Summary
Количественный анализ содержимого ячейки в пределах мышиных седалищного нерва трудно из-за нехватки ткани. Этот протокол описывает метод для ткани пищеварения и подготовки, которая обеспечивает достаточную клетки для анализа потока цитометрии иммунных клеток населения от нервов отдельных мышей.
Abstract
Иммунные клетки нерва резидент в периферической нервной системы (ПНС) имеют важное значение для поддержания целостности нейронов в здоровой нерва. Иммунные клетки ПНС страдают от травм и болезней, влияющих на функции нервов и способности к регенерации. Нейрональные клетки иммунной системы обычно анализируются иммунофлюоресценции (если). А если это важное значение для определения местоположения иммунные клетки нерва, если только полуколичественного и метод ограничивается количество маркеров, которые могут быть одновременно исследовано и степень поверхности выражения. В этом исследовании проточной цитометрии был использован для количественного анализа лейкоцитарной инфильтрации в седалищного нервов или спинной корень ганглиев (ДРГ) отдельных мышей. Был проведен анализ одной ячейки, используя DAPI и некоторые белки были проанализированы одновременно для поверхности или внутриклеточных выражения. Обе седалищного нервов от одной мыши, которые рассматривались согласно протоколу созданы ≥ 30.000 один ядерных событий. Количество лейкоцитов в седалищного нервов, определяется выражением CD45, был около 5% от содержания общей ячейки в седалищный нерв и примерно 5-10% в DRG. Хотя этот протокол фокусируется главным образом на иммунных клеток населения в рамках ПНС, гибкость проточной цитометрии измерить количество маркеров одновременно означает, что население клетки, находящиеся в нерва, например Шванновские клетки, pericytes , фибробластов и эндотелиальных клеток, могут также быть проанализированы с помощью этого метода. Поэтому этот метод предоставляет новые средства для изучения системных эффектов на ПНС, таких как neurotoxicology и генетической модели нейропатии или хронических заболеваний, таких как диабет.
Introduction
Иммунные клетки, которые заходят ПНС из обращения, как определяется выражением CD45 и CD11b, помогают поддерживать целостность нерва и играть определенную роль в регенерации и дегенерации1. Макрофаги (определяется их выражение CD68 мыши) может перекос в сторону воспалительных фенотип, выражая больше MHC класса II и CD86 на их поверхности (M1), или к противовоспалительным фенотипа, выражая более внутриклеточных CD206 (м2)2 . Наклон макрофагов фенотипа представляет собой динамичный процесс, регулируется через Akt сигнализации3, отражающий различные задачи макрофагов в обороне против патогенов (M1) и роль в регенерации тканей (м2). Регенерация потерпевшего нерва сначала требует фагоцитоза миелина мусора макрофагами в нерв4,5и противовоспалительными (CD68+CD206+) м2 макрофагов, было показано, содействовать аксона нарост в ПНС6. Сокращение вербовки или макрофагами к ПНС, или нарушение способности для фагоцитоза может привести к нарушения регенерации и поддержание целостности нерва. Воспалительные M1 макрофагов, выражая гистосовместимости, менее способны фагоцитоза чем м2 макрофагов, и нейрональных воспаление вовлечено в патогенезе нескольких нейродегенеративных заболеваний7.
Изменения, которые происходят для резидентов иммунной системе нерва вследствие повреждения могут быть количественными, проявляется в потере CD45+ лейкоциты (или увеличить проникновение CD45+ лейкоциты в случае воспаления), или качественной, такие как изменение фенотипа макрофагов с м2 для M1 фенотип. Иммунные клетки ПНС традиционно были проанализированы с помощью если, использование замороженных секций или парафин врезанных материала8. Если требуется для определения локализации клеток интерес. Однако количественная оценка с использованием если часто опирается на подсчет сравнительно небольшое количество клеток в узкой части ткани, делая количественной оценки, ненадежны и подвержены систематическая. Для идентификации конкретных подмножеств иммунных клеток одновременного обнаружения внеклеточные и/или внутриклеточных маркеров требуется, в то время как определение фенотипа макрофагов, требует по крайней мере по крайней мере двух маркеров, специально CD206 и MHC класс II. Как чаще всего доступны Микроскопы ограничены по крайней мере двух цветовых каналов, таких как флуоресцеин Изотиоцианаты (FITC) и фикоэритрин (PE), квалификация определенных подмножеств иммунных клеток, если может быть ограничительным и неполными, требующих необходимость иметь несколько слайдов, полученные из той же области интереса, которые витражи и проанализированы параллельно. Этот аспект требует много времени, поэтому не необходимости поддается анализу комплектов больших образцов. Кроме того поскольку большинство из маркеров интерес внеклеточная, обнаружения в ткани, который либо встроен в парафин или криоконсервированных, может быть проблематичным из-за нарушения целостности мембраны и маскировки epitopes, а также потери антигены интерес от использования растворителей, например, ацетон и метанола9.
