Summary
وتوضح هذه الدراسة فائدة وسهولة قياس تمديد الكمية غشاء الخلية وارتباطها بقدرة التصاق الخلايا. وكمثال ممثل، نعرض هنا أن البروتين المتصلة ديككوبف 3 (DKK3) ويشجع تشكيل لوبوبوديا زيادة وخلية أدهيسيفينيس في سرطان البطاني الخلايا في المختبر.
Abstract
مرجع ملحق غشاء الخلية ينظم مختلف السلوكيات الخبيثة خلايا السرطان، بما في ذلك قدراتها لاصقة والمهاجرة. القدرة على دقة تصنيف وتحديد ملحقات الخلية وقياس الأثر على قدرة لاصقة في خلية أمر حاسم لتحديد كيف الخلية مما يشير إلى أحداث تأثير سرطان الخلية السلوك والعدوانية. وهنا يصف لنا في المختبر تصميم واستخدام الخلية الكمي أسلوب التوسيع بالاقتران مع مقايسة قدرة التصاق في نموذج المنشأة في المختبر لسرطان البطاني (لجنة التنسيق الإدارية). على وجه التحديد، نقوم باختبار آثار DKK3، القامع ورم المفترضة، وعامل المؤيدة تمايز، على النمط الظاهري تمديد غشاء خط الخلية لجنة التنسيق الإدارية، SW 13. أننا نقترح هذه الاختبارات تقديم بسيط نسبيا، ويمكن الاعتماد عليها، والمقاييس بسهولة التفسير لتدابير هذه الخصائص في ظروف تجريبية مختلفة.
Introduction
WNT Dysregulated مما يشير إلى دور حاسم في الأورام الخبيثة البطاني1. الأساليب المستخدمة في هذه الدراسة التحقيق ما إذا كان تكميم أفواه DKK3، منظم سلبية من إشارات WNT، يمثل حدثاً dedifferentiation في قشرة الغدة الكظرية ويعزز تشكيل الورم في السياق التغييرات مرجع الخلية-ملحق. DKK3 هو كاتشين 38 يفرز بروتين سكري مع ببتيد إشارة الطرفي ن وقد أظهرت الدراسات السابقة أن التعبير القسري أدت إلى توقيف دورة الخلية وتثبيط السلوك العدواني الخبيث وعكس الظهارية الوسيطة 2من المرحلة الانتقالية.
السلوك الخبيث لسرطان البطاني (لجنة التنسيق الإدارية)، وغيرها من أنواع السرطان، في جزء منه، وتتأثر قدرة الخلايا السرطانية على الواجهة مع الأسطح المحيطة بها، بما في ذلك المصفوفة خارج الخلية، الذي بدوره يسهل غزو الخلايا السرطانية و 3من الهجرة. يتم شرحها دور ملحقات غشاء الخلية المحددة في تطور السرطان يتزايد في سياقات مختلفة، في المقام الأول عن طريق تشكيل فيلوبوديا. على سبيل المثال، قد وجد overexpression قنوات الكالسيوم من نوع L للحث على تشكيل فيلوبوديا والنهوض بورم الخلايا غزو4. وبالمثل، فاسسين، أكتين ملزمة البروتين الحد الأدنى المعرب عنها في أنسجة طبيعية، أيضا overexpressed في الخلايا السرطانية بالاشتراك مع تشكيل فيلوبوديا5. تشكيل لوبوبوديا تمكن الليفية غير الخبيثة لترحيل نحو فعال من خلال مصفوفة خارج الخلوية، ومع ذلك، فقد ثبت أن الخلايا فيبروساركوما تعتمد على نشاط أية بدلاً من لوبوبوديا لتسهيل الهجرة الخلية و 6من الغزو. وقد أظهرنا ذلك الورم المكثفات، بما في ذلك رأس رابطة مجال الأسرة 1 إيسوفورم (RASSF1A) و DKK3، يمكن أن تعمل لتغيير عناصر سيتوسكيليتال وتشجيع تشكيل لاميليبوديا وحركت خصائص الغازية7،8.
