Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

رصد أثر الإجهاد ناضح على الحويصلات الافرازية والرقابة

Published: February 19, 2018 doi: 10.3791/56537
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Chemistry and Chemical Engineering, Chalmers University of Technology, 2Department of Chemistry and Molecular Biology, University of Gothenburg

Summary

ناضح الإجهاد يؤثر على الرقابة، ومبلغ العصبي أثناء هذه العملية. ونحن تبين كيفية الجمع بين الطرق الكهروكيميائية جنبا إلى جنب مع مجهر إلكتروني يمكن استخدامها لدراسة تأثير الضغط الاسموزي خارج الخلية على نشاط الرقابة وحويصله كانتال حجم ومقدار العصبي صدر خلال الرقابة.

Abstract

تسجيل أمبيروميتري الخلايا تعرض لصدمة ناضح وتبين أن الخلايا الافرازية تستجيب لهذا الإجهاد البدني بالحد من نشاط الرقابة ومقدار العصبي صدر من حويصلات في أحداث الرقابة واحدة. ويقترح أن يرجع الانخفاض في العصبية طرد تغييرات في الخصائص الفيزيائية الغشاء عند تقليص الخلايا في استجابة للضغط ناضح ومع الافتراضات التي لا تتأثر الحويصلات الافرازية في السيتوبلازم الخلية بالضغط التناضحي خارج الخلية. تسجيل أمبيروميتري للرقابة ترصد ما أطلق سراحه من الخلايا في الوقت الحالي حويصلة الصمامات مع غشاء البلازما، ولكن عدم تقديم معلومات عن محتوى حويصلة قبل أن يتم تشغيل الانصهار حويصلة. ولذلك، يوفر التسجيل مع أساليب أخرى تحليلية متكاملة قادرة على وصف الحويصلات الافرازية قبل أن يتم تشغيل الرقابة على الخلايا عن طريق الجمع بين أمبيروميتري نظرة أوسع لدراسة الحويصلات الافرازية كيف تتأثر عملية الرقابة بصدمة ناضح. ونحن هنا تصف كيف يمكن استخدام تكملة أمبيروميتري تسجيل مع الخلوي داخل الخلايا الكهروكيميائية وانتقال الميكروسكوب الإلكتروني (TEM) تصوير لوصف التغييرات في محتوى الحويصلات الافرازية الحجم والعصبي في تشرومافين الخلايا بالنسبة لنشاط الرقابة قبل وبعد التعرض للضغط التناضحي. عن طريق ربط المعلومات الكمية المكتسبة من تجارب باستخدام جميع الأساليب التحليلية الثلاث، قدمت استنتاجات سابقا أن الحويصلات الافرازية تستجيب للضغط التناضحي خارج الخلية بالتقلص في الحجم وتقليل حجم حويصلة كانتال إلى الحفاظ على تركيز عصبي حويصلة مستمر. ومن ثم، وهذا يعطي بعض التوضيحات بشأن لماذا حويصلات، في استجابة للضغط التناضحي، تقليل العصبية المبلغ صدر خلال الإفراج عن الرقابة. تسجيلات أمبيروميتريك هنا تشير إلى هذا هو عملية عكسية وأن حويصلة بعد صدمة ناضح يتم تعبئتها بالعصبية عندما يتم إعادة وضع الخلايا في بيئة متساوي التوتر.

Introduction

الخلايا تشرومافين في الغدد الكظرية هي خلايا الغدد الصم العصبية أن الإفراج عن جزيئات الناقل العصبي في مجرى الدم. وهذا يحدث من خلال عملية الخلوية التي تنطوي على الالتحام والانصهار من حويصلات مملوءة بالعصبي، أسفرت عن الإفراج عن المحتوى من الحويصلات إلى الفضاء خارج الخلية في عملية تسمى الرقابة. العصبية (الأدرينالين ونورادرينالين) في الخلايا تشرومافين بنشاط تنقل عن طريق بروتينات الغشاء إلى حويصلات الأساسية كثيفة كبيرة (لدكفس) وتخزينها في تركيزات عالية (~0.5-1 م)1،2. يتم إنجاز تراكم العصبية داخل لدكفس بتقارب جزيئات الكاتيكولامينات إلى مصفوفة البروتين الأساسية كثيفة إينترافيسيكولار تتألف من تشروموجرانين البروتينات (~ 169 ملغ/مل)3،4،5 ،6، وحلا كوكتيل إينترافيسيكولار الذي يحتوي على المكونات الرئيسية لتخزين وتحميل الكاتيكولامينات إلى حويصلة مثل ATP (125-300 مم)7، Ca2 + (50-100 ميكرومتر في الحل ومم ~ 40 ملزمة مصفوفة البروتين)8، Mg2 + (5 ملم)9، اسكوربات (10-30 ملم)10، والرقم الهيدروجيني من ~5.511،12. لدكفس الحفاظ على شرط iso ناضح الخلية السيتوبلازم (310 موسم/كغ)13، على الرغم من أن تركيز ذائبة النظرية داخل الحويصلات مبلغ يصل إلى أكثر من 750 ملم. تكوين المكونات إينترافيسيكولار ليست فقط ضرورية لتحميل وتخزين الكاتيشولامين، ولكن أيضا لتجميع الذوائب لمصفوفة البروتين الأساسية كثيفة. وهذا يقلل كثيرا من الاسموليه الحويصلات انخفض انخفاضا كبيرا، ويمكن أن تؤثر على الكاتيكولامينات المبلغ تم إصداره من خلال الرقابة5،6.

وأفادت الدراسات عن تأثير الضغط الاسموزي خارج الخلية في عملية الرقابة عن طريق تسجيل أمبيروميتريك أن ارتفاع الضغط الاسموزي خارج الخلية يحول دون نشاط الرقابة، ويقلل من العدد من أجهزة الإرسال العصبية ويفرز من واحد حويصلة المقصورات4،،من1415،16،17،،من1819. تكهنت التفسيرات لهذه الملاحظات على تعزيز إمكانية مزاحمة الجزيئات في أحداث الانصهار حويصلة المثبطة الخلية السيتوبلازم، وتغيير في غشاء الخصائص الفيزيائية التي تؤثر على عدد أجهزة الإرسال العصبية صدر خلال الرقابة. هذه الأفكار يفترض أن ارتفاع الضغط التناضحي خارج الخلية لا يؤثر على حجم حويصلة كانتال، الذي يحدد عدد جزيئات العصبي المخزنة في حجرة حويصلة في المرحلة السابقة للرقابة المشغلة14، 15 , 17 , 19 , 20 , 21-في القياسات أمبيروميتريك للإفراج عن الرقابة في الخلايا المفردة، يوضع ميكروليكترودي قرص ألياف الكربون في اتصال وثيق مع سطح الخلية، إنشاء مجموعة تجريبية حتى محاكاة التكوين المشبك، حيث أمبيروميتريك بمثابة القطب22،بوستسينابتيك كاشف (الشكل 1)23. عن طريق تنشيط خلية للرقابة، واحد يمكن أن يستحث حويصلات مملوءة العصبي تلتحم مع غشاء بلازما الخلية والإفراج عن جزء أو محتوى حويصلة كاملة في الفضاء خارج الخلية. يمكن اكتشاف هذه الجزيئات العصبي صدر على سطح القطب اليكتروتشيميكالي العصبية في حالة اليكترواكتيفي (مثلاً، الكاتيشولامين) بتطبيق محتملة الأكسدة + 700 مقابل أم قطب مرجعي Ag/AgCl . ونتيجة لذلك، سلسلة من المسامير الحالية مناسبة الكشف عن أحداث الرقابة الفردية. من الحالي مقابل تتبع الوقت في تسجيل أمبيروميتريك بالمنطقة تحت كل سبايك أمبيروميتريك واحد يمثل المسؤول عن الكشف عن كل حدث الرقابة ويمكن تحويلها إلى الخلد العصبية في إصدارها، باستخدام المعادلة فاراداي. ومن ثم، تسجيلات أمبيروميتريك تقديم معلومات كمية عن العصبية المبلغ طردوا من أحداث الرقابة واحد وتقرير عن تواتر الأحداث الرقابة، لكن لا تقدم معلومات كمية عن الحويصلات الافرازية المحتوى قبل بدأ الإفراج عن الانصهار والعصبي حويصلة.