В противоположность этому, проточная цитометрия, который измеряет оптических и флуоресценции характеристики единичных клеток в суспензии, как они проходят через луч света, обеспечивает более практическим и комплексным средством для анализа клеточных популяций. Проточной цитометрии, вместо того, чтобы производить цифровое изображение ткани, обеспечивает автоматизированный количественная оценка установленных параметров, которые включают относительный размер ячейки и отражающая индекс, называют вперед точечной (FSC), гранулярность/внутренние сложности или сторона точечной (SSC) и относительной флуоресценции интенсивности, обеспечивая, что ячейки был назван с соответствующей Флюорофор, таких как конъюгированных антител. Типичная проточный цитометр состоит из двух, воздушного охлаждения лазеров; Аргоновый лазер производит синий свет в 488 нм и гелий неоновый лазер производит свет в 633 нм. Эта комбинация позволяет для обнаружения и измерения, одновременно, по крайней мере пять целей на поверхности или внутри внутриклеточного отсек. Более продвинутые цитофлуориметрами поток может состоять из нескольких лазеров, которые позволяют для обнаружения до восьми различных флуорохромов одновременно, обеспечивая, что пик выбросов волн выбранного флуорохромов значительно не перекрываются.
Для анализа подачей cytometry, ткани интерес должны сначала быть ферментативно переваривается, обычно с коллагеназы, чтобы генерировать одну ячейку подвеска. Анализ мышиных седалищного нервов ранее был затруднен из-за небольшого количества ткани, полученные из каждой мыши. Кроме того высокое содержание жира миелина вокруг аксоны препятствует восстановлению клеток и производит большое количество мусора. Метод, описанный здесь для подготовки седалищного нерва и пищеварение было адаптировано из клеток Шванн изоляции протокола заколка et al. 7и стремится изолировать достаточно клетки от нервов отдельных мышей для анализа цитометрия потоков, с тем чтобы уменьшить различия между мышей. С помощью DAPI для идентификации одного клеток в сырой ткани дайджест обходит необходимость удаления мусора аксона, который часто приводит к потере клеток. Стиральная несколько раз с моющих средств богатые буфера СПИДом в выпуске клеток в ловушке внутри жирной мусора, тем самым увеличивая урожайности. Пищеварение обеих полнометражного седалищного нервов от одной мыши согласно протоколу генерирует ≥30, 000 одной ядерных событий и по крайней мере 3 раза это число было извлечено от DRG. Доля CD45+ лейкоциты был приблизительно 5% из всего содержимого в дайджест седалищного нерва и примерно 5-10% в дайджест DRG. Большинство CD45+ клетки в седалищный нерв выразили маркеры макрофагов, CD68 и CD206.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Мышей C57BL/6 одичал типа (самцы; 10-12 недель) хранились в стандартных 12 h свет/темно цикла и получили свободный доступ к стандартным Чоу диеты и воды. Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами соответствующих местных животных уход и использование Комитетом и утверждены местных животных уход и использование Комитета на региональной власти в Карлсруэ, Германия (G216/10).
1. перфузии мыши
- Жертвоприношение мыши (C57BL/6; Мужчины; 10-12weeks) с использованием CO2 или в соответствии с местными правилами.
Примечание: Ретро орбиталь кровотечение может быть проведена для получения контроля лейкоцитов, используя ЭДТА покрытием 1.5 мл пробирок. Этот метод кровотечения эффективен только сразу же после жертвоприношения. Кроме того, перитонеальная полость промывание (PCL) может выполняться для получения контроля макрофагов, используя подогретую PBS при 37 ° C, чтобы избежать холодной агглютинации крови, что может помешать перфузии. - Продезинфицируйте мыши путем распыления мех на животе обильно с 70% v/v этанола и неоднократно вытирая салфеткой с хлопчатобумажной марли. С помощью тупыми ножницами, разрезали брюшной кожи на продольный разрез.
- Разоблачить плевральной полости, первый сделав надрез в диафрагму изогнутые, тупыми ножницами, а затем расширение разрез вдоль всей длины грудной клетки. Сделайте же разрез на контралатеральную сторону до тех пор, пока грудины может быть тщательно снят прочь.
- С четкое представление сердца и крупных сосудов Вставка бабочка 23¾ манометра, подключенных к 50 мл шприц заполняют с ледяной PBS, левого желудочка сердца.
- Надрезают правого предсердия сердца с помощью Ирис ножницы для создания как большие розетки как можно без ущерба для нисходящей аорты, а затем осторожно отпустите шприц протолкнуть приблизительно 30 мл ФСБ. Экссудат следует установить четкие. Очистка печени или почек может использоваться в качестве показателя хороший перфузии.
