Summary
We beschrijven een histochemische procedure die onthult karakteristiek laminaire en areal zink kleuring patronen in verschillende hersengebieden. Het patroon van zink-kleuring kan worden gebruikt in combinatie met andere anatomische markeringen op betrouwbare wijze onderscheiden lagen en regio's in de ontwikkelingslanden en volwassen brein.
Abstract
Karakterisering van de hersenen van de anatomische en functionele organisatie en ontwikkeling vereist nauwkeurige identificatie van afzonderlijke neurale circuits en regio's in de onvolwassen en volwassen brein. Hier beschrijven we een zink-histochemische kleuring-procedure die verschillen in kleuring patronen tussen verschillende lagen en hersengebieden onthult. Anderen hebben gebruikt deze procedure niet te onthullen van de verdeling van de zink-bevattende neuronen en circuits in de hersenen, maar ook om af te bakenen met succes areal en laminaire grenzen in de ontwikkelingslanden en volwassen hersenen in verschillende soorten. Hier we illustreren dit kleuring procedure met beelden uit ontwikkelingslanden en volwassen ferret hersenen. We onthullen een zink-kleuring patroon dat als een anatomische markering van gebieden en lagen fungeert, en op betrouwbare wijze kan worden gebruikt om te onderscheiden van de visuele corticale gebieden in de ontwikkelingslanden en volwassen visuele cortex. Het hoofddoel van dit protocol is te presenteren een histochemische methode waarmee de nauwkeurige identificatie van lagen en regio's in de ontwikkelingslanden en volwassen hersenen waar andere methoden niet in slaagt om dat te doen. Subsidiair, in combinatie met densitometric beeldanalyse, deze methode maakt het mogelijk om te beoordelen van de verdeling van de synaptische zink te onthullen van eventuele veranderingen in de gehele ontwikkeling. Dit protocol beschrijft in detail de reagentia, instrumenten en stappen die nodig zijn om achtereenvolgens vlek bevroren hersenen secties. Hoewel dit protocol wordt beschreven met behulp van ferret hersenweefsel, kan het gemakkelijk worden aangepast voor gebruik in knaagdieren, katten en apen ook zoals in andere hersengebieden.
Introduction
Histologische vlekken hebben van oudsher gebruikt om te helpen bij de identificatie van de corticale gebieden in verschillende soorten door te onthullen van de verschillen in architectonische kenmerken. Het gecombineerd gebruik van histochemische technieken zoals voor Nissl-substantie, cytochrome oxidase (CO) reactiviteit of myeline kan afwerpen als ze soortgelijke areal grenzen in het volwassen brein onthullen. Echter, deze histochemische vlekken niet altijd adequaat onthullen duidelijke grenzen tussen corticale gebieden en lagen in de onvolgroeide hersenen.
In het centrale zenuwstelsel heeft zink verscheidene kritieke functies waarin het stabiliseren van de DNA-structuur, die fungeert als een enzym cofactor, deelnemen aan diverse regelgevende functie, en fungeert als een neuromodulator door haar aanwezigheid in synaptische vesikels 1. synaptic zink is uniek, omdat het kan worden gevisualiseerd met behulp van de methoden van het histologische, overwegende dat eiwit-gebonden zink niet gevisualiseerde2. Deze functie heeft benut om te onthullen het patroon van de synaptische zink in verschillende corticale gebieden, en synaptische zink histochemie is gebruikt in een aantal studies. Een subset van glutamaterge neuronen in de cortex cerebri bevatten zink in de presynaptische blaasjes binnen hun axon terminals3,4. Histochemische studies is gebleken een heterogene verdeling van synaptic zink in de hersenschors5,6,7. Er lijkt te zijn van een verschillende areal en laminaire verdeling van histochemically reactieve zink in verschillende corticale gebieden (bijvoorbeeldvisuele versus Somatosensorische cortex) of lagen (b.v.zink niveau in de supragranular en infragranular lagen van primaire visuele cortex zijn aanzienlijk hoger dan in thalamocortical invoerlaag IV met relatief lage synaptic zink niveaus)5,8,9. De heterogeniteit in synaptic zink kleuring waargenomen in de cortex is vooral voordelig als het vergemakkelijkt areal en laminaire identificatie.
Hier presenteren we een gedetailleerde beschrijving van een synaptic zink histochemische procedure, die een gewijzigde versie van Danscher van 1982 methode10 is. Deze methode maakt gebruik van seleniet geïnjecteerd intraperitoneally (IP) in dieren als een chelaatvormer. De seleniet reist naar de hersenen om te reageren met zwembaden gratis zink in de blaasjes van een subset van glutamaterge synapsen in de hersenen gevonden. Deze reactie resulteert in een neerslag die vervolgens kan worden verbeterd door zilveren ontwikkeling2,10,11.
Deze procedure blijkt laminaire en areal patronen van synaptische zink kleuring; densitometric analyse kan worden gebruikt ter beoordeling van deze patronen zowel kwalitatief en kwantitatief in de volwassen en onvolgroeide hersenen effecten van andere ingrepen, zoals zintuiglijke, milieu, farmacologische of genetische manipulaties te bestuderen. Bovendien kan een ook willen beoordelen van mogelijke ontwikkelings veranderingen in de distributie van synaptic zink in andere corticale en subcorticale structuren in andere modelsystemen. De kwantitatieve gegevens die densitometric analyse in deze methode verschaft kan nuttig zijn voor de volgende ontwikkeling van de hersenen na verloop van tijd. Dit protocol biedt een metgezel te andere immuno - histochemische markeringen te onthullen van laminaire en areal grenzen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
het volgende protocol volgt de richtsnoeren van de dierenverzorgers opgericht door de institutionele dier zorg en gebruik Comité (IACUC) aan het City College van New York, die aan alle passende staat en federale richtlijnen voldoen. Narcose is geschikt voor fretten, en moet worden gewijzigd volgens soorten studeerde.