ولذلك، للحصول على فهم أفضل للحويصلات الافرازية كيف في الخلية السيتوبلازم يستجيب للضغط التناضحي خارج الخلية قبل أن يتم تشغيل الخلية على الخضوع للرقابة، يمكن استخدام أساليب تحليلية تكميلية أخرى لإثراء هذه المعلومات. على سبيل المثال، للتحقيق في حالة الإجهاد ناضح يغير حجم حويصلة، يمكن استخدام مجهر إلكتروني (TEM) التصوير تحليل لقياس حجم حويصلة من الخلايا بعد التثبيت الكيميائي. لفحص حالة الإجهاد ناضح يؤثر حجم حويصلة كانتال، يمكن تطبيق تقنية أمبيروميتريك المتقدمة مؤخرا تسمى الخلوي داخل الخلايا الكهروكيميائية، للتحديد الكمي لمحتوى العصبي حويصلة في الحويصلات الافرازية في هذه الدولة الأصلية عند الذين ما زالوا يقيمون في السيتوبلازم للخلايا الحية26. في تقنية الخلوي داخل الخلايا الكهروكيميائية، يتم إدراج قطب أسطواني ألياف الكربون نانوتيب برفق في السيتوبلازم للخلايا الحية، وعن طريق تطبيق محتملة أم + 700 لهذا القطب (مقابل Ag/AgCl مرجع قطب كهربائي)، محتوى الكاتيكولامينات في حويصلات يمكن قياسها كمياً بالكشف عن طفرة الأكسدة الحالية من حويصلات وحيد الاصطدام، أدسوربينج، ويمزق بعد ذلك ستوتشاستيكالي على سطح القطب وثم الإفراج عن محتوياتها ضد القطب السطحية26. ومن ثم في أمبيروميتريك الحالية مقابل تتبع الوقت، كل حدث rupturing حويصلة واحدة يمكن أن ينتج عابرة الحالية وعن طريق إدماج مجال كل المصطلحات الحالية، يمكن حساب حجم قوانتال حويصلة استخدام القانون Faraday´s.

ولذلك، من خلال ربط المعلومات الكمية المكتسبة من قياسات حجم حويصلة استخدام التصوير تيم جنبا إلى جنب مع تحليل حجم كانتال حويصلة، كما سجلتها الخلوي داخل الخلايا الكهروكيميائية، حويصلة العصبي تركيز يمكن أيضا يجب تحديد. وهذا يسمح توصيف حويصلة عندما تتعرض الخلايا لمختلف الظروف ناضح ويعطي فكرة أفضل عن كيفية حويصلات قد تستجيب للضغط التناضحي خارج الخلية في المرحلة قبل الرقابة. وقد أظهرت النتائج من الجمع بين هذه الأساليب أن حضور الضغط الاسموزي العالي خارج الخلية، حويصلات تقليص وضبط حجمها كانتال، ومقارنة المعلومات الكمية المتعلقة بالتغيرات النسبية من هذه القياسات تبين أن بينما تتقلص، حويصلات ضبط محتوياتها والحجم للحفاظ على تركيز عصبي مستمر24. وهكذا، هذا الفهم القيمة في الاتصال بالملاحظات التي أبديت على إطلاق سراح العصبي في الخلايا التي تتعرض للضغط التناضحي. في هذه البروتوكولات، يصف لنا استخدام هذه ثلاث منهجيات متكاملة تسمح بتوصيف الحويصلات الافرازية كيف في الرد على البيئة الأصلية ل osmolality خارج الخلية وآثار هذا الرد على الرقابة عملية. وبالإضافة إلى ملاحظاتنا السابقة فيما يتعلق بالتأثير ارتفاع الضغط الاسموزي على الرقابة24، نقدم المزيد من التجارب التي تصف خلية الإنعاش بعد صدمة ناضح وتأثير التحفيز الباريوم متعددة في تشرومافين الخلايا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-خلية ثقافة من الخلايا تشرومافين البقري معزول بواسطة الهضم الأنزيمي من الغدد الكظرية

  1. لعزل خلايا تشرومافين التي تم جمعها من الغدد الكظرية الأبقار، تعقيم الخلايا مع محلول إيثانول 70%. تقليم الدهون بعيداً والنسيج الضام استخدام مشرط. لإزالة الدم، شطف الأوردة الكظرية استخدام حل لوك (مم 154 كلوريد الصوديوم، بوكل 5.6 ملم، NaHCO3 3.6 مم، هيدروكسيثيل حمض بيبيرازينيثانيسولفونيك (هيبيس) 5.6 ملم على درجة الحموضة 7.4) التي تم ثيرموستاتيد إلى 37 درجة مئوية.
  2. لهضم الأنسجة، وتضخيم كل الغدة عن طريق حقن حوالي 2.5 مل من الحارة العقيمة التي تمت تصفيتها 0.2% كولاجيناز ف الحل عن طريق الأوردة الكظرية استخدام المحاقن واحتضان الأنسجة لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية. فحص الغدد التأكد من اكتمال عملية الهضم لب. يجب أن يشعر الأنسجة الناعمة وليست متوترة.
  3. جمع لب هضمها بالقص إيقاف الغدد في الاتجاه الطولي. فرم لب الأنسجة باستخدام مشرط. تصفية تعليق الأنسجة عبر غربال الصلب وتمييع مع حل لوك لحوالي 50 مل وحدة تخزين الحد من نشاط كولاجيناز ص
  4. بيليه الخلايا في 300 غرام x في أجهزة الطرد مركزي لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وجمع في أنابيب الاختبار 50 مل العقيمة. إعادة تعليق بيليه التي تم الحصول عليها في حل 20 مل لوك وتصفية الحل عبر شبكة نايلون معقمة 100-ميكرومتر في أنابيب.
  5. مزيج من تعليق خلية تشرومافين مع بركل العقيمة (1:1) والطرد المركزي حل الخلية في ز س 18,600 لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. جمع الطبقة العليا من التدرج الكثافة وتصفية الحل عبر شبكة نايلون 100 ميكرومتر في أنابيب.
  6. لاستبعاد بركل، تمييع تعليق خلية مع حل لوك وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة قبل إعادة تعليق بيليه في الحل لوك. كثافة الخلية المقدرة بتعليق خلية معزولة حوالي 4 مليون خلايا/مل.
  7. لتسجيل أمبيروميتريك للرقابة والقياسات الخلوي داخل الخلايا، خلايا الكولاجين الرابع chromaffin لوحة مغلفة بأطباق بلاستيكية ملم 60 في كثافة حوالي 17.5 × 103 خلايا/سم2 واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في شركة 5%2 البيئة. القيام بتجارب الكهروكيميائية في 1-3 أيام زراعة الخلايا.
  8. تيم التصوير تجارب، لوحة خلايا تشرومافين في 75 سم2 خلية ثقافة قوارير في كثافة الخلايا 7 مليون في قارورة واحتضان عند 37 درجة مئوية في بيئة2 CO 5% لمدة يوم واحد.