على هذا النحو، من المهم لتوصيف تأثيرات الجينات المشتركة في التسرطن وعلاقتها بغشاء الخلية ملحق التعديلات، على وجه التحديد تقييم تشكيل فيلوبوديا، ولوبوبوديا، ولاميليبوديا تحت ظروف الاختبار. دولة من بين أحدث التقنيات الحالية تشمل استخدام أساليب متطورة على نحو متزايد الفحص المجهري، ووسم الفلورسنت، و/أو خوارزميات الحاسوب المعقدة للحصول على البيانات وتفسيرها. بينما هذه الأساليب توفير أدوات تحليلية جديدة وقوية، تعقيدها يحد من استخدامها على نطاق واسع وقدرة على التكيف في تجارب البيولوجيا الخلية. وعلاوة على ذلك، القياس الكمي الدقيق ومراقبة التغيرات في الخلية ملحق مورفولوجيا لا يقاس عادة9،10. وفي المقابل، نقدم تقنية هنا أن يوضحها بدقة الخلية ملحق التعديلات باستخدام التقنيات المجهرية القياسية وأساليب التكيف مع سهولة في المختبر . هذه الأساليب أيضا تحديد كمية كل نوع خلية التمديد في وقت واحد لكل خلية تحليل وتحديد التغييرات الشاملة في مرجع ملحق غشاء الخلية. ونحن أيضا إظهار كيف يمكن أن تتصل هذه التغييرات على خصائص التصاق الخلية.
على سبيل مثال تجريبية، سوف نستخدم خط خلية التي تم إنشاؤها مسبقاً من 13 SW، عينت SW-DDK3، الذي قد تم transfected ثابت مع بلازميد DKK3/pCMV6-دخول ناقلات ومؤثراً أوفيريكسبريسيس DKK3، عامل التفريق في الغدة الكظرية. SW 13 عدم transfected الخلايا والخلايا SW 13 ستابلي transfected مع متجه فارغة (pCMV6-الإدخال)، عينت SW-الأجسام القريبة من الأرض، كضوابط تجريبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-ملحق خصائص الخلية
- الحفاظ على SW 13 وسويسري-الأجسام القريبة من الأرض، والخلايا DKK3 سويسري في قياسية هوميديفيد حاضنة في 37.0 درجة مئوية و 5% CO2 في "تعديل النسر المتوسطة" دولبيكو تستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين و 10,000 يو/مليلتر البنسلين وستربتوميسين (سميت 'نمو متوسطة').
- عد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير، ولوحة خلايا 5,000 كل بئر SW 13 وسويسري-الأجسام القريبة من الأرض، وخطوط SW-DKK3 إلى لوحات 6-بئر منفصلة وتنمو بين عشية وضحاها في متوسط النمو في كوفيرسليبس الزجاج العقيمة.
- بعد النمو بين عشية وضحاها، لكل بئر، نضح المتوسطة النمو، تغسل الخلايا مع 1 مل من المحلول الملحي الدافئ مخزنة الفوسفات (PBS)، ومن ثم إصلاحها الخلايا مع 1 مل فورمالدهايد 3.7% لمدة 10 دقائق.
- صبغ الخلايا aspirate فورمالدهايد ووصمة عار في كل بئر مع 1 مل بنفسجي كريستال 0.05% للحد الأدنى 30 فائض المياه والصرف الصحي بعيداً باستخدام ثلاثة يغسل ماء منزوع 1 مل.
ملاحظة: تبعاً لمستوى الإقبال على صبغ، يغسل إضافية عدة قد تحتاج لإزالة الخلفية تلطيخ لتعزيز التصور الخلية.- استخدام الملقط مقلوب غرامة، استرداد كوفيرسليبس ووضعها الوجه لأسفل على شريحة زجاج مسمى مع قطره كاشف تصاعد واضح.