Figuur 1: overzicht van de belangrijke stappen die betrokken zijn bij de 3 fasen van dit protocol stroomdiagram en de benodigde tijd voor het voltooien van elke stap. Perioden waarvoor secties volledig drogen staan in groene tekst cirkels, terwijl alle andere stappen in witte tekst kringen zijn. De groene diamant-vormige tekstvak is een beslissingspunt, terwijl de rode rechthoek een cruciale stap is en moet worden uitgevoerd met extra zorg. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
1. voorbereidende stappen (schuif Subbing en het maken van de oplossing)
- unsubbed dia's met een detergent in warm water te wassen en spoel verschillende malen in warm water volgde met een gedestilleerd water Spoel grondig verwijderen modder of gruis bevatten. Laat dia's te drogen bij kamertemperatuur of in een oven bij 37 ° C.
- Zodra de dia's zijn volledig droog, laag een dunne zelfs laag van ei-wit op elke dia met behulp van de vingers of een verfkwast. Laten drogen in de oven op 60 ° C gedurende 20-30 min. Voor een optimaal resultaat te voorkomen uitglijden uit secties, toevoegen van een tweede laagje ei wit en laten drogen nogmaals in de oven op 60 ° C.
- Bereid een 1% gelatine oplossing door ontbinding van 1 gram gelatine in 100 mL warm water (60 ° C) en laat het afkoelen tot kamertemperatuur.
- 200 mL van de oplossing van de ontwikkelaar te bereiden, zoals hieronder beschreven voor gebruik in sectie 4.
- Voorbereiden Arabische gom oplossing door langzaam toe te voegen 40 g in stappen aan 120 mL warm water (het oplost gemakkelijker op deze manier). Roer de oplossing om met een glas rod roeren blijven. Zodra de oplossing volledig is opgelost, haal het van het vuur en laat ze afkoelen gedurende een paar minuten staan, filtreer vervolgens door 6-8 lagen van gaas doek in een trechter.
- Voorbereiden citraat buffer door toevoeging van 5.04 g citroenzuur plus 4.7 g Natriumcitraat in 20 mL dH 2 O en ontbinding van het mengsel. Ervoor zorgen dat de pH van deze oplossing 4.0 op 25 ° C. aanpassen de pH zo nodig door toevoeging van natriumhydroxide- of zoutzuur aan de oplossing.
- Bereid de Hydrochinon-oplossing door verwarming van 30 mL dH 2 O en ontbinding van 1,7 g Hydrochinon.
Opmerking: Opwarmen van de Hydrochinon oplossing is essentieel om te kunnen gemakkelijk oplossen in water, zoals Hydrochinon geen gemakkelijk oplosbaar in water op kamertemperatuur is. Wees voorzichtig om te houden van de temperatuur van het water lager dan 60 ° C, anders Hydrochinon kan worden geoxideerd. Als de oplossing omslaat naar geel, negeren en bereid een ander vers oplossing. - Voorbereiden zilver lactate oplossing door ontbinding van 0,22 g in 30 mL dH 2 O.
- Vermeng de oplossingen (1.4.1 - 1.4.4) in de volgorde waarin ze worden beschreven als u klaar bent voor het uitvoeren van de reacties (dat wil zeggen, na afdelen, drogen en vaststelling) ( Figuur 2). De zilveren lactaat oplossing aan het einde toevoegen. Waarborgen dat deze stap snel afgewerkt is en de ontwikkelaar-oplossing wordt geplaatst in het donker totdat het tijd om te reageren de secties zoals Zilveren lactaat lichtgevoelige is.
Figuur 2: schematische voorstelling ter illustratie van de volgorde van de stappen betrokken bij het de reagentia te mengen in de zink-histochemie periode van het protocol. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
2. dier behandeling en anesthesie
- voorafgaand aan het dier, sederende bereid een 1% natrium seleniet (nb 2 SeO 3)-oplossing door het oplossen van 10 mg Natriumseleniet in 1 mL dH 2 O.
- Anesthetize het dier met een intramusculaire injectie van ketamine (25 mg/kg) en xylazine (2 mg/kg).
Opmerking: Zorg ervoor dat een passend niveau van de verdoving wordt bereikt met behulp van de pedaal reflex reactie. - Inject zink complexvormer natrium seleniet oplossing (15 mg/kg) intraperitoneally (IP).
Opmerking: De toxiciteit van Natriumseleniet op verschillende leeftijden of in andere soorten kan variëren. - Laat 60 tot 90 min voor de Natriumseleniet om te reizen naar de hersenen. Tijdens deze periode, is het noodzakelijk om te zorgen dat het dier is goed verdoofd en niet-reagerende is, dus check diepte van anesthesie elke 5 min.
- Deperiode seleniet, terwijl het dier wordt verdoofd, ervoor zorgen dat de ogen worden gesloten ter voorkoming van droogte, of beheren van oogheelkundige zalf om ze te houden vochtige.
3. Weefsel voorbereiding en Staining
- het dier door het toedienen van een overdosis van natrium pentobarbital (100 mg/kg, i.p) euthanaseren.
- Uitvoeren transcardial perfusie met normale zoutoplossing voor 1 min en 4% paraformaldehyde voor 20 min. ten slotte beheren een oplossing met 4% paraformaldehyde en 10% sacharose (een totale fixatie periode van 1U).
- Het hoofd met behulp van een paar grote schaar verwijderen.
- Maken van een incisie van de middellijn met behulp van een scalpel vanaf de neus naar de nek om bloot van de schedel.
- Verwijder voorzichtig de hersenen en het scheiden van de hemisferen met een mes.
- Blokkeren het posterieure deel van de hersenen en postfix in 4% paraformaldehyde in 0,1 M fosfaatbuffer (PB) voor enkele uren.
- Plaats van de blokken in een 30% sacharoseoplossing in 0,1 M PB en laat de hersenen te zinken.
Opmerking: De 4% paraformaldehyde en 30% sacharoseoplossing vervangen door 30% sacharoseoplossing in 0,1 M PB te zinken van de hersenen beperkt de hersenen ' s blootstelling aan paraformaldehyde als dit kan invloed hebben op weefsel kleuring kwaliteit. - Eens de hersenen putten, gesneden semi-tangentiële 40 µm dik secties door middel van de visuele cortex of regio van rente op een bevriezing, glijdende microtoom of cryostaat. Dit kan worden bereikt door het plaatsen van het blok met het mediale oppervlak neer en zachtjes afvlakken met een glasplaatje.