2-وحيد الخلية الرقابة أمبيروميتري تجارب24

  1. اختﻻق ميكروليكتروديس ألياف الكربون لهذه التجارب، تأخذ كأسه الشعرية مع قطر خارجي مناسبة لصاحب القطب في مرحلة الرأس التي سيتم استخدامها في هذه التجارب. استخدام الشعرية زجاج البورسليكات قطر خارجي من 1.2 مم وقطر داخلي ل 0.69 ملم.
    1. قم بتوصيل أحد طرفي الشعرية أنبوب الشفط مياه. ضع 5 ميكرومتر قطر ألياف الكربون على شيء ما، مثل قطعة من الورق الأبيض، تعزيز التصور.
    2. التعرف واحد من ألياف الكربون وابق الألياف في نهاية واحدة بأصبع لإبقاء ألياف الكربون في المكان في حين وضع نهاية مفتوحة شعري بالقرب من نهاية الحرة من ألياف الكربون. بلطف نضح ألياف الكربون في الزجاج الشعرية حيث أن ألياف الكربون التي تتمسك بها من خلال طرفي شعري. تبتعد قوة الطموح.
  2. ضع شعري مع ألياف الكربون إلى ساحبة ميكروبيبيتي وسحب الزجاج الشعرية في نصائح ماصة زجاجية منفصلة اثنين. لفصل ألياف الكربون متصل بين نصائح الزجاج اثنين، استخدام مقص لقطع الألياف الكربونية والحصول على اثنين من ألياف الكربون ميكرويليكتروديس.
  3. تحت مجهر، ضع ألياف الكربون على أعلى شريحة مجهر سمكا يسمح القطع اليدوي من ألياف الكربون في الحافة من حيث هو تمديد الألياف من الطلاء الشعرية من الزجاج باستخدام مشرط.
  4. بعد قطع ألياف الكربون، ترك تلميح ألياف الكربون المغلفة بزجاج، إدراج عدد قليل مم من طرف القطب حلاً الإيبوكسي لمدة 10 دقيقة سحب ما يصل الإيبوكسي وختم أي مساحة مفتوحة ممكن بين ألياف الكربون والزجاج المحيطة بها. رفع الأقطاب ببطء خارج الحل الإيبوكسي للحيلولة دون تشكيل في غيض مسرى قطرات الغراء ضخمة.
  5. وضع أقطاب كهربائية على حامل (مثلاً، عصا خشبية مسطحة) مع الجانب سنتين لزجة الشريط المقاوم للحرارة التي يمكن أن تعلق أقطاب. خبز أقطاب الإيبوكسي تعامل بين عشية وضحاها في فرن عند 100 درجة مئوية. مسرى نصائح كسر بسهولة إذا كانت تتلامس مع سطح، حتى تضمن أقطاب كهربائية مخزنة دائماً بأمان باستخدام حامل فيها أقطاب كهربائية ثابتة في مكان ونصائح لا خطر يجري التطرق.
  6. للحصول على سطح قطب قرص مسطح، ضع مسرى في حائز ميكروجريندير وشطب كل قطب من ألياف الكربون في ملاكا 45 °. بعد الميلا، علامة شعري على ظهر المركب استخدام علامة دائمة لمعرفة كيفية تحديد موقع القرص سطح القطب بزاوية 45 درجة عند وضع قطب كهربائي القرب من الخلايا لقياس الرقابة في وقت لاحق.
    ملاحظة: هذه الخطوة مهمة كما هو الحال في هذه التجارب، ومسرى القرص البيضاوي يجب أن يوضع شقة أعلى الخلايا مع التوازي السطحية على سطح طبق بيتري. أيضا، يتم الشطف أقطاب في اليوم نفسه كتجارب لضمان سطح قطب طازجة ونظيفة.
  7. قبل الاستخدام، ضع كل ميكرويليكترودي ألياف الكربون في حل اختبار (مثلاً، الدوبامين 0.1 ملم في المخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني (درجة الحموضة 7.4)) لرصد حالة مستقرة حاليا استخدام فولتاميتري دوري. لمسح دوري فولتاميتري، تطبيق الموجي مثلث محتملة من-0.2 الخامس إلى +0.8 الخامس مقابل يتم الحصول عليها قطب مرجع Ag/AgCl في أم 100/ثانية لضمان رد فعل جيد حركية البيانات التي يتم باﻻتفاق مع القيم المحسوبة نظرياً لقرص قطره 5 ميكرومتر ألياف الكربون ميكروليكترودي25.
  8. لتسجيل أمبيروميتري للرقابة، ضع طبق بيتري مع مثقف خلايا تشرومافين إلى مجهر مقلوب. من المهم أن درع المجهر إعداد مع قفص فاراداي للقضاء على الضوضاء الإلكترونية أثناء أمبيروميتري التسجيل، وسبب يجري قياس التيارات الصغيرة جداً. استخدام مجهر تدفئة المرحلة للحفاظ على درجة حرارة 37 درجة مئوية أثناء تجارب الخلية.
  9. استخدم أداة المشبك منخفضة الضوضاء تصحيح لتطبيق محتملة مستمر من + 700 أم في مسرى العامل مقابل قطب كهربائي مرجع Ag/AgCl يوضع أيضا في طبق بتري بعيداً عن مسرى العامل. لتسجيل الرقابة من الخلايا تشرومافين، رقمنة الإشارة الساعة 10 كيلوهرتز وتنطبق تمرير منخفض داخلية تصفية بيسل في 2 كيلو هرتز إلى تصفية الإشارات المسجلة.
  10. لإجراء أمبيروميتريك تسجيل في الخلايا المفردة، جبل ميكروليكترودي القرص ألياف الكربون طازجة مشطوف واختبارها في حامل القطب المرحلة الرأس التي يتم استخدامها مع بوتينتيوستات.
    1. بلطف ضع مسرى مع القرص مسطحة بيضاوية الشكل القطب السطحية أسفل نحو سطح الخلية قمي ثم ضع مسرى على اتصال بغشاء الخلية باستخدام ميكرومانيبولاتور.
    2. ضبط المسافة بين مسرى الخلية برصد تشوه الخلية الناجمة عن مسرى عند موضع رأس غشاء الخلية، وثم بعناية سحب مسرى إلى مسافة حيث تستعيد الخلية شكل قريب من شكله الأصلي في الخلية . هو المثل الأعلى لتسجيل الكمية والحركية لخلق طبقة رقيقة سائلة من مائة نانومتر للفصل بين سطح القطب، والخلية، وظروف مشابهة للكشف عن بوستسينابتيك للإفراج عن المواد الكيميائية في المشبك.
  11. لتحفيز الخلايا للرقابة، موقف ميكروبيبيتي زجاج مع حجم تلميح من 2-3 ميكرومتر القطر، مليئة بحل 5 مم BaCl2 على مسافة على الأقل 20 ميكرومتر بعيداً عن الخلية، لمنع أي حل تسرب من طرف الماصة للتأثير تجربة وتطبيق نبضة حقن s 5 5 مم BaCl2 الحل على سطح الخلية لتنشيط الخلية للرقابة.
  12. لدراسة آثار عكسية من الضغط الاسموزي في عملية الرقابة، تعد حلاً عازلة متساوي التوتر (150 مم كلوريد الصوديوم، 5 ملم بوكل، 1.2 mM MgCl2، الجلوكوز 5 مم، 10 مم حبيس، درجة الحموضة 7.4) مع ضغط iso ناضح موسم/كغ 310 ومكثف المخزن مؤقت بواسطة ضبط تركيز كلوريد الصوديوم الحل العازلة متساوي التوتر مع أوسمولاليتي المقابلة لموسم 730/كغ.
  13. وضع الخلايا في المخزن المؤقت متساوي التوتر وتنشيط الخلية للرقابة عن طريق تطبيق نبضة حقن باريوم أثناء تسجيل العابرين الحالية أمبيروميتريك أثناء نشاط الرقابة بدأت لحوالي 3 دقائق.
    1. لمقارنة الردود الرقابة في ظروف متساوي التوتر لظروف مكثف، احتضان الخلايا لمدة 10 دقيقة في حل العازلة مكثف وبعد تطبيق نبضة حقن باريوم تحفيز الرقابة وتنفيذ 3 دقيقة لتسجيل أمبيروميتريك.
    2. لاستجابة الخلايا عكسها، احتضان خلايا مرة أخرى لمدة 10 دقيقة في محلول متساوي التوتر المخزن المؤقت وحفز الخلايا عن طريق تطبيق 5s حقن الباريوم النبض وأداء 3 دقيقة لتسجيل الاستجابة الرقابة من الخلية.
  14. كما إجراء تجارب التحكم تحديد أثر على نشاط الرقابة عن طريق التحفيز الباريوم متعددة، على تسجيل أمبيروميتريك للإفراج عن الرقابة من ثلاثة متتالية BaCl2 التحفيز على نفس الخلية وضعها في المخزن المؤقت متساوي التوتر و باستخدام بروتوكول الوقت نفسه لتجارب الاحتضان الخلية على التوالي مع الاسموليه مختلفة.