- تحت مجهر خفيفة، اختيار عشوائي آراء 20 من الخلايا غير متداخلة من كل ساترة للمقايسة تمديد الخلية.
- أن photomicrographs على 400 x التكبير لكل حقل من عرض. مباشرة حساب عدد كل نوع من الإرشاد لكل من الخلايا الممثل 20.
ملاحظة: على هذا النحو، 20 زنزانة معزولة يجب النظر لكل حالة اختبار ضمان الحصول على نتائج يمكن الاعتماد عليها. وحددت فيلوبوديا من ملحقات الهاتف الخلوي مع قاعدة 5 ميكرون أو أقل، ولائحة واحدة. وحددت لوبوبوديا من ملحقات الهاتف الخلوي مع قاعدة من 5 إلى 20 ميكرون ملحقات التي تحتوي على طول مع أبيسيس متعددة. تم تعريف لاميليبوديا بملحقات الخلية التي تزيد عن 20 ميكرون في الطول ومع أو بدون أبيسيس. تبعاً لنوع الخلية اختبار، قد تختلف أحجام ملحقات الخلية وقد تتطلب الصقل لتحديد معلمات.
- أن photomicrographs على 400 x التكبير لكل حقل من عرض. مباشرة حساب عدد كل نوع من الإرشاد لكل من الخلايا الممثل 20.
- تحديد متوسط عدد كل ملحق خلية في كل نوع الخلية (أيSW 13، وسويسري-الأجسام القريبة من الأرض، وسويسري-DDK) عبر الآبار 6 درس.
- باستخدام اختبار تحليل تباين أحادي اتجاه (ANOVA) إحصائية، مقارنة الاختلافات في متوسط النسبة المئوية لملحقات غشاء الخلية من بين أنواع الخلية اختبار مختلفة.
2-الالتصاق بالانزيم
- الحفاظ على SW 13 وسويسري-الأجسام القريبة من الأرض، والخلايا DKK3 سويسري في حاضنة هوميديفيد قياسية في 37.0 درجة مئوية و 5% CO2 في المتوسطة النمو.
- استخدام هيموسيتوميتير، عد ولوحة خلايا 100,000 SW 13 وسويسري-الأجسام القريبة من الأرض، وسويسري-DKK3 الواحدة وكذلك في لوحات 6-بئر منفصلة وتنمو بين عشية وضحاها في المتوسطة النمو.
- اختبار البذور جيدا 6 لوحات لكل نوع من الخلايا، باستخدام لوحة واحدة لكل نقطة من النقاط الزمنية المعينة 6 اختبار أدناه.
ملاحظة: قد تختلف النقاط الزمنية لأنواع مختلفة من الخلايا.
- بعد الاحتضان بين عشية وضحاها، غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني دافئ مرة واحدة ثم إضافة 0.5 مل 1 × الخلية غير الانزيمية الانفصال الحل لكل بئر.
- دوامة لوحة لنشر الحل الانفصال من الخلية. نضح لوحة المعينة عند نقطة زمنية محددة (أي 1، 2، 3، 5، 10 و 15 دقيقة) ويغسل مع 1 مل الحل برنامج تلفزيوني دافئ ثلاث مرات.
- بين يغسل، اضغط برفق لوحات لفصل الخلايا المرفقة فضفاضة.
- نضح أي برنامج تلفزيوني وإصلاح الخلايا المتبقية تعلق على اللوحة مع 1 مل فورمالدهايد 3.7% لمدة 10 دقائق المتبقية.
- وصمة عار الخلايا مع 1 مل بنفسجي كريستال 0.05% لمدة 30 دقيقة ثم تغسل الصبغة الزائدة بعيداً مع 1 مل مياه. تيتراتي المياه والصرف الصحي لتعزيز التصور الخلية.