- Verzamelen secties met een penseel en winkel in een doos van de pakken met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
- Scheiden de secties in afzonderlijk genummerde reeks. Direct monteren een of twee reeksen van hersenen secties op ei-wit subbed dia's (sectie 1), laat droog 's nachts bij kamertemperatuur, en verwerken van secties histochemically voor synaptic zink.
Opmerking: Andere series mogen worden verwerkt voor andere merkers voor vergelijking, zoals myeline 12 of cytochroom oxidase met behulp van de gewijzigde protocol 13: Incubeer gedurende 2-8 h bij 40 ° C met 3 gewichtspercenten sacharose, 0,015% cytochroom C, katalase 0,015% en 0,02% diaminobenzidine in 0,1 M PB. Nissl stof kan ook worden gebruikt als een histologische merker voor de visuele corticale gebieden onderscheiden. Deze andere histologische vlekken vereisen niet dat de hersenen secties zijn gemonteerd op ei-wit subbed dia's, zodat de traditionele gelatine bedekt dia's kunnen worden gebruikt in plaats daarvan.
4. Synaptic zink histochemie
- Fix dia gemonteerd secties in absolute alcohol gedurende 15 minuten en laten drogen volledig bij kamertemperatuur voor 1 h. < lik > kort onderdompelen secties voor 10 s in een oplossing van 1% gelatine (sectie 1) en laat het droge overnachting bij kamertemperatuur.
- Meng de oplossingen zoals beschreven in stap 1.8 zodra secties zijn klaar om te worden gereageerd.
- Reageren de secties door de dia's naast elkaar in een glas of plastic lade rangschikken en gieten de ontwikkelende oplossing in de dia's. Controleren of dia's zijn volledig ondergedompeld in de oplossing en breng de lade in een donkere ruimte, of bedek met een licht-strakke vak.
Opmerking: Een kunststof dienblad thats ongeveer 12 inches long door 8 inch breed inzetbaar, die past precies 18 dia's. Een totaal volume van 200 mL ontwikkelaar oplossing is voldoende om volledig onderdompelen van de dia's, dus zorg ervoor dat het juiste volume wordt gebruikt voor het aantal dia's worden gereageerd en het recept dienovereenkomstig aan te passen. Gebruik van een plastic of glas lade in plaats van een metalen lade is aan te raden als er een zekere mate van grensoverschrijdende reactiviteit tussen de zilveren lactaat in de oplossing van de ontwikkelaar en het ijzer is of andere gevonden in metalen dienbladen metalen.
- Reageren de secties door de dia's naast elkaar in een glas of plastic lade rangschikken en gieten de ontwikkelende oplossing in de dia's. Controleren of dia's zijn volledig ondergedompeld in de oplossing en breng de lade in een donkere ruimte, of bedek met een licht-strakke vak.
- Toezicht op de ontwikkeling van de reactie door visueel inspecteren de secties elke 30 min. De secties in het algemeen vereisen 120-180 min voor volledige ontwikkeling.
- Als secties worden overstained (Zie Figuur 3a), onderscheid maken in 2% boer ' s oplossing (9 delen 2% natrium thiosulfate in dH 2 O en 1 deel 2% kalium Hexacyanoferraat in dH, 2 O) voor 1-2 min.
Opmerking: Monster-sectie die is slecht gekleurd wordt weergegeven in Figuur 3b. - Zodra de gewenste intensiteit bereikt is, de reactie beëindigen door het verwijderen van de dia gemonteerd secties uit de lade en het plaatsen van de dia's op een dia rek.
- Plaats de dia rek in een grote glazen schotel kleuring en wassen van de dia's in warm (40-50 ° C) stromend water gedurende 10 minuten om de vacht van de gelatine en de buitenste zilveren storting.
Opmerking: Wees voorzichtig niet te doorroeren het dia-rek om te voorkomen dat secties uit uitglijden. De gewenste intensiteit van de sectie wordt bereikt wanneer voldoende laminaire variatie duidelijk is en secties donker genoeg maar niet overdreven (Zie figuur 4a zijn). - Laat de dia's te drogen bij kamertemperatuur, en vervolgens uitdrogen in 100% EtOH (5 min), duidelijk in xyleen (5 min) en cover slip met een montage-medium. U kunt ook plaats de dia's in een oplopende reeks van alcohol en vervolgens uitdrogen, duidelijk, en dekglaasje aan.
- Gebruik secties van dieren zonder eerdere seleniet behandeling om te dienen als een negatieve controle. Zilveren versterking van deze secties moet opleveren, geen kleuring.
Opmerking: Voor optimale resultaten kunt u secties te droog 's nachts. Secties te droog 's nachts waardoor levert betere weefsel kleuring.
Figuur 3: Synaptic zink vlekken in de hersenen van het jonge ferret. Photomicrographs van semi-tangentiële zink gebeitste secties die a) overstained en b) understained in de hersenen van het jonge ferret. Areal grenzen zijn moeilijk te onderscheiden zoals laminaire variatie ontbreekt. Witte stof is ook sterk gekleurd. Ssy Suprasylvian cortex, WM White matter, een anterior, D dorsale. Schaal bar = 500 µm (a-b). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
5. onderscheiden Areal grenzen en beeldacquisitie
- gebruik architectonische kenmerken van verschillende hersengebieden voor areal en laminaire identificatie.