3-داخل الخلايا الكهروكيميائية الخلوي24،26

  1. لاختلاق أقطاب لقياسات حجم كانتال حويصلة، استخدام نفس المواد والبدء في إعداد من 5 ميكرومتر في القطر القطب ألياف الكربون وفقا للوصف في الأقسام 2-1 و 2-2 من تصنيع ميكروليكترودي للرقابة أمبيروميتريك القياسات.
  2. تحت مجهر، استخدام مشرط لقطع تمتد ألياف الكربون من طرف الزجاج حيث أن يترك ألياف الكربون بطول يتراوح من 30 إلى 100 ميكرون تخرج من طرف الزجاج.
  3. لإعداد تلميح لهب محفور القطب ألياف الكربون، استخدم لهب غاز بوتان. لتحقيق محفوراً بالتساوي، نصيحة القطب على شكل أسطواني، اضغط مسرى ألياف الكربون على شكل أسطواني أثناء التناوب ومكان ألياف الكربون تمتد من الزجاج إلى حافة الأزرق للهب غاز البوتان حتى يطور غيض الكربون أحمر اللون. وهذا عادة ما يستغرق أقل من 2 ثانية. وفي حالة نجاح هذه النتائج في حجم تلميح قطب محفوراً 50-100 نانومتر في القطر (صورة وزارة شؤون المرأة لهذا تلميح يظهر في الشكل 5ب). بعد لهب النقش، ضع تحت مجهر لتقييم تلميح القطب الكهربائي.
  4. إدراج ميكروليكترودي نانوتيب أسطواني في حل الإيبوكسي لمدة 3 دقيقة تليها من 15 s تستنزف من طرف القطب حلاً الأسيتون. وهذا ما يسمح الإيبوكسي لختم مساحة الفجوة المحتملة بين ألياف الكربون ويعزل الجدار الزجاجي الشعرية، بينما يمسح الأسيتون الإيبوكسي قبالة سطح القطب محفوراً من ألياف الكربون. لعلاج الإيبوكسي، خبز أقطاب كهربائية في فرن بين عشية وضحاها في 100 درجة مئوية.
  5. قبل الاستخدام، اختبار الحالي حالة ثابتة لكل ميكروليكترودي من ألياف الكربون، كما هو موضح في المقطع 2.7 باستخدام فولتاميتري دوري. لإجراء تجارب عليها، فقط استخدام الأقطاب الكهربائية التي تعرض هضبة الحالية حول 1.5-2.5 غ27.
  6. للقياسات أمبيروميتري بين الخلايا، ووضع الخلايا في المجهر كما هو موضح في 2.8 واستخدام نفس إعدادات التجريبية من بوتينتيوستات كما هو موضح في 2-9.
  7. للقيام بقياس أمبيروميتريك داخل الخلايا، ومنع الأضرار المادية الكبيرة للخلية، أدخل ميكرويليكترودي أسطواني نانوتيب في الخلية بإضافة ميكانيكية لطيف القوة، ما يكفي لدفع الكهربائي عن طريق خلية البلازما الغشاء وفي السيتوبلازم الخلية باستخدام ميكرومانيبولاتور.
  8. بعد الإدراج، ومع غشاء الخلية مختومة حول قطب أسطواني، بدء التسجيل أمبيروميتريك في الموقع في الخلية الحية. في الأكسدة المحتملة التي يتم تطبيقها على مسرى، سوف الجسميات على سطح القطب حويصلات وتمزق ستوتشاستيكالي.  ومن ثم فليس هناك حاجة لأي نوع من التحفيز الشروع في هذه العملية.
  9. لتحديد مدى تأثير ناضح على حجم حويصلة كانتال، جمع القياسات الخلوي داخل الخلية من مجموعة من الخلايا التي قد تم المحتضنة في متساوي التوتر ومكثف المخزن المؤقت باستخدام الشرط التجريبية كما هو موضح في المقطع 2.13.

4-بيانات تحليل تسجيلات أمبيروميتري

  1. تحليل البيانات أمبيروميتري مسجل من الرقابة وتحليل حجم كانتال حويصلة داخل الخلايا، باستخدام برنامج حاسوبي يسمح تحليل العابرين الحالية الحالية مسجل مقابل تتبع الوقت حتى أن الحركية معلمات الذروة ويمكن تحديد التهمة مجموع متكامل للقمم الفردية الحالية. لتحليل البيانات، وقد استخدمنا البرامج المطورة في مختبر Sulzer تمت كتابته لبرنامج تحليل البيانات إيغور28.
  2. عند تحليل أمبيروميتريك المسامير، حدد حد عتبة لقمم ثلاث مرات جذر متوسط مربع (RMS) الانحراف المعياري للضوضاء لكل تسجيل.
  3. جمع المسامير أمبيروميتريك من كل خلية التسجيل يدوياً لمنع التموج الكاذبة التي لا تتبع الشكل الضبابي، ومضاعفة المسامير التي يمكن نتيجة لإحداث الرقابة المدمجة، وإلا يقبل المسامير على شكل ضبابي مع الحد الأدنى لثلاث مرات أعلى من ضجيج RMS.
  4. جمع البيانات عن مجموع رسوم أمبيروميتريك واحد ذروته واستخدام قانون فاراداي (N = كنف) لحساب مقدار ضرس العصبي الكاتيكولامينات الكشف عن كل الرقابة أو حدث تمزق حويصلة واحدة داخل الخلايا، حيث أن N هو جزيئات من العصبية في الذهاب من خلال فعل الأكسدة والاختزال في سطح القطب، ف = المسؤول عن مجموع الكشف عنها تحت كل سبايك، ن = عدد الإلكترونات المنقولة في تفاعل الأكسدة والاختزال (n = 2 الكاتيشولامين)، و Faraday´s المستمر و = 96485 ج/مول.
  5. إجراء التحليل الإحصائي للبيانات المجمعة من أول حساب المسؤول عن متوسط الكشف عن كل حدث لكل خلية. ثم الفرق بين الخلايا، حساب المسؤول عن المتوسط بين الخلايا واستخدام الاختبار t للطالب بين الخلايا افتراض تباين غير متكافئة. استخدمت هذه الدراسة برنامج MATLAB للتحليل الإحصائي.

