMDMs (7 日目) は、メディアを区別する新鮮なマクロファージ 106/mL × 0.4 としてメッキだった。0.5-1 h、BMDMs の細胞接着後 24 時間一人でメディアと BSA は、ネガティブ コントロールとして使用されたために、各脂肪酸の濃度が指定された扱われました。いた細胞治療後解除し、収穫、4 ° C で 5 分間 500 g でスピンダウン細胞は 15 分間 100 μ L アネキシン結合バッファーで 7 AAD とアネキシン V アレクサ 488 染まっていた。別の 200 μ L アネキシン結合バッファーを流れフローサイトメトリー解析の前に各サンプルに追加します。(A)脂肪酸による細胞の流れ cytometry データのデモンストレーション。(B)脂肪酸による細胞死の概要です。エラー バーを表すサンプルの SDパルミチン酸 (PA) によって誘導される細胞死と BSA コントロールと比較して特にステアリン酸 (SA) は統計的に有意です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: メディアの栄養素の影響マクロファージのパルミチン酸感受性の可用性は、細胞死を誘導します。(A)細胞栄養状態飽和脂肪酸によるストレスへの耐性に影響を与えます。(B)飽和脂肪酸誘導細胞死に対する細胞感受性はセラミドの蓄積細胞レベルと相関します。メディア栄養勾配は 1 M、2 M、4 M、8 M (M = 1 × 106) 6 ml 5% RPMI 1640 6 mm ペトリ皿で野生型マクロファージ細胞株を培養によって達成された FBS と 18 時間の 10 μ g/mL ゲンタマイシン。メディアの色は、皿で培養される細胞の大きい数より多くの栄養枯渇により黄色です。90% 以上の細胞がまだ非常に現実的です。添付されている実行可能なセルは PBS に座って 5 分後ピペッティングによる解除され、24 ウェル プレートで新鮮なメディアで 0.2x106/mL ですぐに再培養します。セルは、セルのソース (栄養グラデーション) ごとにコントロールとして BSA を使用して 18 h の 0.4 mM パルミチン酸とすぐに扱われました。処理のすべてのセルが収穫し細胞死の 7 AAD で染色または細胞内のセラミドとステンド グラスします。自発的な細胞死 (7-AAD +) 割合は 8.6% 未満であった。治療特定細胞死は、7% の差として推定された-AAD + 治療と独自の BSA の制御(、)。治療特定のセラミド レベルは、治療と独自の BSA の制御(b)の平均蛍光強度 (MFI) 違いと推定されました。この実験は繰り返された、代表的なデータが表示されます。エラー バーを表すサンプルの SDこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
脂肪酸ソリューションの適切な準備は、脂肪酸の生物学的機能を研究する非常に重要です。脂肪酸の中和は、水溶液中での溶解性を増加します。ただし、特に飽和脂肪酸、脂肪酸のナトリウム塩は、水または PBS に難溶のまだ見ました。1 つの方法は、脂肪酸1を溶解するために 95-100% エタノールを使用することです。このメソッドを使用して、高い細胞毒性毒性が低く不飽和脂肪酸の低濃度でもなることがあります。脂肪酸ソリューションを準備する別の方法は、配信システムとして、脂肪酸がある最適な条件は、そのフォーム単量体9,11溶液メチル-β-シクロデキストリンを活用することです。このような法により作製した脂肪酸登場、正常な機能を持っているが、複雑な方法の実施です。細胞増殖に対するメチル-β-シクロデキストリンの影響は、高濃度が細胞死12につながる可能性です。飽和のステアリン酸とパルミチン酸可溶化9を支援する高温 (60 oC) が使用されます。
血清アルブミンは、リンパと血管系の脂肪酸の輸送に役に立ちます、細胞外液の主要な脂肪酸結合蛋白質以来それは脂肪酸の機能研究のための自然なキャリアとして好まれています。脂肪酸の低溶解度を避けるために水溶液の塩超音波処理が大幅に容易脂肪酸脂肪酸酸可溶化を助ける従って BSA の活用。量と濃度の同じ量の飽和脂肪酸より不飽和脂肪酸 (30 分) の可溶化の多くの長い (時間) がかかります。暖房および超音波処理が BSA 脂肪酸酸抱合の重要な高温 (50 未満oC) にお勧め取得明確な BSA-PA、BSA SA 共役ソリューション、および低温は可を強くお勧めします高温酸化感受性による不飽和脂肪酸。BSA に脂肪酸の 5:2 のモル比は、3:1 と比較する良いとされてまたは 6:1 のモル比が7を公開します。少ない完全無料脂肪酸脂肪酸石鹸の毒性を回避するソリューションが確実にできます。この方法を準備する BSA 脂肪酸安定解のように見える (沈殿物、少なくとも) マクロファージ細胞死の機能で示すように、少なくとも 3 か月のための 4 ° C で。脂肪酸を作製した場合の管の帽子のシールは時間の長い期間に使用します。