Opmerking: bijvoorbeeld, in de ontwikkelingslanden rat retrosplenial cortex 14, de auteurs bleek een voorbijgaande modulariteit gekenmerkt door zware kleuring voor zink, die is niet aanwezig in de volwassene, maar kan worden gebruikt om te beschrijven corticale organisatie tijdens de ontwikkeling in deze soort. In een andere studie 15 bleek de auteurs specificiteit in de synaptische zink-verdeling van de verschillende kernen gevonden in de makaak monkey amygdala, die de identificatie van deze verdeeldheid te vergemakkelijken. Visuele corticale gebieden in de ontwikkelingslanden en volwassen ferret hersenen geweest eerder beschreven 16 , 17 , 18, architectonische onderverdeling van de neocortex in de grijze eekhoorn werden beschreven 19. Bovendien, zink histochemie werd eerder gebruikt om te onderscheiden tussen verschillende gebieden van de volwassen aap visuele cortex 8, ontwikkelen en volwassen kat visuele cortex 5, ontwikkeling van rat Somatosensorische cortex 9 , 20 en volwassen muis Somatosensorische cortex 6 , 21. Indien beschikbaar, vergelijk de kleuring patroon in myeline bevlekt, cytochrome oxidase (CO) gekleurd en synaptische zink gekleurd hersenen secties, om te bevestigen areal grenzen in de volwassene. In semi-tangentiële secties van de visuele cortex ferret gekleurd voor synaptic zink, zijn er opvallende verschillen tussen de visuele corticale gebieden die areal identificatie te vergemakkelijken. Bijvoorbeeld onthullen gebieden 17 en 18 van de volwassen ferret dat synaptic zink kleuring hoog in lagen III is en V. laag VI minder intens, vlekken terwijl laag IV bijna zink mist. Het opvallende gebrek aan zink kleuring in laag IV of gebieden 17 en 18 staat in contrast met het donker gekleurde band gevonden in laag dat IV in CO gekleurd secties. Echter laag IV van gebied 17 in CO gekleurd secties onderhoudt een scherpe grens met lagen III en V, maar laag IV in het gebied 18 wordt gekenmerkt door een subtiele afname van de kleuring van de intensiteit en de bovenste grens gevonden in laag III is minder te onderscheiden. - Onderzoeken van secties helderveld microscopie met de doelstelling van een laag energieverbruik (2 X of 4 X vergroting) en gebieden van belang fotograferen.
- Verfraaien contrast en de helderheid van de photomicrographs met behulp van beeld processing software. Beelden verkregen voor extinctie metingen niet mag worden getornd geenszins.
Figuur 4: Synaptic zink vlekken in het brein van volwassen ferret onderscheidt verschillende visuele corticale gebieden. Photomicrographs van aangrenzende semi-tangentiële secties gekleurd voor (een) synaptic zink of (b) cytochroom oxidase (CO) in de volwassene. Pijlen mark areal grenzen. Ssy Suprasylvian cortex, een anterior, D dorsale. Schaal bar = 500 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
6. densitometrie (optioneel)
Opmerking: Densitometric analyse kan worden gebruikt ter beoordeling van de verdeling van de synaptische zink in de hersenen door het meten van de extinctie van representatieve zink gekleurd secties in de regio's van belang. Deze methode is ook nuttig voor het opsporen van eventuele veranderingen in synaptic zink niveau van ontwikkeling.
- Gebruiken geselecteerd zink gebeitste secties, kiezen willekeurig corticale kolommen (in kolomvorm photomicrographs) van passende breedte (een 450 µm brede kolom kan worden gebruikt) verworven photomicrographs van de regio van belang. Een corticale kolom is een gebied dat alle corticale lagen van het pial oppervlak aan de witte stof.
- Een passend aantal monster kolommen kiezen uit meerdere verschillende hersenen secties in elk gebied van belang.
- Pipetteer sample images van representatieve kolommen in een beeldverwerkingssoftware.
- Gebruik van het gereedschap rechthoekige selecteren te omvatten de gehele corticale kolom.
- Gebruiken omkeren om te maken dat een contrast omgekeerd beeld lijkt op een fotografische negatief van de kolom.
Opmerking: Contrast inversie van de beelden is zodanig dat deze hoge optische dichtheid voor hoge synaptic zink niveaus en lage extinctie waarden voor laag synaptic zink niveaus uitgevoerd. Dit is een meer intuïtieve manier om te renderen perceel profiel grafieken vergelijkbaar met degene die gezien in Figuur 5. - Profielen van de optische dichtheid van deze beelden te produceren met behulp van het gereedschap Tekengebied profiel voor het genereren van een tweedimensionale grafiek van de pixel intensiteiten langs een lijn.
- Plot-opties gebruiken om de plot profiel grafiek omzetten in een verticaal profiel en klik op perceel profile eenmaal meer.
Opmerking: De x-as vertegenwoordigt afstand langs de lijn en de y-as geeft de intensiteit van de pixel. Dus, de waarde van elk perceel profiel weerspiegelt de waarde van de gemiddelde grijstinten op iedere diepte over de breedte van de kolom. - Open perceel profiel waarden als tekstbestanden in werkblad, normaliseren, en plot als grafieken (Zie Figuur 5).
Opmerking: Het is raadzaam om het gebruik van de relatieve dichtheid van synaptic zink voor vergelijking van kwantitatieve metingen, zoals resultaten kunnen worden verward door variatie in totale kleuring intensiteit als gevolg van verschillende reactietijden, stainability van weefsel, alsmede andere variabelen. - Relatieve zink dichtheid berekenen door het uitvoeren van een gemiddelde boxcar van de plot profiel waarden om de gegevens te glad.
Opmerking: Dit wordt bereikt door het gemiddeld, bijvoorbeeld elke opeenvolgende 20 of 30 pixels (1 pixel = 2,5 µm) in de diepte, en vervolgens naar maximale intensiteit voor elk monster normaliseren. Dus, elke gemiddelde perceel profielwaarde geeft de waarde van de gemiddelde grijstinten op die diepte (grijstinten waarden variëren van 0 tot 255). Een verschillende normalisatie-methode kan worden gebruikt door eerste verwervende witte stof (WM) optische dichtheid waarden uit monster regio's waaronder de onderliggende witte stof in de gebieden van belang. In het ideale geval Kies verschillende regio's, dat zijn zo licht mogelijk te verkrijgen van een gemiddelde waarde van de WM gekleurd. Gemiddelde extinctie waarden worden vervolgens gedeeld door gemiddelden om WM genormaliseerde waarden te verkrijgen in de WM. - Bepalen gemiddelde waarden van de optische dichtheid in bepaalde lagen van regio's van belang voor de vergelijkingen van de kwantitatieve.
Opmerking: bijvoorbeeld de waarde van de gemiddelde minimale optische dichtheid in laag IV van visuele corticale gebieden voor de ferret worden bepaald door de minste gebeitst regio omvat ±5 pixels. - Berekenen gemiddelde optische dichtheid waarden in de supragranular en infragranular lagen van visuele corticale gebieden voor de ferret door omvat de donkerste gebeitst regio ±5 pixels om te bepalen van de gemiddelde maximumwaarde.