ملاحظة: تبعاً لمستوى الإقبال على صبغ، قد تكون مطلوبة يغسل إضافية عديدة لتعزيز التصور الخلية. - استخدام مجهر ضوء في 100 x التكبير، عد الخلايا المرفقة المتبقية في كل بئر لكل لوحة.
ملاحظة: استخدام المساطر الشفافة أو وسم القلم خير دليل على الجانب السفلي من اللوحة سيساعد على تجنب تكرار العد من نفس الخلايا. - تحديد متوسط عدد الخلايا المرفقة كل بئر لكل لوحة.
- مقارنة بمعدل مفرزة الخلية بين SW 13 وسويسري-الأجسام القريبة من الأرض، وخلايا SW-DDK3 على مدى فترة زمنية معينة باستخدام اختبار ANOVA إحصائية ذات اتجاهين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
استخدام الاختبارات المذكورة أعلاه، تم اختبار آثار أوفيريكسبريسيون DKK3 على خلية ملحق مورفولوجيا وخصائص التصاق الخلية في خط الخلية لجنة التنسيق الإدارية المنشأة SW-13، في المختبر. الخلايا overexpressing DKK3 تم إنشاؤها بواسطة ستابلي ترانسفيكتينج الخلايا SW 13 مع حركة DDK المعلمة DKK3/pCMV6-إدخال بلازميد متجهات وعينت SW-DKK3. وبالمثل، خلايا ستابلي transfected مع متجه فارغة pCMV6-دخول تم إنشاؤها كعنصر تحكم تعداء وباساجينج ويعرف بأنه سويسري-الأجسام القريبة من الأرض. واستخدمت خلايا SW 13 كعنصر تحكم أصل-خلية إضافية. وأكد الكمي PCR الوقت الحقيقي overexpression DKK3 في DKK3 جنوب غرب وغرب لطخة تقنيات8.
بإيجاز، اختبار خلايا SW 13 وسويسري-الأجسام القريبة من الأرض وسويسري-DKK3 قد نمت بين عشية وضحاها في 6 لوحات جيدا في كشوف الغطاء. ثم الخلايا الثابتة مع فورمالدهايد وملطخة بالكريستال البنفسجي. ثم تم قياس كمية خصائص ملحق الخلية تحت المجهر كل المعلمات المذكورة أعلاه. في التحليل، وعرض الخلايا SW-DKK3 النمط الظاهري أكثر تمايزاً لاحظت زيادة لوبوبوديا وقطبية الخلية متعددة الاتجاهات (ف = 0.01، أحادي الاتجاه ANOVA، الشكل 1 و الشكل 2)، وتوحي بنقص في حركية اتجاهي. على النقيض من ذلك، الحفاظ على قطبية الخلايا الأبوية SW 13 وسويسري-الأجسام القريبة من الأرض وعرض أكبر فيلوبوديا مرتبة في اتجاه مستو (p = 0.01، أحادي الاتجاه ANOVA، الشكل 1 و الشكل 2)8.
لتحديد ما إذا كان تغيير تشكيل لوبوبوديا زيادة خصائص مرفق الخليوي، أجرينا مقايسة التصاق خلية. باختصار، كانت تزرع الخلايا بين عشية وضحاها وأنجز مفرزة الخلية مع خلية غير الانزيمية الانفصال حل الوقت التدريجي فترات تصل إلى 15 دقيقة الخلايا ثم الثابتة مع فورمالدهايد، ملطخة بالكريستال البنفسجي، وتحسب باستخدام الضوء المجهر. الخلايا SW DKK3 أظهرت تقارب مرفق أكبر بكثير مقارنة مع الخلايا SW 13 وسويسري-الأجسام القريبة من الأرض (ف < 0.01، 2-طريقة ANOVA، الشكل 3). تشير هذه النتائج إلى أن DKK3 يعزز تشكيل لوبوبوديا، الذي يعزز بدوره الخلية المرفق8.