PBS で BSA 脂肪酸の明確な解決策が得られる脂肪酸処理から一貫性のある結果が可能性が高い保証されています。ただし、飢餓と飽食のマクロファージ応答、特に飽和脂肪酸の脂肪酸処理に非常に異なる。余分な栄養素を持つマクロファージ飢えよりも飽和脂肪酸が誘導する細胞死の影響を受けやすいまたは触れ細胞が彼らの生存と成長の要求により飽和脂肪酸を代謝解毒できるので物が餓死しました。このような細胞死は高度蓄積された細胞のセラミド レベルに関連付けられます。注記のうち、セラミド毒性は細胞内のセラミド レベルが一定のしきい値を達したときにのみ発生します。扱われる脂肪酸マクロファージや細胞の他のタイプから一貫性のある結果を得るに豊富な栄養素を新鮮なメディアで細胞を培養する必要があります。サブ最適なデータの最適培養条件可能性があります。
全体的にみて、これらのプロトコルは、多くの他の研究室によるマクロファージに脂肪酸の影響を研究するための詳細が必要を提供します。他の方法と比較して、この直接的なアプローチは、エタノールのような余分な溶剤を使わず BSA 脂肪酸酸抱合体を生成します。最も困難なステップは、正確な準備する超音波発熱、温度管理するは難しいために、BSA 脂肪酸酸溶液が安定します。幸いなことに、不飽和脂肪酸が簡単に短時間で準備し、安定して飽和脂肪酸は飽和状態で酸化に強いので比較的高温をスタンドのように見える。これまでのところ、我々 はない問題または BSA 脂肪酸酸抱合体の制限はこのように調製を観察しました。プロトコルの変更より敏感な実験が必要な場合は必要となります。
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Disclosures
著者は金融利害を宣言しません。
Acknowledgments
この作品はルイビル大学スタートアップ資金によって部分的に支えられた、国立癌研究所 (メリーランド州ベセスダ) は、R01CA177679、R01CA180986 を許可します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CPX Ultrasonic Bath | Bransonic | Model 2800 | |
| Sodium palmitate (PA) | Nu-Chek Prep, Inc. | S-1109 | M.W. 278 |
| Sodium stearate (SA) | Nu-Chek Prep, Inc. | S-1111 | M.W. 306 |
| Bovine serum albumin (BSA), fatty acid-free | Fisher Scientific | 9048-46-8 | |
| Mouse macrophage colony stimulating factor (mM-CSF) | Cell Signaling Technology, Inc. | 5228 | |
| RPMI 1640 | VWR International | 71002-878 | |
| Annexin V, Alexa Fluor 488 conjugate | Fisher Scientific | A13201 | |
| 7-AAD | BD Biosciences | 559925 | |
| Monoclonal anti-ceramide antibody (mouse IgM) | Sigma | C8104-50TST | Clone: MID 15B4 |
| Goat Anti-Mouse IgM Antibody, µ chain, FITC conjugate | Sigma | AP128F | |
| Fixation buffer | Biolegend | 420801 | |
| Permeabilization buffer | Ebioscience | 4307693 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Sigma | 11814389001 | |
| Annexin V Binding Buffer | BD Biosciences | 556454 | |
| L929 cells | ATCC | CCL-1 | |
| Corning Cell Lifter | Fisher Scientific | 07-200-364 | |
| Note: M.W. is for molecular weight. |
References
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