- Zorg ervoor dat de gemiddelde waarden van de optische dichtheid worden verkregen binnen bepaalde lagen.
Opmerking: Het is noodzakelijk om te controleren of de grenzen van deze lagen in het contrast ondersteboven afbeeldingen door ze te vergelijken aan de oorspronkelijke photomicrographs evenals de aangrenzende CO-sectie. Dit garandeert dat een niet op aangrenzende lagen uitsteken doet.
Figuur 5: laminaire verdeling van synaptic zink in verschillende visuele corticale gebieden in de volwassen ferret. Representatieve photomicrographs van kolommen door alle corticale lagen met bijbehorende genormaliseerde extinctie profielen in een volwassene. Lage synaptic zink dichtheid in laag IV van volwassen gebieden 17 en 18 wordt aangegeven door de trog in de plot van het profiel. In elk perceel-profiel geven gevulde ovalen in de trog van laag IV de waarden gebruikt om te bepalen van de gemiddelde minimale intensiteit pixelwaarde. Schaal bar = 200 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De grote stappen die betrokken zijn bij dit protocol om vlek hersenen secties voor synaptic zink worden gepresenteerd in een stroomdiagram in Figuur 1. Het protocol kan worden onderverdeeld in drie fasen: 1) perfusie en weefsel collectie 2) weefsel voorbereiding en kleuring en 3) zink histochemie. Kort, tijdens de eerste fase van het protocol, het dier wordt verdoofd en IP met de juiste dosis Natriumseleniet geïnjecteerd. Na een voldoende lange tijdsperiode (idealiter 60-90 min), is het dier vervolgens euthanized, geperfundeerd met 0,9% NaCl-oplossing gevolgd door een 4% paraformaldehyde-oplossing. Het hoofd is onthoofd, en de hersenen is snel van de schedel verwijderd. De hersenen is dan toegestaan te zinken in een 4% paraformaldehyde plus 30% sacharoseoplossing als cryoprotectant. In de tweede fase van het protocol, zijn bevroren secties gesneden-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) op een glijdende microtoom op 40 µm en onderverdeeld in genummerde reeks. Het is belangrijk te monteren secties op ei-wit subbed dia's onmiddellijk na het segmenteren, daarbij secties te droog 's nachts voor een optimaal resultaat. Gelatine subbed dia's zijn niet aanbevolen omdat de chroom kalium sulfaat meestal gebruikt in de subbing oplossing cross-reacts met de zilveren lactaat, hetgeen tot suboptimaal kleuring. Secties worden vervolgens gedurende 15 min in absolute alcohol en links naar volledig drogen bij kamertemperatuur geïncubeerd. Deze stap is gevolgd door een korte onderdompeling van de gemonteerde secties in 1% gelatine oplossing bereid tevoren, en toegestaan om te drogen 's nachts voor een optimaal resultaat. In de laatste fase van het protocol (zink histochemie), de ontwikkelaar oplossing is bereid volgens de stappen in de sectie methoden en dia's worden geplaatst in een lade van het plastic of glas ondergedompeld in de oplossing. De ontwikkeling van de vlek duurt meestal ergens tussen 2-3 h, maar nauwe visueel onderzoek is noodzakelijk om te voorkomen dat overstaining van de secties. Wanneer de juiste intensiteit wordt bereikt, moeten dia's worden verwijderd, geplaatst op een dia rek en gespoeld in warm water gedurende 5-10 min te verwijderen van de buitenste zilveren storting. De secties kunnen vervolgens worden gedroogd bij kamertemperatuur, gewist en coverslipped. Een schematische voorstelling van de specifieke stappen vereist voor het voltooien van de zink-histochemie periode van het protocol is afgebeeld in Figuur 2.
Dit protocol maakt gebruik van synaptic zink histochemie te onthullen areal en laminaire variatie in kleuring niveaus onder de visuele corticale gebieden in de hersenen van de fret. Dit protocol kan worden aangepast voor gebruik in andere soorten zo goed zoals in andere hersengebieden. Bijvoorbeeld, onderzoekers bestuderen van andere zintuiglijke cortices zoals de somatosensorische, auditieve of frontale cortex van de fret of een ander modelsysteem zou veel baat hebben bij het gebruik van deze histochemische vlek. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het duidelijk overgangen tussen gebieden areal identificatie bij volwassenen te vergemakkelijken, alsook het betrouwbaar onderscheid corticale gebieden bij jonge dieren zoals knaagdieren, fretten, katten en apen.
Figuur 3a geeft een voorbeeld van een zink gebeitst sectie die we per ongeluk ontwikkeld voor te lang en dus was overstained in het proces. Overstained weefsel wordt gekenmerkt door een zeer donker bruine kleur en een gebrek aan laminaire variatie, en sterk gekleurd witte stof. Zink gebeitste hersenen secties kunnen echter soms worden understained, zoals getoond in Figuur 3b. Understained secties kunnen soms optreden als het dier niet voor een voldoende hoeveelheid tijd (ten minste 60 min), die alle de ingespoten seleniet overleven uit reizen naar de hersenen. Understaining van weefsel kan ook optreden als de seleniet was niet goed beheerd en daarom niet naar de hersenen reisden.
De heterogene verdeling van synaptic zink kleuring in meerdere visuele corticale gebieden in een volwassen ferret wordt weergegeven in een representatieve semi-tangentiële sectie in figuur 4a. De pijlen wijzen naar areal grenzen. In gebieden 17 en 18, de kleuring intensiteit van synaptic zink is over het algemeen hoog in lagen I, II, III en V, laag in de laag IV (thalamorecipient laag) en matig in laag VI. De aanwezigheid van een duidelijk herkenbare overgang tussen gebieden 17 en 18 blijkt uit figuur 4a. Laag IV kleuring intensiteit in het gebied 18 iets verhoogt en laag V vermindert en is van variabele intensiteit. Figuur 4b is een aangrenzende sectie gekleurd voor cytochroom-oxidase (CO) dat illustreert soortgelijke plaatsen van areal grenzen die we met de zink-vlek waargenomen. Regio's van 17 en 18 met hoge niveaus van zink in het algemeen lijken te hebben lage niveaus van CO kleuring.