رقم 1: التعبير القسري من DKK3 يغير ملحقات غشاء الخلية. SW-13 (أ)وسويسري-الأجسام القريبة من الأرض (ب)سويسري-DKK3 (ج) خلايا كانت تزرع في كوفيرسليبس الزجاج والثابتة مع فورمالدهايد، ملطخة بالكريستال البنفسجي وتصويرها. وتؤخذ photomicrographs استخدام مجهر ضوء على 400 x التكبير. وشكلت خلايا SW 13 وسويسري-الأجسام القريبة من الأرض معظمهم فيلوبوديا (رؤوس الأسهم الحمراء) وملحقات الخلية لاميليبوديا (القوس الأزرق). على النقيض من ذلك، شكلت خلايا SW-DKK3 لوبوبوديا أكثر (الأقواس الخضراء الصغيرة)، مع غياب القريب من لاميليبوديا، وعدد قليل جداً من فيلوبوديا. بينما الخلايا (ب) SW 13 (A) وسويسري-الأجسام القريبة من الأرض، على ما يبدو، الاستقطاب (الأسهم البرتقالي) مع فيلوبوديا في طليعة ولاميليبوديا على حافة متخلفة، SW-DKK3 الخلايا (ج) أظهرت لوبوبوديا متعدد الاتجاهات موزعة بالتساوي. وأجريت تجارب في مكررة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: DKK3 يعزز تشكيل لوبوبوديا. تمثيل نسبي فيلوبوديا، ولوبوبوديا، ولاميليبوديا كل خلية لكل خلية نوع حسبت بجدولة ملحقات الخلية في الخلايا الفردية. الخلايا في photomicrographs العشرين اتخذت عشوائياً حقل مجهرية وجهات النظر (400 x التكبير) SW 13 وسويسري-الأجسام القريبة من الأرض، وسويسري DKK استخدمت للقياس الكمي. أشرطة الخطأ أشارت إلى الانحراف المعياري و (*) تشير إلى ف < استخدام ANOVA اتجاه واحد مما يمثل زيادة كبيرة في عدد من لوبوبوديا في خلايا سويسري DKK 0.01. تم فحص ما مجموعة 20 زنزانة لكل نوع خلية تم اختبارها وأجريت تجارب في مكررة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: DKK يعزز التصاق الخلية. مائة ألف SW 13 وسويسري-الأجسام القريبة من الأرض، وخلايا SW-DKK3 كل من لوحات 6-جيدا جيدا وسمح لتنمو بين عشية وضحاها وعولج لمفرزة في نقاط زمنية معينة (س). الخلايا المتبقية المرفقة كانت ثابتة والملون، وتحسب والنسب المئوية للخلايا المتبقية المرفقة المرسومة (المحور الصادي). أشرطة الخطأ تشير إلى الانحراف المعياري و (*) تشير إلى ف < 0.01 و (*) تشير إلى ف < 0.001 استخدام ANOVA 2-طريقة مما يمثل زيادة كبيرة في سويسري DKK الخلية قوة مرفق. كل تجربة بدأت مع خلايا 100,000 وأجريت تجارب في مكررة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا يصف لنا في المختبر كمي أسلوب لوصف ملحقات الخلية بسهولة، وشلالات حفرة قليلة، وإمكانية تكرار نتائج موثوقة يمكن تطبيقها لمختلف ظروف الاختبار. وعلاوة على ذلك، يمكن إجراء فحوصات الالتصاق و/أو حركية بسيطة وقابلة للقياس في نفس الوقت للربط بين الأهمية الوظيفية المحتملة للتغيرات الملاحظة في ملحقات غشاء الخلية.
ومع ذلك، هذه الأساليب قد يقدم بعض القيود المحتملة. أولاً، المعايير المحددة هنا التعرف على أنواع مختلفة من ملحقات خلية تستند إلى مورفولوجيا الخلايا SW 13 البطاني وبالتالي يرجح أن تحتاج إلى صقل في تصنيف المعلمات عند تطبيقها على أنواع الخلايا الأخرى و/أو الظروف التجريبية. علاوة على ذلك، في تمديد الوقت بالطبع تجارب، التأثيرات المحتملة لغشاء الخلية ملحق التعديلات على دورة الخلية وموت الخلايا يلزم النظر فيها.