2. рассечение седалищного нерва и DRG
Примечание: Для рассечение седалищного нервов кожи выше ягодиц Максимус удаляется и мышь расположены вентральной стороне вниз время протягивая нижних конечностей.
- На двустороннем уровне вскрыть всю седалищного нервов, разделив мышечной ткани от дорсальной бедро и следить нерв вдоль позвоночника. Вырежьте нерва, где он выходит из позвоночника и сразу же выше колена на другом конце.
Примечание: Избегайте чрезмерного обработки нерва как дробление или потянув с щипцами. - С помощью щипцов, передачи подакцизным nerve(s), приблизительно в 2 см в нерва, до 1,5 мл трубка, содержащая 1 мл ледяной PBS и магазин на льду.
Примечание: Нерва могут быть сохранены на ночь на льду.
Примечание: Для DRG рассечение, используя пинцет и скальпеля, снимите кожу от базовой мягких тканей, мягко пилинг покинуть оставшиеся задней кожи подвергать шейного, грудного и поясничного отделов позвоночника регионов. Удалите головы, отрезав у основания черепа, используя пару тупыми ножницами. - Вырежьте ребра параллельно с и недалеко от позвоночника с обеих сторон, перед отсоединением внутренностей подключен к передней стороне позвоночника. Вырезать бедра и удалить позвоночник, поперечная, разрезать на уровне бедра. С помощью ножниц Ирис, отрежьте любые мышц, жира и других мягких тканей от позвоночника.
- Место позвоночного столба спинной стороной вверх и откройте его, начиная с хвостового конца, сдвинув один подсказки ножниц в позвоночного канала в три часа позиции и кости snipped. Повторите процедуру на девять часов.
Примечание: Важно вырезать точно в центре, чтобы избежать повреждения DRG. - Повторите резки из стороны в сторону до тех пор, пока достигнут ростральной конец и спинного мозга, полностью подвергается. С помощью микроскопа рассечение, удалите спинного подвергать спинномозговых нервов, которые могут быть использованы для поиска ДРГ внутри позвоночника.
- Удалите поясничного ДРГ, нежно дергая на спинной корень тянуть DRG в позвоночный каналов, затем отсечения нервы и соединительной ткани с диафрагмой ножницы, чтобы удалить ГДК.
Примечание: Это можно ограничить коллекцию в L4-L6 DRG, которые способствуют седалищного нерва. - С помощью щипцов, передать 1,5 мл, содержащие примерно 1 мл ледяной PBS ДРГ и хранить на льду.
Примечание: Нерва могут быть сохранены на ночь на льду.
3. пищеварение седалищного нерва и DRG
- Подготовьте пищеварение СМИ (DMEM, 10 мм HEPES, 5 мг/мл BSA, коллагеназа 1,6 мг/мл тип 4) дополняется 100 мкг/мл дезоксирибонуклеаза, и магазин на льду.
Примечание: Количество пищеварения среды требуется на мышь (седалищный нервы + ДРГ)-1 мл. После подготовки аликвоты пищеварение средства массовой информации могут храниться при температуре-20 ° C. - Перевести седалищного нервов и ДРГ с одной мыши на отдельные 1,5 мл пробирки, содержащие 500 мкл пищеварение средства массовой информации. Для седалищного нервов нарезать материал на 15-20 штук с помощью ножниц весной и затем инкубировать ткани суспензий в тряску инкубатора при 37 ° C 20 мин с нежным агитации (≤ 450 об/мин).
- Неоднократно нарезанных суспензию клеток через 1000 мкл наконечник пипетки для механически отделить любой неполностью переваренной ткани.
Примечание: Если подвеска трудно титровать, затем вырежьте кончик пипетку с ножницами для создания тупой конец. Инкубируйте подвеска ткани при 37 ° C в течение 20 мин с нежным агитации (≤ 450 об/мин). - Повторите Тритурация через 1000 мкл наконечник пипетки и инкубировать в течение еще 10 минут при 37 ° C с нежным агитации (≤ 450 об/мин).
- Подготовьте буфере СУИМ (PBS с ЭДТА 10% FCS и 1 мм) и хранить на льду. Промыть и замочить экран из нержавеющей стали с сетки размером 140 мкм с СУИМ буфера в 60 x 15 мм Петри на льду.
Примечание: Нейлон фильтры следует избегать, поскольку это приводит к значительной потере урожайности ядерных клеток. - Неоднократно пройти суспензий ткани 140 мкм сетчатый фильтр, как она проходит над Петри, с тупым щипцами, на льду. Собирать суспензию клеток от Петри и перенести его на новый 1,5 мл трубки, хранящиеся на льду.
- Нажмите любой неполностью переваренной ткани, которая остается на фильтр через повторяющиеся Тритурация с кончиком пипетки 1000 мкл. Промойте фильтр экране дважды с 500 мкл буфера СУИМ и собирать результирующий суспензию клеток в Петри сочетать с суспензию клеток из шага 3.6.