De verdeling van de synaptische zink in gebieden 19 en 21 is kwalitatief vergelijkbaar in dat beide gebieden minder laminaire variatie dan in gebieden 17 en 18 hebben. Laag IV van gebieden 19 en 21 is duidelijk anders dan laag IV in gebieden 17 en 18 in die zin dat het matig is gekleurd. De lagen van het supragranular en infragranular van ruimte 19 zijn van dezelfde intensiteit, maar laag V iets donkerder vlekken. Gebied 21 heeft een vergelijkbare synaptic zink distributie naar dat gebied 19. Echter wordt laag VI van ruimte 21 gekenmerkt door grotere synaptic zink niveau dan laag IV van gebied 19. Lagen VI IV van Suprasylvian (Ssy) lijken te worden matig gekleurd en zijn van vergelijkbare intensiteit, terwijl laag V wordt gekenmerkt door grotere synaptic zink niveaus en de supragranular lagen zijn gekenmerkt door een wisselende patroon van synaptic zink niveau.
Kwantitatieve beoordeling van de verdeling van synaptic zink in verschillende hersengebieden, met verschillende behandelingen, of op verschillende leeftijden, kan worden bereikt, indien gewenst. Bijvoorbeeld, kan men wil beoordelen van veranderingen in de distributie van synaptic zink bij volwassenen of in de gehele ontwikkeling in primaire visuele, auditieve, en somatosensorische cortices in elk modelsysteem. Met behulp van densitometric analyse, wij hebben eerder aangetoond dat de verdeling van de synaptische zink in meerdere visuele gebieden (17, 18, 19, 21 en Suprasylvian) van de ontwikkelende hersenen van de fret, aanzienlijk dalen van vijf tot zes weken van leeftijd17. Hier beschrijven we de stappen die nodig zijn voor de beoordeling van de verschillen in de verdeling van de synaptische zink bij representatieve monsters uit een volwassen ferret ter illustratie van het proces. Deze stappen kunnen worden gevolgd om wijzigingen in de verdeling van de synaptische zink in jonge ferret visuele cortex zo goed zoals in elke andere soort of hersenen gebieden te houden. Figuur 5 toont vertegenwoordiger in kolomvorm photomicrographs van secties van de volwassen hersenen verwerkt voor zink histochemie samen met hun complementaire genormaliseerde extinctie perceel profielen. Genormaliseerde percelen van optische dichtheid waarden werden gegenereerd zodat wijzigingen volgens de corticale diepte. Vandaar, de waarde van elk perceel profiel weerspiegelt de waarde van de gemiddelde grijstinten op opeenvolgende corticale diepten. Bijvoorbeeld worden gebieden 17 en 18 gekenmerkt door een opvallende daling van zink kleuring in laag IV (vertegenwoordigd door de trog), die blijkt uit de profielen van hun perceel. Betekenen minimale extinctie waarden in gebieden 17 en 18 worden aangeduid met de zwarte ovalen ingevuld. De lage zink kleuring waargenomen in laag IV van gebieden 17 en 18 contrasten met de enige een subtiele duik in zink niveaus in gebieden Ssy, 19 en 21. Collectief, gebieden 19, 21 en Ssy zijn kwalitatief verschillend dan gebieden 17 en 18 in dat zink niveaus binnen alle lagen is meer homogeen dan in gebieden 17 en 18. Bovendien, de supragranular lagen en laag V van gebieden 17 en 18 vlek doorgaans intenser dan laag VI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De huidige studie maakt gebruik van een histochemische techniek gebaseerd op een gewijzigde versie van de Danscher (1982) methode10, waarbij de lokalisatie van de synaptische zink kan worden gedetecteerd en gevisualiseerd in de hersenen. Deze methode werkt in wezen door het injecteren van het dier met de zink complexvormer Natriumseleniet (nb2van SeO3) (15 mg/kg). Na injectie, de seleniet reist naar de hersenen en bindt aan gratis zink die is gelokaliseerd aan de presynaptische blaasjes van zink bevattende neuronen. Zink ionen gebonden aan moleculen binnen synaptische vesikels neerslag, en vervolgens kunnen worden gevisualiseerd door middel van lichamelijke ontwikkeling2,11. De oorspronkelijke Timm zwavelwaterstof zilver kleuring methode was bedoeld om te ontdekken en visualiseren van een aantal zware metalen zoals Au, Ag, Pt, Fe, Cd, Cu, Ni en Zn in biologische weefsels22. De chelaatvormer gebruikt voor deze methode is natriumsulfide. Daarom is een groot probleem met het gebruik van de Timm zwavelwaterstof methode het gebrek aan specificiteit als elk metaal die omgebouwd kan worden tot een metalen zwavelwaterstof inderdaad zilver versterkt door fysieke ontwikkeling zou kunnen zijn. De gewijzigde versie van de Danscher-methode die wordt gebruikt in de huidige studie is echter specifiek voor zink en geen andere zware metalen. Er zijn enkele verschillen tussen Danscher van 1982 methode en de huidige methode we in deze studie beschrijven. De Danscher methode resulteert verse nietgefixeerde hersenweefsel terwijl we bevroren weefsel wordt gebruikt. Glutaaraldehyde Danscher ook gebruikt voor de perfusie, terwijl wij paraformaldehyde gebruiken zoals dit meer compatibel met immunohistochemische en andere histologische markeringen die we routinematig vlek is voor in ons lab. Danscher maakt ook gebruik van poststaining procedures zoals toluïdine blauw (1%), die we niet in onze methode uitvoert.
Een beperking van de huidige techniek is de onvoorspelbaarheid in verband met natrium seleniet tolerantie door dieren. Wij vinden dat na beheert de Natriumseleniet, soms dieren niet langer dan 30 minuten overleven. Deze situatie vormt een probleem, zoals niet genoeg tijd voor de seleniet om te reizen naar de hersenen toe, en verdere ontwikkeling van de hersenen secties meestal tot ongelijke weefsel kleuring leidt. Een andere mogelijke beperking houdt verband met de juiste toediening van het intraperitoneaal injecteren van Natriumseleniet. Een moet trekken op de huid boven de lagere buikholte en plaats de naald schuine zijde omhoog in een hoek van 15-20 graden, doordringende alleen de buikwand. De naald moet worden trok zich terug iets om ervoor te zorgen dat de buikorganen zijn niet is doorgedrongen en materiaal heeft niet geweest aanzuiging. De naald moet worden verwijderd en vervangen als dit gebeurt.