ثانيا، قد تعتمد البروتوكول على الدعوة الفردية المحتملة قبل الممتحن، الذي يمكن أن يحد من إمكانية تكرار نتائج التحليل سبب الاختلاف بين المراقبين. العدد الكبير من الخلايا التي يتم دراستها لكل مجموعة اختبار المحتمل ويتغلب على جزء من هذا التحيز؛ على وجه التحديد، عندما يتم فحص خلايا 20 لكل فحص. يقترح إدراج عدة أفراد لتنفيذ ملحق الدعوة بشكل أعمى التقليل من التحيز استدعاء ذاتي محتمل.
وأخيراً، ينبغي توخي الحذر عند اقتران التغييرات في الخلية ملحق فئة التبديل مع التغييرات في خصائص مرفق، حيث يمكن أن تكون صيغة مبسطة لخصائص الالتصاق النتيجة تغيير تفضيل التحتية مرفق بدلاً من تقارب غيرت للتحتية اختبارها. اقتران تبديل فئة ملحق الخلية مع الهجرة أو الغزو في السياق مختلف مكونات المصفوفة خارج الخلوية يمكن توضيح خصائص التصاق ملاحظتها.
وفي الختام، ينص البروتوكول على المبينة هنا طريقة بسيطة وموثوق بها لقياس أهمية وظيفية للتبديل ملحق غشاء الخلية تحت ظروف الاختبار المختلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
وتمول "المؤسسة منحة أوهسي" هذا العمل.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher | 11965-092 | Supplemented with fetal bovine serum and penicllin and streptomycin |
| Deulbeco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | 1X solution, used directly |
| 3.7% formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Dilute stock solution |
| 0.05% crystal violet | Harleco | 192-12 | Dilute stock solution |
| De-ionized water | NA | NA | NA |
| Microscope with 400X magnification | NA | NA | NA |
| 6-well plates | Corning | 353046 | NA |
| Cell dissociation solution non-enzymatic 1X | Sigma-Aldrich | C5914 | 1X solution, used directly |
References
- Libe, R., Fratticci, A., Bertherat, J. Adrenocortical cancer: pathophysiology and clinical management. Endocrine-related cancer. 14 (1), 13-28 (2007).
- Veeck, J., Dahl, E. Targeting the Wnt pathway in cancer: the emerging role of Dickkopf-3. Biochimica et biophysica acta. 1825 (1), 18-28 (2012).
- Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (7), 445-457 (2009).
- Jacquemet, G., et al. L-type calcium channels regulate filopodia stability and cancer cell invasion downstream of integrin signalling. Nat Commun. 7, 13297 (2016).
- Machesky, L. M., Li, A. Fascin: Invasive filopodia promoting metastasis. Commun Integr Biol. 3 (3), 263-270 (2010).
- Petrie, R. J., Harlin, H. M., Korsak, L. I., Yamada, K. M. Activating the nuclear piston mechanism of 3D migration in tumor cells. J Cell Biol. 216 (1), 93-100 (2017).
- Korah, R., et al. Epigenetic silencing of RASSF1A deregulates cytoskeleton and promotes malignant behavior of adrenocortical carcinoma. Molecular cancer. 12, 87 (2013).
- Cheng, J. Y., et al. A novel FOXO1-mediated dedifferentiation blocking role for DKK3 in adrenocortical carcinogenesis. BMC cancer. 17 (1), 164 (2017).
- Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities. J Cell Biol. 209 (1), 163-180 (2015).
- Cliffe, A., et al. Quantitative 3D analysis of complex single border cell behaviors in coordinated collective cell migration. Nat Commun. 8, 14905 (2017).