Примечание: Если проточный цитометр используется чувствителен к мусора, суспензию клеток от шага 3.7 могут передаваться через сетчатый фильтр 70 мкм; Однако это может привести к потере урожайности ядерных клеток. - Центрифуга для клеточных суспензий на 300 g x 5 мин при 4 ° C. Отменить супернатант и Ресуспензируйте Пелле клеток в 1 мл буфера СУИМ. Повторите этот шаг Стиральная один раз.
- Ресуспензируйте Пелле клеток в 150-350 мкл буфера СУИМ, зависящ на количество окрашивание, которые требуется (150 мкл СУИМ буфера на окрашивание группа).
4. Окрашивание седалищного нерва и DRG с дневно обозначенные антитела для проточной цитометрии
- Перевести 100 мкл седалищного нерва или суспензию клеток DRG в V-образный хорошо в 96-луночных пластины на льду.
Примечание: Сингл окрашенные клетки необходимы для всех антитела, которые используются как они будут предоставлять необходимые элементы управления для настройки проточной цитометрии трубки (ПЛТ) фотоэлектронный умножитель напряжения ГАИНС и компенсации, а также того, чтобы помочь отличить от конкретных без конкретной привязки. Из-за ограниченного материала от седалищного нерва и ДРГ, крови лейкоциты и макрофаги от PCL (шаги 1.1-1.2) могут использоваться как элементы управления сингл витражи, окрашивание для которого должно выполняться параллельно с окрашивание седалищного нерва и ГДК. - Бассейн остальные клетки суспензий (примерно 50 мкл на сэмпл) из седалищного нервов или DRG образцы, чтобы служить неокрашенных управления.
- Центрифуга пластину на 400 g x 5 мин при 4 ° C. Отменить супернатанта, инвертирование пластину за Бен и применяя резким движением запястья и аккуратно коснитесь сухой на бумажные полотенца.
- Для окрашивания поверхностей, Ресуспензируйте каждой ячейки гранул в 20 мкл буфера СУИМ, содержащий антитела интерес (CD45-A647, CD11b-PerCP/Cy5.5 и MHC класса II-биотин) и инкубировать, защищенном от света, на льду за 30 мин.
Примечание: (1 оптимальное антитела разрежения должны быть определены до использования, выполнив серию разрежения согласно информации о продукте производителя; (2) неспецифические stainings может быть уменьшена путем инкубации с Fc блок на этот шаг, в соответствии с инструкциями производителя; и (3) изотипа управления stainings, как правило, не требуется при использовании первичного антитела, непосредственно сопряженных с Флюорофор и/или когда производят antigen(s) интересов различных групп населения. - 130 мкл буфера СУИМ в каждой скважине и центрифуги пластину на 400 g x 5 мин при 4 ° C. Выбросите супернатанта как описано (шаг 4.3) и мыть ячейки гранулы дважды с 150 мкл буфера СУИМ.
Примечание: При использовании неконъюгированной основное антитело или основное антитело проспряганное биотина, затем соответствующие вторичные реагент, конъюгированных с Флюорофор, могут быть добавлены в этот момент и повторяются шаги 4.4-4.5. В случае этот протокол стрептавидина PE/Cy7 или стрептавидина-PerCP использовался для выявления MHC класса II в сочетании с CD45-A647/CD11b-PerCP/Cy5.5, или в сочетании с CD68-APC и F4/80-PE/Cy7, соответственно. - Для фиксации, после последнего шага Стиральная Ресуспензируйте клетки окатышей в 100 мкл параформальдегида 4% в PBS (рН 7,4). Инкубировать пластину на льду за 10 мин и затем центрифуги на 400 g x 5 мин при 4 ° C. Отбросить супернатанта как описано выше (шаг 4.3) и мыть ячейки окатышей с 150 мкл буфера СУИМ.
Предупреждение: Параформальдегида токсичен; Носите надлежащей защиты как перчатки и очки, и т.д.
Примечание: Ресуспензируйте клетки окатышей в 150 мкл буфера СУИМ и защищенное от света, при температуре 4° C на срок до двух дней. Если требуется не внутриклеточных окрашивание, затем перейдите к шагу 4.11 после центрифугирования пластину на 400 x g 5 мин при 4 ° C. - Для внутриклеточного пятнать, Ресуспензируйте клетки окатышей в 150 мкл СУИМ buffer+0.5% моющее средство и инкубации при комнатной температуре, защищенный от света на 15 мин центрифуги пластину на 400 x g 5 мин при 4 ° C. Отбросить супернатанта как описано выше (шаг 4.3) и мыть ячейки лепешка однажды с 150 мкл буфера СУИМ + 0,5% моющего средства. Ресуспензируйте Пелле клеток в 20 мкл СУИМ buffer+0.5% моющих средств содержащих антитела интерес (CD68-APC, CD206-PE) и инкубировать, защищенном от света, при комнатной температуре за 30 мин.