Kleuring resultaten van hoge kwaliteit en reproduceerbaarheid te garanderen, raden we de volgende waarschuwend maatregelen. Goede rechtsbedeling Natriumseleniet in de dierlijke en maximaliseren overlevingstijd van het dier (60 tot 90 min is optimale) voor euthanizing, zijn van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat voldoende tijd wordt gegeven voor de seleniet om te reizen naar de hersenen. We hebben gevonden dat kortere overleving perioden (30 minuten of minder) meestal leiden tot ongelijke weefsel kleuring. Ook montage secties in ei-wit subbed dia's onmiddellijk na afdelen van het blok een cruciale stap is. Verlaten van vers gesneden bevroren secties in PBS voor een aantal dagen is sterk aangeraden tegen zoals zink ionen uit naar oplossing uitspoelen zal. Tijdens de voorbereiding van de ontwikkelaar-oplossing is het van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat de citraat-buffer is van de juiste pH (4.0) zoals deze reactie heel gevoelig voor kleine veranderingen in de pH is. Ook wanneer de verwarming de Hydrochinon oplossing is het noodzakelijk om de temperatuur lager dan 60 ° C te houden, als de verdere verwarming zal oxideren van de oplossing en remmen de vlek. Ook is kort dompelen de dia gemonteerde secties in gelatine kritiek als het voorkomt niet-specifieke afzetting van zilver op het oppervlak van de sectie dat. Secties mag echter niet worden overgelaten in de gelatine oplossing langer dan 10 s als dit zullen ze verschrompelen omhoog leidt tot ongelijke weefsel kleuring. Periodieke visuele inspectie van de secties terwijl in ontwikkelaar oplossing wordt geadviseerd sinds het verlaten van dat de secties te lang kunnen leiden tot overstaining. Deze vlek is vrij temperatuur gevoelig, zodat secties de neiging om sneller ontwikkelen wanneer de omgevingstemperatuur is warm en langzamer wanneer de temperatuur is koeler. Tot slot kan een wil voorzichtig schudden van de dia's in de dia-rek tijdens de spoeldouche stap in warm water op te heffen van de gelatine en de resterende zilveren storting van de dia's. Echter overdreven en onzorgvuldig agitatie van secties terwijl dia's met warm water spoelen leiden secties te glippen tot kan uit de dia's en moet worden vermeden. Het is ook cruciaal om dat een behoorlijke controle wordt gebruikt voor densitometric metingen om kwantitatieve vergelijkingen te maken. Men kan een licht gekleurd of niet-kleuring regio potentieel gebruiken als een interne controle. In ons materiaal gebruiken we witte stof als een besturingselement te normaliseren extinctie waarden in verschillende visuele corticale gebieden in ontwikkeling. Wij vinden dat de witte stof waarden vergelijkbaar in verschillende leeftijden en in de volwassen17 zijn. Daarom, gezien het feit dat witte stof waarden niet als een functie van de leeftijd veranderen, witte stof fungeert als een geldige controle voor densitometric analyse.
Het belangrijkste voordeel van deze methode is dat het een eenvoudige en betrouwbare histochemische vlek waarvan de distributie kan worden gebruikt, zoals andere histochemische markers, te onderscheiden van de hersengebieden. Echter, het gebruik van deze histochemische methode mogelijk niet geschikt voor de studie van bepaalde cel populaties (die ontbreekt zink), of bij zeer jonge dieren als synaptic zink aanvankelijk laag zijn bij de geboorte zoals aangegeven bij de ontwikkeling van de muis somatosensorische en visuele cortex van de kat5 ,20. Een ander voordeel van dit protocol is dat het kan worden gebruikt in combinatie met neuroanatomische tracerproeven injectie. In ons lab injecteren we meestal een bidirectionele neuronale tracer in de primaire visuele cortex van jonge fretten te bestuderen developmental veranderingen in het patroon van de connectiviteit tussen meerdere gebieden in de visuele cortex. Daarom hoeven dieren niet worden uitsluitend gebruikt voor zink histochemie als de dieren kunnen worden misbruikt voor een andere experimentele studie. Het grote voordeel van de beschreven methode is dat het aangepast voor gebruik in andere soorten en in andere hersengebieden worden kan. Hoewel we hebben aangetoond dat deze methode met behulp van ferret hersenweefsel, kunnen er subtiele verschillen in aantal stappen bij de studie van het hersenweefsel van knaagdieren, katten en apen. Anderen hebben deze zink histochemische methode met succes gebruikt ter illustratie van de verschillen in het patroon in volwassen aap visuele cortex8, ontwikkelen en volwassen kat visuele cortex5, ontwikkeling van rat Somatosensorische cortex9 kleuring , 20, volwassen muis Somatosensorische cortex6,21en volwassen Parma wallaby visuele cortex7.