5-تيم تصوير لتحليل حجم حويصلة

  1. أولاً القيام بتصوير تيم للخلايا في مختلف الظروف ناضح، احتضان الخلايا الموجودة في المخزن المؤقت متساوي التوتر أو مكثف لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية في بيئة 5%2 CO قبل التثبيت الكيميائي للخلايا.
  2. إجراء تثبيت الخلية باستخدام الأسلوب مثبت كارنوفسكي29. باستخدام هذا الأسلوب، احتضان الخلايا مع محلول يحتوي على أزيد الصوديوم 0.01% و 1% فورمالدهايد 1.25 ٪ glutaraldehyde التي يمكن تخزينها العينة في 4 درجات مئوية.
  3. بعد التثبيت، غسل الخلايا مع المخزن المؤقت كاكوديلاتي الصوديوم 0.15 متر.
  4. لوصمة عار الخلية عينات بعد التثبيت، وفي التحضير لل التصوير، احتضان الخلايا مع حل أكسيد أوزميوم 1% ح 2 في 4 درجات مئوية، تليها الحضانة ح 1 في خلات اليورانيل 0.5% عند درجة حرارة الغرفة في الظلام.
  5. وفي خطوة تثبيت نهائي، يذوي الخلايا أولاً بدهن الخلايا الموجودة في الإيثانول 100% وشطف ثم الخلايا مع الأسيتون.
  6. تضمين عينات الخلايا في ابوكسيريسين وبعد ذلك إجراء الطرد المركزي في 4,000 س ز لمدة 30-40 دقيقة ويسمح نموذج الخلية بلمرة عند 40 درجة مئوية ل 15 ح متبوعاً بحضانة 48 ساعة في 60 درجة مئوية.
  7. استعدادا للتصوير، مضمن قسم العينة الخلية في الراتنج 100 أجار إلى شرائح بسمك 60 نانومتر باستخدام أولتراميكروتومي.
  8. تخضع الخلايا لحل إيثانول acetate/25% اليورانيل 4% لمدة 4 دقيقة تليها 20 ثانية من الشطف بالماء. تغسل الخلايا مع سترات الرصاص رينولدز ل 3 دقيقة، تليها 20 ثانية من الشطف بالماء.
  9. إجراء انتقال تصوير المجهر الإلكتروني لعينات الخلايا. في تجاربنا، وقد استخدمنا مجهر إلكتروني إرسال التي قد تم تشغيلها في 120 كيلوفولت.
  10. من كل صورة مسجل قسم الخلية التي توضح أولتراستروكتوري الخلية التي تعرض عدد من الحويصلات في السيتوبلازم الخلية، أولاً معايرة حجم بكسل الصورة التي تتصل بكسل شريط مسجل النطاق في كل صورة تيم. استخدام برامج التصوير لتحديد أحجام حويصلة في كل صورة للخلايا التي تتعرض لظروف متساوي التوتر أو مكثف. في تجاربنا، علينا استخدام برنامج إيماجيج لتحليل الصور. تجدر الإشارة إلى أن تعديل حجم هذه القياسات على أساس سمك أقسام الخلية لتحليل الصور من أولتراستروكتوري الخلوية من صور تيم للخلايا، يحتاج إلى النظر، وقد وصف سابقا Almers´s مختبر30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ونحن هنا وصف البروتوكول لكيفية الجمع بين تصوير تيم جنبا إلى جنب مع اثنين من منهجيات الكهروكيميائية، أمبيروميتري ألياف الكربون والخلوي داخل الخلايا الكهروكيميائية، يمكن أن توفر المعلومات التي تكتسب رؤية أوسع نطاقا في إشارة إلى تأثير الضغط الاسموزي خارج الخلية في عملية الرقابة والحويصلات الافرازية. بمقارنة التسجيلات أمبيروميتريك الممثل للإفراج عن الرقابة في الخلايا تشرومافين واحد باستخدام التجريبية إعداد (هو مبين في الشكل رقم 1)، انخفاض كبير في النشاط اكسوسيتوتيك تم عرضها عند تعرض الخلايا إلى ناضح التشديد بالمقارنة مع الخلايا في ظروف متساوي التوتر (الشكل 2A)24. من هذه التسجيلات وباستخدام القانون Faraday´s، المسؤول عن مجموع يكشفها كل أمبيروميتريك الفردية الحالية استخدمت المصطلحات الخاصة لحساب عدد جزيئات طردوا من حويصلة واحدة الرقابة الأحداث في الخلايا التي تتعرض لمختلف ناضح شروط. وعلى سبيل المقارنة، كما يظهر في الشكل 2 بمنطقة أصغر من أمبيروميتريك المتوسط الحالي سبايك الكشف عنها بواسطة الخلايا في حل مكثف، أطلق سراح أقل العصبي جزيئات من كل حويصلة من الخلايا استشعار الضغط التناضحي24 .

لتحديد إمكانية الرجوع لهذا الانخفاض في عدد الجزيئات العصبي صدر، أجرينا التسجيلات أمبيروميتريك للرقابة في الخلايا المعرضة لبيئة مكثف، وفي وقت لاحق، في الخلايا بعد وضع مرة أخرى في متساوي التوتر البيئة. في هذه التجارب، وحفز الخلايا تشرومافين ثلاث مرات متتالية مع BaCl2 الحل: أولاً في مخزن مؤقت متساوي التوتر، تليها حفز ثانية بعد أن كانت المحتضنة الخلايا لمدة 10 دقيقة في حل مكثف، وأخيراً، ثالث التحفيز بعد 10 دقيقة خلية حضانة في ظروف متساوي التوتر. النتائج كما هو معروض في الشكل 3A الحالي تم تقليل كمية العصبية صدر ~ 50% عند تعرض الخلايا للشرط مكثف مقارنة با2 + تنشيط الأولى في حالة متساوي التوتر. بعد ذلك، عند الخلايا كانت العودة إلى بيئة متساوي التوتر وإخضاعها لثالث با2 + التحفيز، كان عكس العصبي المبلغ الإفراج عن كل حدث الرقابة مرة أخرى إلى المبلغ الأصلي لتسجيلها في تحفيز الأولى، التي وأكدت الملاحظات السابقة14. تجارب التحكم مع ثلاثة با2 + التحفيز المتعاقبة من الخلايا في حالة متساوي التوتر (انظر الشكل 3) تبين أن با2 + التحفيز تسلسلية متعددة في ظروف متساوي التوتر لم يغير العصبي المبلغ صدر من خلال الرقابة. وهذا يوحي بأن حويصلة قوانتال يتم بسرعة وبشكل قابل للعكس ضبط حجم مع الاسموليه خارج الخلية.

ومع ذلك، عند تحليل آثار أمبيروميتريك من هذه التجارب فيما يتعلق بأنشطة الرقابة، أصبح من الواضح، كما هو معروض في الشكل 4A، أن نشاط الرقابة أعيقت إلى حد كبير عندما تتعرض الخلايا لضغط مكثف. أثناء الإجهاد ناضح، خفضت الرقابة الأحداث إلى 12 في المائة النشاط في الخلايا في حالة متساوي التوتر. في وقت لاحق، بعد صدمة ناضح وخلايا وضعت مرة أخرى في بيئة إيسوسموتيك، استعاد الخلايا 41% نشاطها الرقابة الأصلي. من المثير للاهتمام، تجري تجارب التحكم في ظروف متساوي التوتر أظهرت، كما هو معروض في الشكل 4 باء، أنه بعد إجراء ثلاثة متتالية التحفيز BaCl2، خفض تواتر الأحداث الرقابة إلى 53% بعد حفز الثانية وكذلك وصولاً إلى 26% بتحفيز الثالثة مقارنة بتحفيز الأولى. ومن ثم، فمن الواضح أن با2 + التحفيز على التوالي لا يبدو أن تؤثر على عدد العصبية في الإفراج عن كل حويصلة عندما يتم تشغيل الرقابة، ولكن هو التأثير إلى حد كبير على كفاءة عملية الإفراج عن حويصلة.

للتحقيق في الحويصلات الافرازية كيف في بيئتها الأصلية تتأثر بالإجهاد ناضح خارج الخلية من حيث حجم حويصلة أو قوانتال الحجم، حويصلة حجم التحليل باستخدام التصوير تيم كان جنبا إلى جنب مع الخلوي داخل الخلايا الكهروكيميائية في الخلايا تتعرض لظروف متساوي التوتر ومكثف. في التجارب داخل الخلايا الكهروكيميائية الخلوي، قطب نانوتيب ألياف الكربون تم إدراجه في السيتوبلازم الخلايا تشرومافين يعيش عند وضعه في محلول متساوي التوتر ومكثف (كما هو موضح في الشكل 5.) وتم رصد المصطلحات الحالية أمبيروميتريك الناتجة من كل حويصلة في السيتوبلازم الخلية الاصطدام، وأدسوربينج، وستوتشاستيكالي يمزق والإفراج عن محتويات حويصلة على سطح القطب أمبيروميتريك عند انفجار26. المسؤول عن مجموع المتكاملة الكشف عن كل ذروة الحالية مقابل تتبع الوقت استخدمت لحساب حجم متوسط حويصلة كانتال في كل خلية التسجيل بموجب القانون Faraday´s. هذه القياسات داخل الخلايا الكهروكيميائية الخلوي، هو موضح في الشكل 6 و الشكل 7B، أظهرت أن حجم كانتال حويصلة في الخلايا المعرضة للإجهاد ناضح خفضت إلى حد كبير مقارنة في الخلايا في ظروف متساوي التوتر. مقارنة حجم التغيير في حويصلة كانتال الحجم مقاسا بالخلوي الكهروكيميائية داخل الخلايا، إلى انخفاض كمية العصبي صدر أثناء الرقابة على الخلايا التي تعاني من الإجهاد ناضح خارج الخلية كسرى ، وأظهرت انخفاض نسبي من 60 في المائة في حجم قوانتال والعصبي المبلغ صدر مقارنة في الخلايا في ظروف متساوي التوتر (الشكل 7)24. تتصل بالتكيف في حويصلة كانتال حجم اختلاف محتملة في تركيز حويصلة العصبي للخلايا التي تعاني من الضغط التناضحي، أجرى تحليل الصورة تيم لتحديد حجم حويصلة الخلايا المعرضة متساوي التوتر ومكثف شروط. وعلاوة على ذلك، استخدمت تلطيخ الظلام مصفوفة البروتين الأساسية كثيفة داخل لدكفس الذي هو تصور في الصور تيم ملزمة مجال مظلمة في الغشاء الحويصلات لقياس حجم المصفوفة الأساسية كثيفة في هذه الحويصلات. كما عرضت في الشكل 8، تم تخفيض حجم حويصلة إلى 60% في الخلايا التي تتعرض للضغط التناضحي خارج الخلية مقارنة في الخلايا في ظروف متساوي التوتر. من حجم القطر يقاس لدكف ولب كثيفة المحسوبة، حجم الحل الهالة المحيطة بها التي تظهر كما حسبت أيضا التوصل إلى حل واضح داخل لدكفس في الصور ال. وأظهرت النتائج الملخصة من تحليل الصورة تيم، كما يظهر في الشكل 8، أنه أثناء الصدمة ناضح خارج الخلية أساسا تخفيض حجم هالة الحل في لدكفس هو24.