- 130 мкл СУИМ buffer+0.5% моющее средство для каждой скважины и центрифуги пластину на 400 g x 5 мин при 4 ° C. Выбросите супернатанта как описано (шаг 4.3) и мыть ячейки гранулы дважды с 150 мкл буфера СУИМ + 0,5% моющего средства.
Примечание: При использовании неконъюгированной основное антитело или основное антитело проспряганное биотина, затем соответствующие вторичные реагент, конъюгированных с Флюорофор, могут быть добавлены в этот момент и повторить шаги 4.9-4.10. - Ресуспензируйте клетки окатышей в 150 мкл буфера СУИМ + 0,5% моющего средства и магазин, защищенный от света, при температуре 4 ° C на срок до двух дней.
- Ресуспензируйте клетки окатышей с 150 мкл буфера СУИМ + 0,5% моющего средства, дополнена 5 мкг/мл DAPI и инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре, защищенный от света. Центрифуга пластину на 400 g x 5 мин при 4 ° C. Выбросите супернатанта как описано выше (шаг 4.3).
- Ресуспензируйте клетки окатышей в 150 мкл PBS и передачу соответствующей маркировкой СУИМ трубки. Хранить при комнатной температуре, защищенный от света, пока готовы для анализа.
Примечание: После взмучивания в PBS, клетки должны быть проанализированы в течение часов, поскольку DAPI будет медленно отмежеваться от ДНК, приводя к потере сигнала.
5. установки проточной цитометрии и запуск образцов
- Убедитесь, что проточный цитометр оснащен соответствующим лазеры и/или фильтр задает для измерения флуорофоров, используемый для запятнать клетки. Это может быть определено цитометр конфигурация по умолчанию в системе. В случае этот протокол, клетки были проанализированы с помощью проточный цитометр, оснащен тремя лазеры (405 нм, 488 нм и 633 нм) позволяет для обнаружения ≤ 5 флуорофоров.
- Выберите соответствующие каналы для обнаружения флуорофоров интерес. Лучше всего все флуоресцентные сигналы обнаруживаются с Логарифмические усилители.
- Выберите соответствующий расход для образцов. Этот параметр может меняться в зависимости от системы, используемой и следует определить эмпирически. В случае этот протокол скорость потока MED-HI (35-60 мкл/мин) был использован для предотвращения засорения иглы.
- Выберите общее количество событий/клетки, чтобы быть собраны на сэмпл. Минимальное количество событий должно быть 1 000 000.
- Создание точечной участки под глобальной лист SSC-a по сравнению с FSC-A, а также для каждого Флюорофор интерес по сравнению с FCS-A. Создайте представление статистики, которая будет отображать количество событий и средней интенсивности флуоресценции (МФО) для выбранного флуорофоров.
- Установите напряжение FSC-A и SSC-A каналов, таким образом, что маленьких клеток вписываются в нижнем левом 10% точечной. Определите, фон флуоресценции и флуоресценции минимальной выборке из неокрашенных элементов управления из седалищного нервов или ДРГ. Определение родительского (P1) ворота основанные на разброс участок от DAPI-только окрашивание элементов управления.
Примечание: Это не коллекции ворот, из-за частично, неоднородный характер населения DAPI + в ПНС. - Использование точечной FSC участков для каждого из флуорофоров интерес, отрегулировать напряжение, так что клетки неокрашенных управления входят в нижней четверти их разброс соответствующих участков. Выше этого региона определить те клетки, которые являются позитивными для каждого из соответствующих маркеров/флуорофоров затем создаются ворота. Размещение ворот подтверждается запуска сингл окрашенных управления (шаг 4.1).
Примечание: Компенсация за перекрывающиеся спектры выбросов может быть выполнена на данный момент или применяется ретроспективно с программным обеспечением надлежащего анализа. - После того, как был создан проточный цитометр, как описано, можно запустить образцы.
- После запуска оставшиеся образец материала может быть отброшен и ФТС файлы могут быть экспортированы для дальнейшего анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Клеточных суспензий из полнометражных седалищного нервов и всех основных DRG были подготовлены, согласно протоколу, от шести здоровых мышей C57BL/6 и разделен на три равных аликвоты для окрашивания. Счетчик, окрашивание с DAPI, который пятна ДНК, позволяет для обнаружения населения одну ячейку (рис. 1A–B, верхняя группа). Вымывание DAPI до анализа подачей cytometry, уменьшилась до такой степени интенсивности флуоресценции мусора тому, который позволяет для выбора дискретных населения над FSC-оси тому одного события или фуфайки. Ворота не коллекции применяется как майки от ПНС распределены на большой ассортимент FSC и ККК (рис. 1 c). Материал на высоком конце оси FSC, которая содержит неполно усваиваются ткани, должны быть исключены в выборе синглетно населения (рис. 1A–B). С помощью участке плотность (Нижняя панель) для отображения результатов может способствовать исключению большого мусора (Нижняя панель). В общей сложности ≥ 30.000 фуфайки регулярно можно получить из двух полностью седалищного нервов и ≥200, 000 фуфайки может быть получена от ГДК (рис. 1 d). Из седалищного нервов примерно 5% фуфайки выразил CD45 на их поверхности, тогда как приблизительно 5-10% были найдены в ГДК, тем самым определяя эти клетки как лейкоциты гемопоэтических происхождения (рис. 2A).
Большинство CD45+ фуфайки также выразил гистосовместимости, постепенно (рис. 2B). В ГДК, CD11b может использоваться для обнаружения клетки микроглии как (CD45тусклым, CD11b и MHCII+ +) (Рисунок 2Б, верхняя группа). Однако, это население микроглии отсутствует от седалищного нервов (Рисунок 2Б, Нижняя панель). Большинство фуфайки, выражая CD45 в ПНС являются CD68+ макрофагов. В седалищного нерва и DRG, 2-5% фуфайки выразили CD68 (рис. 3A). Все клетки, выражая CD68 также выразил CD45 (данные не показаны). В ГДК, CD68+ макрофаги более неоднородны в их выражения обеих MHC класса II и CD206, маркер для м2 макрофагов, чем в седалищного нервов (Dрисунок 3B–). В седалищного нервов, большинство макрофаги совместно выразили MHC класса II и CD206 (рис. 3Б–D, нижняя панели); как правило примерно 60-80% CD68+ макрофаги выражена CD206, а меньшую долю CD68+ совместно выразили CD206 в ГДК (рис. 3B). Интересно, что маркер макрофагов M1 CD86 не создавать положительный пятнать, ни на макрофаги от нерва, ни от PCL (данные не показаны). Макрофагов маркер, F4/80, показал гетерогенных выражение в DRG и седалищного нервов (рис. 3Б–C), окрашивание доля CD68– и MHCII– клетки. Кроме того выражение F4/80 не полностью дублирует CD68 выражение.
Рисунок 1: репрезентативных данных из потока cytometry анализ DAPI-окрашенных тому клетки от DRG и седалищный нерв. Все события, собранные, показано, как scatterplots (Верхняя панель) или плотности участков (Нижняя панель), от DRG (A) или (B) седалищного нерва (SN) один представитель мыши. Стрелки в нижней панели указывают ворота, за исключением делящихся материалов в верхней оси FCS. (C) Back стробирования клеток, собранные в DAPI-ворота (майки), отображаемые в панели (A) на точечной SSC против FSC. (D) количество фуфайки из SN и всех основных DRG из шести здоровых мышей C57BL/6. Данные представляют собой среднее ± SD. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: поток cytometry анализ поверхности выражение CD45, гистосовместимости, CD11b на майки от DRG и седалищного нерва и. Были проанализированы события выбранного в DAPI-ворота (майки) показано на рисунке 1 . (A) доля фуфайки, выражая CD45 в седалищный нерв (СН) и DRG из шести управления мышей. (B) представитель точечные из майки от DRG (Верхняя панель) и SN (Нижняя панель). Клетки, выражая CD11b обозначаются синим цветом. Данные представляют собой среднее ± SD. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: cytometry анализ поверхности выражения CD68, гистосовместимости, потока и CD206 на майки от DRG и седалищный нерв. Были проанализированы события выбранного в DAPI-ворота (майки) показано на рисунке 1 . (A) доля фуфайки, выражая CD68 седалищного нерва (СН) и КЗГ из шести здоровых мышей C57BL/6. (B) доля CD68+ макрофагов, совместно выражая CD206 SN и DRG из шести здоровых мышей C57BL/6. (C) представитель точечные участки майки от DRG (Верхняя панель) и SN (Нижняя панель) показаны CD68 и MHC класса II выражение. (D) представитель точечные участки майки от DRG (Верхняя панель) и SN (Нижняя панель) показаны CD68 и CD206 выражения. Клетки, выражая F4/80 указаны с пурпурным цветом. Данные представляют собой среднее ± SD. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Седалищный нервы содержат большое количество липидов, таких как холестерин, благодаря содержанию миелина вокруг аксоны. Поскольку с температуры изменяются свойства липидов, различные результаты могут быть получены при разных температурах. Для обеспечения сохранения клеток, на льду были выполнены все действия в этом протоколе после переваривания. Хотя согласованности рекомендуется ради воспроизводимость результатов, это может быть возможным увеличить урожайность, выполнив шаги, 3,6 и 3,7 при комнатной температуре. Если нервы на шаге 3.8 не имеют были достаточно переваривается, небольшие кусочки нерва будет видна на сетке. В случае недостаточности переваривания материал, сохранил на mesh может повторно переваривается путем передачи новых 1,5 мл трубка, содержащая 250 мкл пищеварение средства массовой информации и повторяющиеся шаги 3.2-3.6. Если выход является бедным, то образец суспензии клеток, после прохождения через экран сетки (шаг 3,6) следует рассматривать под микроскопом света с Трипановый синий. Жизнеспособным, не синий, клетки должны быть видны наряду с род как структуры, которые являются фрагменты аксоны. Если не жизнеспособные клетки присутствуют, то пищеварение условий и/или неправильной передачи материала вызвало некроз. Если только видны большие компоситы, то рекомендуется собирать материал центрифугированием и повторить пищеварения (шаги 3.2-3.6).