Hier duidelijk naar voren komt welke basisstappen van het protocol en onderstrepingsteken belangrijke parameters die moeten worden gecontroleerd om consequent hoge kwaliteit zink kleuring. Men zou willen veranderingen in synaptic zink niveaus in andere sensoriële of motorische cortices of subcorticale structuren in andere dieren model beoordelen. De kwantitatieve informatie dat densitometric eennalysis biedt in deze methode kan nuttig zijn voor het volgen van de corticale ontwikkeling in de tijd en eventueel onthullende verschillende ontwikkelings profielen van synaptic zink niveaus tussen verschillende hersengebieden (zoals we hebben eerder17). Een belangrijke overweging is de ontwikkelingstoxiciteit vraag en de bijbehorende leeftijd van de dieren te bestuderen. Synaptic zink histochemie blijkt duidelijk identificeerbare visuele corticale gebieden in fretten en kan dienen als een nuttige gids vormt in verdere studies van corticale organisatie en functie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies van het National Center for onderzoeksmiddelen (2G12RR03060-26A1); Het National Institute on minderheid gezondheid en gezondheid verschillen (8G12MD007603-27) van de National Institutes of Health; Professioneel personeel Congres-City University of New York (PSC-CUNY); en faculteit Research Grant (FRG II) Amerikaanse Universiteit van Sharjah. Wij danken Vidyasagar Sriramoju voor het introduceren van ons aan deze methoden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Euthasol (Euthanasia solution) | Henry Schein | 710101 | |
| Sodium selenite | Sigma-Aldrich | 214485 | |
| Ketamine (Ketaved) | Henry Schein | 48858 | 100 mg/ml injectables |
| Xylazine (Anased) | Henry Schein | 33198 | 100 mg/ml injectables |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Dilute to 4% |
| Gum arabic | Sigma-Aldrich | G9752-500G | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C1909 | |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | W302600 | |
| Hydroquinone | Sigma-Aldrich | H9003 | |
| Silver lactate | Sigma-Aldrich | 85210 | |
| Fish gelatine | Sigma-Aldrich | G7765 | |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C2506 | (Type III, from equine heart) |
| Catalse | Sigma-Aldrich | C10 | |
| Sucrose | Domino | ||
| Xylene | Fisher Scientific | X5P-1GAL | |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| 100% Ethanol | Fisher Scientific | A406-20 | Used for dehydration prior to slide mounting |
| Coverslips | Brain Research Laboratories | #3660-1 | |
| Frosted unsubbed slides | Brain Research Laboratories | #3875-FR | |
| Microtome | American Optical Company | 860 | |
| Microscope | Olympus | BX-60 | |
| Adope Photoshop | Adobe Systems, San Jose, CA | To assemble images | |
| ImageJ | Free software can be downloaded at http://rsb.info.nih.gov/ij/ | For densometric measurements | |
| Plastic tray | Any standard plastic tray may be used | to immerse slides in developer solution | |
| Hot plate | Any standard hotplate may be used |
References
- Nakashima, A., Dyck, R. H. Zinc and cortical plasticity. Brain Res. Rev. 59, 347-373 (2009).
- Frederickson, C. J. Neurobiology of zinc and zinc-containing neurons. Int Rev Neurobiol. 31, 145-238 (1989).
- Beaulieu, C., Dyck, R., Cynader, M. Enrichment of glutamate in zinc-containing terminals of the cat visual cortex. NeuroReport. 3 (10), 861-864 (1992).
- Martinez-Guijarro, F. J., Soriano, E., Del Rio, J. A., Lopez-Garcia, C. Zinc-positive boutons in the cerebral cortex of lizards show glutamate immunoreactivity. J Neurocytol. 20 (10), 834-843 (1991).
- Dyck, R., Beaulieu, C., Cynader, M. Histochemical localization of synaptic zinc in the developing cat visual cortex. J Comp Neurol. 329 (1), 53-67 (1993).
- Garrett, B., Geneser, F. A., Slomianka, L. Distribution of acetylcholinesterase and zinc in the visual cortex of the mouse. Anat Embryol. (Berl). 184 (5), 461-468 (1991).
- Garrett, B., Osterballe, R., Slomianka, L., Geneser, F. A. Cytoarchitecture and staining for acetylcholinesterase and zinc in the visual cortex of the Parma wallaby (Macropus parma). Brain Behav Evol. 43 (3), 162-172 (1994).
- Dyck, R., Cynader, M. An interdigitated columnar mosaic of cytochrome oxidase, zinc, and neurotransmitter-related molecules in cat and monkey visual cortex. Proc. Natl. Acad. Sci. (90), 9066-9069 (1993).
- Land, P. W., Akhtar, N. D. Experience-dependent alteration of synaptic zinc in rat somatosensory barrel cortex. Somatosens Mot Res. 16 (2), 139-150 (1999).
- Danscher, G. Exogenous selenium in the brain: a histochemical technique for light and electron microscopic localization of catalytic selenium bonds. Histochemistry. 76, 281-293 (1982).
- Danscher, G., Howell, G., Perez-Clausell, J., Hertel, N. The dithizone, Timm's sulphide silver and the selenium methods demonstrate a chelatable pool of zinc in CNS: a proton activation (PIXE) analysis of carbon tetrachloride extracts from rat brains and spinal cords intravitall treated with dithizone. Histochemistry. 83, 419-422 (1985).
- Gallyas, F. Silver staining of myelin by means of physical development. Neurol Res. 1 (2), 203-209 (1979).
- Wong-Riley, M. Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry. Brain Res. 171 (1), 11-28 (1979).
- Miró-Bernié, N., Ichinohe, N., Perez-Clausell, J., Rockland, K. S. Zinc-rich transient vertical modules in the rat retrosplenial cortex during postnatal development. J Neurosci. 138 (2), 523-535 (2006).
- Ichinohe, N., Rockland, K. S. Distribution of synaptic zinc in the macaque monkey amygdala. J Comp Neurol. 489 (2), 135-147 (2005).
- Innocenti, G. M., Manger, P. R., Masiello, I., Colin, I., Tettoni, L. Architecture and callosal connections of visual areas 17, 18, 19 and 21 in the ferret (Mustela putorius). Cereb Cortex. 12 (4), 411-422 (2002).
- Khalil, R., Levitt, J. B. Zinc histochemistry reveals circuit refinement and distinguishes visual areas in the developing ferret cerebral cortex. Brain Struct Funct. 218, 1293-1306 (2013).
- Manger, P. R., Masiello, I., Innocenti, G. M. Areal organization of the posterior parietal cortex of the ferret (Mustela putorius). Cereb Cortex. 12, 1280-1297 (2002).
- Wong, P., Kaas, J. H. Architectonic subdivisions of neocortex in the gray squirrel (Sciurus carolinensis.). The anatomical record. 291, 1301-1333 (2008).
- Land, P. W., Shamalla-Hannah, L. Experience-dependent plasticity of zinc-containing cortical circuits during a critical period of postnatal development. J Comp Neurol. 447 (1), 43-56 (2002).
- Czupryn, A., Skangiel-Kramska, J. Distribution of synaptic zinc in the developing mouse somatosensory barrel cortex. J Comp Neurol. 386, 652-660 (1997).
- Timm, F. Zur Histochemie der Schwermetalle. Das Sulfid-Silber-Verfahren. Dtsch Z ges gerichtl Med. 46, 706-711 (1958).