Figure 1
الشكل 1 : خلية مفردة الرقابة أمبيروميتري- الخلايا تخطيطي لإعداد تجريبية لقياس أمبيروميتريك للرقابة في واحد تشرومافين24. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2: آثار أمبيروميتريك من قياسات الرقابة. A (أ) تسجيل أمبيروميتريك ممثل للرقابة في خلايا تشرومافين في متساوي التوتر (اللون الأسود) وفي بيئات خارج الخلية مكثف (اللون الأحمر). (ب) توسيع ارتفاع متوسط أمبيروميتريك من قياس الرقابة من الخلايا تشرومافين في متساوي التوتر (أسود) ومكثف في بيئات خارج الخلية (أحمر)24. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : عكس عدد من الكاتيشولامين صدر في الرقابة بعد صدمة ناضح. (A) عدد الجزيئات صدر خلال الرقابة من الخلايا تشرومافين (n = 4) بثلاثة متتالية با2 + التحفيز، مع تحفيز أول في متساوي التوتر، والثانية في مكثف، والثالث في المخزن المؤقت متساوي التوتر. يتم إظهار النتائج الإحصائية للاختبار t مزاوج. قيمة p-بمقارنة لأول با2 + التحفيز (با2 + stim 1) في المخزن المؤقت متساوي التوتر مع الثانية با2 + التحفيز (با2 + stim 2) في المخزن المؤقت مكثف p= 0.1088 و فقيمه مقابل مقارنة الثانية با2 + التنشيط في الحل مكثف مع الثالث با2 + التحفيز (با2 + stim 3) في المخزن المؤقت متساوي التوتر هو p = 0.059. (ب) مراقبة التجربة تثبت مقدار الجزيئات العصبي أطلقت با2 + التحفيز على التوالي ثلاث خلايا تشرومافين (n = 4) في المخزن المؤقت متساوي التوتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4 : تأثير الضغط الاسموزي على نشاط الرقابة. (A) ويرد أثر الاسموليه خارج الخلية على نشاط الرقابة كتواتر الأحداث الرقابة عند تشرومافين الخلايا (n = 4) تحفز بمحلول الباريوم في متساوي التوتر، ثم مكثف، وأخيراً في ظروف متساوي التوتر. يتم عرض القيم كمتوسط عدد المسامير من كل خلية وعينات المتوسط من كافة الخلايا (الخطأ المعياري للوسط (SEM)). ويرد دلالة إحصائية للتغييرات باستخدام اختبار t للبيانات مزاوج (قيمة p-متساوي التوتر با2 + التحفيز 1 ومكثف با2 + التحفيز 2 ف= 0.0126 و فقيمه لمقارنة مكثف با2 + التحفيز 2 ومتساوي التوتر با2 + التحفيز 3 p= 0.037). (ب) مراقبة تجربة تقديم تواتر الأحداث الرقابة بعد ثلاث متتالية الباريوم التحفيز في الخلايا تشرومافين (n = 4) في ظروف متساوي التوتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الشكل 5 : الخلوي حويصلة داخل الخلايا الكهروكيميائية لرصد التغيرات في حجم قوانتال حويصلة. (أ) تخطيطي لإعداد المستخدمة للخلوي داخل الخلايا الكهروكيميائية التجريبية. (ب) صورة الميكروسكوب الإلكتروني المسح ضوئي ل القطب ألياف الكربون المخروطية نانوتيب نموذجي24. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
الرقم 6 : الخلوي داخل الخلايا الكهروكيميائية قياسات عرض (أ) آثار الممثل لتسجيلات الخلوي أمبيروميتريك داخل الخلايا في الخلايا تشرومافين في متساوي التوتر (أسود) ومكثف في بيئات خارج الخلية (أحمر). (ب) توسيع ارتفاع متوسط أمبيروميتريك من القياس الخلوي داخل الخلية في الخلايا تشرومافين في متساوي التوتر (أسود) ومكثف في بيئات خارج الخلية (أحمر)24. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 7
الشكل 7 : التحديد الكمي لعدد الكاتيشولامين صدر في الرقابة وتحديد حجم حويصلة كانتال- (أ) متوسط عدد جزيئات صدر خلال تسجيلات الرقابة في خلايا تشرومافين في متساوي التوتر (n = 22) ومكثف (n = 20) البيئات. يتم عرض القيم كعدد متوسط من جزيئات الإفراج عن كل حدث الرقابة من كل خلية وبلغ من عينات الخلايا (± SEM). وترد الدلالة الإحصائية للتغييرات باستخدام الاختبار t للبيانات مزاوج (فالقيمه = 0.0003) (ب) متوسط عدد جزيئات كل حويصلة كما الكشف عنها بواسطة الخلوي داخل الخلايا الكهروكيميائية في الخلايا تشرومافين في متساوي التوتر (n = 19) ومكثف (n = 16) الظروف. القيم المقدمة كمتوسط عدد جزيئات كل المصطلحات الخاصة كما يتم الكشف عن كل خلية وبلغ من كافة الخلايا عينات (± SEM). ويرد دلالة إحصائية للتغييرات باستخدام الاختبار t للبيانات مزاوج (p- القيمة = 0.0108)24. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 8
الشكل 8 : تأثير الضغط الاسموزي على حجم حويصلة الأساسية كثيفة كبيرة- تم حساب حجم المحسوبة لدكفس والبروتين الأساسية كثيفة والحل الهالة المحيطة بمصفوفة البروتين الأساسية كثيفة في أتوليتريس (ال) من تحليل الصور صور تيم للخلايا تشرومافين في متساوي التوتر (n = 12) ومكثف (n = 9) المخازن المؤقتة. النتائج التي جمعت من حويصلات 311 كل خلية في متوسط والمتوسطات من خلايا مفردة (± SEM). ترد القيم من مزاوج تي--اختبارات مقارنة المخازن المؤقتة متساوي التوتر ومكثف. فالقيمه هي 0.0385 (*) لحجم حويصلة، 0.3967 لوحدة التخزين الأساسية كثيفة، 0.0047 (*) لهالة حجم24. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

نقدم هنا بروتوكولا ومزايا الجمع بين ثلاثة أساليب تحليلية تكميلية لتحليل الحويصلات الافرازية وعملية الرقابة للحصول على فهم أفضل لكيف يمكن أن يؤثر على قوة مادية مثل الضغط التناضحي الحويصلات الافرازية وفي عملية الرقابة في الخلايا الافرازية. وتشمل هذه الأساليب أمبيروميتري ميكروليكترودي ألياف الكربون، وهي طريقة ثابتة لتسجيل نشاط الرقابة، الخلوي داخل الخلايا الكهروكيميائية، الذي يستخدم لتحديد حجم كانتال من حويصلات في بيئتها الأصلية، و نقل تحليل الصور الميكروسكوب الإلكتروني لرصد حجم حويصلة افرازية. في هذا العمل، بجمع البيانات الكمية من تسجيلات أمبيروميتري حويصلة واحدة الرقابة الأحداث في الخلايا تشرومافين يتعرضون متساوي التوتر وبيئة خارج الخلية مكثف، أكدنا أن صدمة ناضح يقلل بشكل ملحوظ الإفراج عن مبلغ العصبية خلال الرقابة وأن هذه الخلايا يمكن استرداد عكسية والإفراج عن الكمية الأصلية، إذا وضعت مرة أخرى في بيئة متساوي التوتر (الشكل 3).