Метод анализа потока цитометр мышиных седалищного нервов и ДРГ полезен для вопросов с участием всего нервы и несколько ДРГ. Недавно был повышенный интерес в анализе ПНС с помощью потока цитометрии11,12 . Лю et al. разработали метод, с помощью папаин и механических диссоциации седалищного нервов и ДРГ с помощью 21 G и 23 G специально анализировать как маленькое как 1 см раздел нерва, тем самым позволяя для анализа материала нерва с определенных сайтов 11травмы. Метод, представленный здесь рекомендуется для использования, когда ожидается, что влияние на ПНС придать системный характер, как и neurotoxicology и генетической модели нейропатии или хронических заболеваний, например диабета. Из-за низкой урожайности ядерных клеток, полученных из седалищного нерва не рекомендуется попытаться изучения небольших популяций с ≤ 100 закрытого событий из отдельных мыши. Однако объединение материала из нескольких мышей облегчит изучение такой небольшой численностью населения в пределах нерва. Тем не менее он будет представлять интерес для расследования ли диссоциации ферментативные ткани, папаин и 21G / 23G иглы с помощью описываемого Лю et al. 11 может сочетаться с потока цитометрии окрашивания ядер, как описано в этом исследовании, чтобы повысить урожайность одиночных клеток. Способность анализировать очень небольшое количество ткани имеет решающее значение для выполнения сравнения между ИПСИ - и контралатерального ДРГ после одностороннего седалищного нерва axotomy. Однако это выходит за рамки данного исследования. Интересно, что часто используемых маркеров для идентификации макрофагов были обнаружены неожиданно гетерогенных выражения в ПНС мышей. К примеру CD11b и F4/80 оба оказались выражаться на большое количество не гемопоэтических, не антиген представляющих клеток в седалищного нерва и ДРГ. Кроме того, в седалищного нервов, не все CD68+ макрофаги выразил CD11b и F4/80, как было бы ожидать от изучения других органов. Поэтому рекомендуется, что осторожность при использовании этих маркеров для изучения макрофагов в ПНС и что другие маркеры, такие как CD163, должны быть расследованы. Кроме того чувствительность различных маркеров для ферментативного диссоциации также должны создаваться как это возможно, объяснение различий наблюдается в выражения, такие как с CD11b или F4/80.
Этот протокол ранее использовался для анализа иммунные клетки в ПНС после токсичных проблема с Стрептозотоцин (СТЗ)13, химической, часто используемые для индукции диабета в модель грызунов организмов. Было показано, что СТЗ, который активирует TRPV1 и TRPA1, сначала вызывает истощение иммунных клеток в седалищного нерва и ДРГ, не причиняя любое воспаление нерва. Хотя количество иммунных клеток в ГДК оправился, иммунных клеток и особенно макрофаги были по-прежнему значительно истощены три недели пост токсичных вызов. Он был впоследствии предположил что макрофагального фагоцитоза нерва мусора, в результате травмы ионного канала гипервозбудимости может привели к апоптозу макрофаги, что привело к их истощению из населения общей ячейки. Не известно, как другие токсины периферических нервов влияют на нерв-резидентов макрофаги. Если истощение макрофагов является общим результатом таких агентов, это может иметь последствия для лечения.
Было установлено, что лишь 5-10% ядерных клеток от нерва были лейкоциты гемопоэтических происхождения. Остальные клетки предположительно смесь других типов нервных клеток, а именно Шванновские клетки, pericytes, фибробластов и эндотелиальных клеток. Из-за способности проточной цитометрии систем для измерения несколько параметров и предусматривающий, что являются конкретные маркеры или антител доступны, это мыслимо, что этих типов клеток также могут быть проанализированы с помощью этого метода. Этот метод был описан для мышиных материала. Однако с некоторыми изменениями, он также использовался для анализа ПНС материала от свиньи и от человека. Предполагается, что этот метод будет более полезным для анализа материала от видов больше, чем мышей, в будущем.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы имеют отсутствие конфликта интересов в отношении данного исследования.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; SFB1118). Авторы хотели бы поблагодарить Axel Erhardt для выполнения большинства диссекции и услужливо передачи этих знаний и д-р Фолькер Eckstein для оказания помощи в техническом плане проточный цитометр.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 Mouse | Charles River | C57BL/6NCrl | |
| DMEM (+1g/L glucose, Glutamine, Pyruvate) | Thermo | 31885023 | The source of this material is not important |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Collagenase Type 4 | Worthington Biochemical Corp., US | LS004188 | |
| Deoxyribonuclease (DNase) I from bovine pancreas I | Sigma-Aldrich | DN25-1g | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Foetal Calf Serum (FCS), heat inactivated | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Antibody against CD11b-PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 101228 | Clone M1/70 |
| Antibody against MHC class II, biotinylated | Biolegend | 107603 | Clone M5/114.15.2 |
| Antibody against CD45-A647 | Biolegend | 107603 | Clone 30-F11 |
| Antibody against CD68-APC | Biolegend | 137007 | Clone FA/11 |
| Antibody against CD206-PE | Biolegend | 141706 | Clone C068C2 |
| Antibody against F4/80-PE/Cy7 | Biolegend | 123113 | Clone BM8 |
| Streptavidin-PE/Cy7 | Biolegend | 405206 | Used to detect MHCII-biotin with CD45-A647 and CDllb-PerCP/Cy5.5 |
| Streptavidin-PerCP | Biolegend | 405213 | Used to detect MHCII-biotin with CD68-APC and F4/80-PE/Cy7 |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Dilute in PBS to a 50x and store at 4 °C in the dark |
| Cell dissociation sieve - tissue grinder kit | Sigma-Aldrich | CD1 | |
| V-Shaped, 96-well plates | Greiner/Sigma | M8185 | |
| 5ml polystryene round-bottom tube, 12x75mm | BD Biosciences | 352008 | |
| 60x15mm petri dish | Greiner/Sigma | Z643084 | |
| BD LSR II Flow Cytometer | BD Biosciences |
References
- DeFrancesco-Lisowitz, A., Lindborg, J. A., Niemi, J. P., Zigmond, R. E. The neuroimmunology of degeneration and regeneration in the peripheral nervous system. Neuroscience. 302, 174-203 (2014).
- Sica, A., Erreni, M., Allavena, P., Porta, C. Macrophage polarization in pathology. Cell. Mol. Life Sci. 72, 4111-4126 (2015).
- Vergadi, E., Ieronymaki, E., Lyroni, K., Vaporidi, K., Tsatsanis, C. Akt Signaling Pathway in Macrophage Activation and M1/M2 Polarization. J. Immunol. 198, 1006-1014 (2017).
- Perrin, F. E., Lacroix, S., Avilés-Trieueros, M., David, S. Involvement of monocyte chemoattractant protein-1, macrophage inflammatory protein-1alpha and interleukin-1beta in Wallerian degeneration. Brain. 128, 854-866 (2005).
- Niemi, J. P., et al. A Critical Role for Macrophages Near Axotomized Neuronal Cell Bodies in Stimulating Nerve Regeneration. J Neurosci. 33, 16236-16248 (2013).
- Mokarram, N., Merchant, A., Mukhatyar, V., Patel, G., Bellamkonda, R. V. Effect of modulating macrophage phenotype on peripheral nerve repair. Biomaterials. 33, 8793-8801 (2012).
- Martini, R., Willison, H. Neuroinflammation in the peripheral nerve: Cause, modulator, or bystander in peripheral neuropathies? Glia. 64, 475-486 (2016).
- Carriel, V., Garzón, I., Alaminos, M., Cornelissen, M. Histological assessment in peripheral nerve tissue engineering. Neural Regen. Res. 9, 1657-1660 (2014).
- Leong, T. Y. -M., Leong, A. S. -Y. How does antigen retrieval work? Adv. Anat. Pathol. 14, 129-131 (2007).
- Barrette, B., et al. Requirement of myeloid cells for axon regeneration. J. Neurosci. 28, 9363-9376 (2008).
- Liu, L., Yin, Y., Li, F., Malhotra, C., Cheng, J. Flow cytometry analysis of inflammatory cells isolated from the sciatic nerve and DRG after chronic constriction injury in mice. J. Neurosci. Methods. 284, 47-56 (2017).
- Pannell, M., et al. Adoptive transfer of M2 macrophages reduces neuropathic pain via opioid peptides. J. Neuroinflammation. 13, 262 (2016).
- Hidmark, A. S., Nawroth, P. P., Fleming, T. STZ causes depletion of immune cells in sciatic nerve and dorsal root ganglion in experimental diabetes. J. Neuroimmunol. 306, 76-82 (2017).