تسجيلات أمبيروميتريك معلومات من تواتر الأحداث الرقابة مقابل الوقت وذلك يمكن أيضا استخدامها لرصد التغيرات في نشاط الرقابة على الخلايا في مختلف البيئات ناضح. يمكن تفسير هذه البيانات واستخدامها لتبين ما إذا كانت التعديلات في نشاط يحدث على الفور أو كدالة للزمن. وكما أظهرنا في الأعمال السابقة، على الرغم من أن الإجهاد ناضح يعرقل النشاط اكسوسيتوتيك، فإنه لا يبدو تعوق الانصهار تجمع سهولة يمكن نشرة من حويصلات24. يمكن أيضا استخدام بيانات نشاط الرقابة لتحليل إجمالي نشاط اكسوسيتوتيك خلال فترة التسجيل. نقدم هنا تراكم عدد الأحداث الرقابة من تسجيل 3 دقائق للرقابة في خلايا تشرومافين التي تتعرض لظروف ناضح مختلفة اثنين. وتشير هذه البيانات تثبيط نشاط الرقابة من الخلايا التي تعاني من الإجهاد ناضح وأنه يمكن تحقيق انتعاش جزئي لهذا النشاط بعد الخلايا العودة إلى بيئة متساوي التوتر خارج الخلية. لكن الأهم من ذلك، أظهرت تجارب التحكم أن با2 + التحفيز متعددة داخل الإطار الزمني المستخدمة في هذه التجارب الناجمة عن انخفاض كبير في نشاط الرقابة وقت كل خلية وحفز لإفراز. الثالثة على التوالي با2 + التحفيز، سوى ثلث نشاط الرقابة وأبقى على، ومن الواضح الباريوم، وربما أيضا توقيت التحفيز في هذه التجارب، كان يؤثر على دورة حويصلة. وهذا قد يكون مناسباً لشرح لماذا تم استرداد النشاط اكسوسيتوتيك في الخلايا التي توضع في محلول متساوي التوتر بعد الصدمة ناضح وماذا عرض هذه الخلايا تخفيض نسبي مماثل في النشاط مقارنة مع الخلايا في ظروف متساوي التوتر بعد ثلاثة با المتسلسلة2 + التحفيز. ومن ثم تسجيل أمبيروميتري للرقابة ويقدم معلومات عن الحويصلات الافرازية من لحظة الحويصلات يتم تشغيلها للصمامات مع غشاء البلازما، الإفراج عن أجهزة الإرسال العصبية من خلال المسام الانصهار. وبالتالي الإفراج عن البيانات الكمية في العصبي حويصلة واحدة ويمكن أن تجمع المعلومات عن نشاط الرقابة.

يمكن أن تنظم كمية العصبي صدر بطريقة الرقابة التي يتم تشغيلها، حيث يتم تحرير محتوى حويصلة كامل أو جزء من المحتوى. بحسب دراسة الإفراج عن الرقابة باستخدام أمبيروميتري ألياف الكربون التي تكشف فقط ما هو طرد من حويصلة، من الصعب التمييز إذا كان تغيير في الكشف عن مقدار العصبي صدر مرتبط بتغيير في وضع المشغلة من الرقابة، تغيير في الخصائص الفيزيائية الحيوية الخلوية التي تؤثر على الإفراج عن المحتوى حويصلة، أو للتغيرات في حجم حويصلة كانتال. ولذلك، باستكمال تسجيل أمبيروميتريك للرقابة مع قياسات تستخدم في الخلوي داخل الخلايا الكهروكيميائية، قياسات في الموقع لحجم كانتال حويصلة في الخلايا الحية يمكن تتميز ومن ثم استخدامه لمقارنة جزء من حويصلة الإفراج عن المحتوى من الحويصلات خلال الرقابة26.

في هذا العمل، للتحقيق إذا كان حجم حويصلة كانتال تتأثر الإجهاد ناضح، قمنا بتطبيق هذا الأسلوب لتقدير وتقييم حجم كانتال حويصلة في الخلايا التي تتعرض لظروف متساوي التوتر ومكثف. ويعتبر إدخال مسرى نانوتيب في السيتوبلازم من خلية حية الغازية بدلاً من ذلك، هذه التجارب أجريت مرة واحدة فقط كل خلية وقد لا تتكرر في نفس الخلية. ولذلك، تجري هذه التجارب تفضيلي كقياسات فردية من مجموعات من الخلايا المحددة عشوائياً تتعرض لبيئة خارج الخلية مكثف ومتساوي التوتر. لمقارنة التغيرات في حويصلة quantal الحجم مقاسا بالخلوي داخل الخلايا الكهروكيميائية للتعديلات في ناقل عصبي المبلغ صدر في الرقابة، ينبغي النظر مطابقة الشروط التجريبية لتسجيل داخل الخلايا و أيضا القيام بتسجيل أمبيروميتري للرقابة في خلايا عشوائية منفصلة. إذا كانت الدراسات تجري على نفس خلية واحدة، فمن المهم في هذه البروتوكولات التجريبية أيضا النظر في تأثير التحفيز2 BaCl على التوالي، وضمان الشروط التجريبية التي تطابق تلك المستخدمة للخلوي داخل الخلية القياسات. كما تجدر الإشارة إلى أنه من الصعب التحكم في الموضع الدقيق وعمق القطب عندما يتم إدراجها في خلية. وبالتالي، توفر كل خلية عينة عشوائية لتحليل حجم كانتال حويصلة. وباﻹضافة إلى ذلك، يحقق حجم حويصلة كانتال باستخدام هذا الأسلوب لا يميز الفروق في، على سبيل المثال، حويصلة النضج وذلك أيضا قد إضافة التباين للقياسات. وأظهرت التجارب داخل الخلايا أن تم تخفيض حجم quantal حويصلة في الخلايا التي تتعرض للضغط الاسموزي خارج الخلية. تمت مقارنة التخفيض النسبي في حجم قوانتال الكشف عنها بواسطة هذا الأسلوب على الملاحظات للتغيرات النسبية في الإفراج عن ناقل عصبي خلال الرقابة. وجدت هذه الدراسة أن الانخفاض النسبي في حجم كانتال في نفس الترتيب كانخفاض الإفراج العصبي في خلايا الاستشعار عن الإجهاد ناضح.

للتحقق من حالة الإجهاد ناضح كان تغيير تركيز العصبي حويصلة، تم تقييم حجم حويصلة استخدام تيم التصوير تحليل للخلايا تشرومافين ثابتة كيميائيا التي تعرضت إلى ظروف متساوي التوتر ومكثف. تيم التصوير التحليل أظهر أن حويصلات يتقلص عندما تتعرض الخلايا لحدوث صدمة ناضح وأن الانخفاض النسبي في حجم يتم ضبط جنبا إلى جنب مع حجم حويصلة كانتال للحفاظ على تركيز عصبي مستمر24. تحليل الصورة تيم، الذي يوفر دقة الصورة نانومتر يمكن التمييز بين المرحلتين، مصفوفة البروتين الأساسية كثيفة والحل الهالة المحيطة بها داخل لدكفس، ومما يجعل من الممكن لتحديد حجم مصفوفة البروتين الأساسية كثيفة و حساب حجم الحل هالو. من هذا التحليل، مصممة على أن تتعلق أساسا إلى تقلص حجم من الحل الهالة المحيطة بمصفوفة البروتين الأساسية كثيفة24انخفاض حجم حويصلة.

وباختصار، يعرض دراسة هذا بروتوكول مما يدل على مدى ثلاثة أساليب تحليلية يتم جنبا إلى جنب، ويسمح توصيف الحويصلات الافرازية قبل ناقل عصبي الإفراج، وما تم إصدارها من هذه الحويصلات عندما يتم تشغيل الخلايا إلى الرقابة، التوصل إلى فهم أفضل للحويصلات الافرازية كيف وخلية وظائف مثل الرقابة ويتأثر بالضغط خارج الخلية. قد تستخدم هذا البروتوكول أيضا للمساعدة في الإجابة على الأسئلة حول كيفية الإفراج عن ناقل عصبي في الرقابة وحجم حويصلة كانتال تتأثر بتغييرات أخرى في البيئة المادية أو بواسطة الأدوية المحتملة التي قد تؤثر على خلايا افرازية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

المؤلف يود أن يشكر مجلس البحوث السويدية (349-2007-8680) للتمويل و Dalsjöfors Kött AB (Dalsjöfors، السويد) للتبرع بالغدد الكظرية الأبقار.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NaCl Sigma Aldrich S7653
KCl Sigma Aldrich P9333
NaHCO3 Sigma Aldrich S5761
HEPES Sigma Aldrich H3375
MgCl2 Sigma Aldrich M-2670
Glucose Sigma Aldrich G8270
Collagenase P Roche, Sweden 11 213 857 001
100-µM Nylon mesh Fisher Sientific 08-771-19
Percoll Sigma Aldrich P1677
Collagen IV coated 60 mm plastic dish VWR 354416
Centrifuge Avanti J-20XP
Borosilicate glass capillary Sutter instrument Co., Novato, CA
Micropipette puller Narishing Inc., Japan PE-21
Epoxy solutions (A and B) Epoxy technology, Billerica, MA
Beveller Narishing Inc. EG-400
Inverted Microscope Olympus IX81
Patch clamp Instrument Molecular Devices, Sunnyvale, CA Axopatch 200B
Micromanipulator Burleigh Instrument Inc., USA PCS-5000
Butane Flame Multiflame AB, Hässelholm, Sweden
Transmission electron microscopy Omega Leo 912 AB

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Albillos, A., et al. The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry. Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).
  2. Dunevall, J., et al. Characterizing the Catecholamine Content of Single Mammalian Vesicles by Collision-Adsorption Events at an Electrode. J Am Chem Soc. 137 (13), 4344-4346 (2015).
  3. Crivellato, E., Nico, B., Ribatti, D. The chromaffin vesicle: advances in understanding the composition of a versatile, multifunctional secretory organelle. Anat Rec. 291 (12), 1587-1602 (2008).
  4. Morris, S., Schultens, H., Schober, R. An osmometer model for changes in the buoyant density of chromaffin granules. Biophys J. 20 (1), 33 (1977).
  5. Winkler, H., Smith, A. D. The chromaffin granule and the storage of catecholamines. Handbook of Physiology. 6 (7), 321-399 (1975).
  6. Phillips, J., Allison, Y., Morris, S. The distribution of calcium, magnesium, copper and iron in the bovine adrenal medulla. Neurosci. 2 (1), 147-152 (1977).
  7. Estévez-Herrera, J., et al. ATP: The crucial component of secretory vesicles. Proc Natl Acad Sci. 113 (28), 4098-4106 (2016).
  8. Machado, J. D., Camacho, M., Alvarez, J., Borges, R. On the role of intravesicular calcium in the motion and exocytosis of secretory organelles. Commun integr biol. 2 (2), 71-73 (2009).
  9. Toll, L., Howard, B. D. Role of Mg2+ ion-activated ATPase and a pH gradient in the storage of catecholamines in synaptic vesicles. Biochemistry. 17 (13), 2517-2523 (1978).
  10. Terland, O., Flatmark, T. Ascorbate as a natural constituent of chromaffin granules from the bovine adrenal medulla. FEBS letters. 59 (1), 52-56 (1975).
  11. Camacho, M., Machado, J. D., Montesinos, M. S., Criado, M., Borges, R. Intragranular pH rapidly modulates exocytosis in adrenal chromaffin cells. J Neurochem. 96 (2), 324-334 (2006).
  12. Jankowski, J. A., Schroeder, T. J., Ciolkowski, E. L., Wightman, R. M. Temporal characteristics of quantal secretion of catecholamines from adrenal medullary cells. J Biol Chem. 268 (20), 14694-14700 (1993).
  13. Daniels, A., Williams, R., Wright, P. The character of the stored molecules in chromaffin granules of the adrenal medulla: a nuclear magnetic resonance study. Neurosci. 3 (6), 573-585 (1978).
  14. Borges, R., Travis, E. R., Hochstetler, S. E., Wightman, R. M. Effects of external osmotic pressure on vesicular secretion from bovine adrenal medullary cells. J Biol Chem. 272 (13), 8325-8331 (1997).
  15. Troyer, K. P., Mundorf, M. L., Fries, H. E., Wightman, R. Separating vesicle fusion and exocytosis in hypertonic conditions. Ann NY Acad Sci. 971 (1), 251-253 (2002).
  16. Brodwick, M. S., Curran, M., Edwards, C. Effects of osmotic stress on mast cell vesicles of the beige mouse. J Membrane Biol. 126 (2), 159-169 (1992).
  17. Amatore, C., Arbault, S., Bonifas, I., Lemaitre, F., Verchier, Y. Vesicular exocytosis under hypotonic conditions shows two distinct populations of dense core vesicles in bovine chromaffin cells. Chem Phys Chem. 8 (4), 578-585 (2007).
  18. Hampton, R. Y., Holz, R. W. Effects of changes in osmolality on the stability and function of cultured chromaffin cells and the possible role of osmotic forces in exocytosis. J Cell Biol. 96 (4), 1082-1088 (1983).
  19. Troyer, K. P., Wightman, R. M. Temporal separation of vesicle release from vesicle fusion during exocytosis. J Biol Chem. 277 (32), 29101-29107 (2002).
  20. Pihel, K., Travis, E. R., Borges, R., Wightman, R. M. Exocytotic release from individual granules exhibits similar properties at mast and chromaffin cells. Biophys J. 71 (3), 1633 (1996).
  21. Jankowski, J. A., Finnegan, J. M., Wightman, R. M. Extracellular ionic composition alters kinetics of vesicular release of catecholamines and quantal size during exocytosis at adrenal medullary cells. J Neurochem. 63 (5), 1739-1747 (1994).
  22. Leszczyszyn, D. J., et al. Nicotinic receptor-mediated catecholamine secretion from individual chromaffin cells. Chemical evidence for exocytosis. J Biol Chem. 265 (25), 14736-14737 (1990).
  23. Wightman, R., et al. Temporally resolved catecholamine spikes correspond to single vesicle release from individual chromaffin cells. P Natl Acad Sci. 88 (23), 10754-10758 (1991).
  24. Fathali, H., Dunevall, J., Majdi, S., Cans, A. -S. Extracellular osmotic stress reduces the vesicle size while keeping a constant neurotransmitter concentration. ACS Chemical Neuroscience. , (2017).
  25. Bath, B. D., et al. Subsecond adsorption and desorption of dopamine at carbon-fiber microelectrodes. Anal Chem. 72 (24), 5994-6002 (2000).
  26. Li, X., Majdi, S., Dunevall, J., Fathali, H., Ewing, A. G. Quantitative Measurement of Transmitters in Individual Vesicles in the Cytoplasm of Single Cells with Nanotip Electrodes. Angew Chem Int Edit. 54 (41), 11978-11982 (2015).
  27. Zoski, C. G., Mirkin, M. V. Steady-state limiting currents at finite conical microelectrodes. Anal Chem. 74 (9), 1986-1992 (2002).
  28. Mosharov, E. V., Sulzer, D. Analysis of exocytotic events recorded by amperometry. Nat Methods. 2 (9), 651-658 (2005).
  29. Morris, J. K. A formaldehyde glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy. J Cell Biol. 27, 137-139 (1965).
  30. Parsons, T. D., Coorssen, J., Horstmann, H., Almers, W. Docked granules, the exocytic burst, and the need for ATP hydrolysis in endocrine cells. Neuron. 15 (5), 1085-1096 (1995).

Tags

علم الأعصاب، 132 قضية، الخلايا تشرومافين، الضغط الاسموزي، حويصلات الأساسية كثيفة، تركيز العصبي، حجم كانتال، الرقابة، أمبيروميتري، الخلوي داخل الخلية، مجهر إلكتروني
رصد أثر الإجهاد ناضح على الحويصلات الافرازية والرقابة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fathali, H., Dunevall, J., Majdi,… More

Fathali, H., Dunevall, J., Majdi, S., Cans, A. S. Monitoring the Effect of Osmotic Stress on Secretory Vesicles and Exocytosis. J. Vis. Exp. (132), e56537, doi:10.3791/56537 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter