Summary
Dit protocol beschrijft een omgekeerde verticale invasie-bepaling die kan worden gebruikt om het kwantificeren van de mogelijkheden voor migratie en invasie van cellen in een driedimensionale omgeving met behoud van de cel-communicatie. Deze test is geschikt voor zeldzame en/of gevoelige cellen.
Abstract
Hoewel 3D invasie testen hebben ontwikkeld, blijft de uitdaging om te bestuderen van cellen zonder de integriteit van hun communicatie. Traditionele 3D testen zoals de kamer van Boyden vereisen dat cellen worden verplaatst van de oorspronkelijke locatie van de cultuur en verplaatst naar een nieuwe omgeving. Niet alleen is dit de cellulaire processen die inherent is aan de communicatie verstoren, maar het leidt vaak tot een verlies van cellen. Deze problemen zijn vooral een uitdaging bij de behandeling van cellen die zeldzaam, of uiterst gevoelig zijn voor hun communicatie zijn. Hier beschrijven we de ontwikkeling van een 3D invasie assay die beide zorgen vermijdt. In deze test, cellen zijn vergulde binnen een klein goed en een ECM-matrix met een chemoattractant bovenop de cellen wordt gelegd. Dit vereist geen verplaatsing van de cel, en laat de cellen binnen te vallen naar boven in de matrix. In deze test, kan cel invasie, alsmede de morfologie van de cel worden beoordeeld binnen de collageen-gel. Met behulp van deze test, karakteriseren wij de invasieve capaciteit van zeldzame en gevoelige cellen; de hybride cellen als gevolg van de fusie tussen borstkankercellen MCF7 en mesenchymale/Multipotente cellen stamcellen/stroma (MSCs).
Introduction
De beweeglijkheid van de cel is een normale ontwikkelings- en fysiologische proces van cellen. Veranderingen in het patroon en het vermogen van de cellen om te migreren en binnenvallen zijn echter geassocieerd met pathologische voorwaarden, met inbegrip van inflammatoire ziekten en kanker uitzaaiingen1,2,3. Metastase is aantoonbaar de meest slecht begrepen aspect van kanker. Om het metastaseren, moet kankercellen degraderen van de extra-cellulaire matrix (ECM), binnenvallen het lokale weefsel- en intravasate. Zodra in omloop, de kankercellen naar de verre site verspreiden zullen, extravasate en secundaire tumoren vormen. Dus de mogelijkheid van cellen te degraderen de ECM, te migreren en te vallen is gerelateerd aan hun gemetastaseerde potentieel. Verschillende benaderingen zijn ontwikkeld om te analyseren en te kwantificeren van de mogelijkheden voor migratie en invasie van cellen. De meest gebruikte benaderingen omvatten de wond genezing assay, time-lapse microscopie, en de bepaling van Boyden kamer. De wond genezing assay4 en tijd vervallen microscopie zijn eenvoudige en gemakkelijke testen die zou voorontwerp inzicht geven in cel migratie. Beide zijn echter 2D testen die komen niet overeen met de 3D-omgeving waarin cellen in vivo zijn. Studies hebben aangetoond dat de cellen anders op een 3D-omgeving in vergelijking met een 2D één5,6 reageren. Bovendien zijn wond helende testen moeilijk te reproduceren en te8,9van de7,van de kwantitatieve resultaten opleveren. De cel uitsluiting Zone-bepaling, die een 3D-wijziging van de wond genezing assay is, is een meer fysiologisch relevante test maar het is niet geschikt voor cellen lage aantal zoals hybride cellen ten gevolge van cell fusion evenementen10,11 .
De bepaling van de kamer Boyden is een 3-dimensionale test waarmee de relevante microenvironments voor cellulaire studies. Nochtans, vereist het cellen uit hun oorspronkelijke communicatie moet worden verwijderd en de bovenste kamer van de Boyden assay systeem om te migreren en vallen naar beneden richting het chemoattractant met medium worden gestort. Deze 3D-aanpak is niet geschikt in het analyseren van het migratie en invasie vermogen van cellen kwetsbaar voor hun communicatie en/of beperkt in nummer10,11,12. Een nieuwere benadering cel migratie en invasie te analyseren is de microfluidic kleurovergang kamer assay13. Hoewel geschikte en betrouwbare migratie en invasie studies, deze test is duurder en technisch uitdagend kon worden voor een typische laboratorium. Hier beschrijven we een eenvoudig omgekeerde verticale invasie assay die compatibel is met veel celtypen, met inbegrip van cellen gevoelig voor hun communicatie en/of beperkt in aantal. Deze test werd aangepast van het protocol door Hooper et al. voorgestelde 14. in deze test, de cellen blijven in hun oorspronkelijke communicatie en hun migratie en invasie wordt gecontroleerd als zij zich verplaatsen naar boven in de collageen-gel met een chemoattractant11. Deze test is reproduceerbaar en is geoptimaliseerd en gevalideerd in de schotel 35-mm cultuur. Het kan worden aangepast aan verschillende assay omstandigheden waaronder verschillende cel cultuur maten, verschillende matrices of kracht van hechting, en verschillende chemoattractants. Deze test kan dienen als een in vitro -platform voor eerste screening in de drug discovery-proces.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: Dit protocol wordt beschreven in McArdle et al. 11. een tijdlijn wordt gegeven in Figuur 1.
1. bereiding van de cultuur-plaat
- De 35-mm cultuur schotel met een 10 mm glas-bodem goed met 1 mL 1 M zoutzuur (HCl) voor 15 min te verlagen van de hydrophobicity van de glas-bodem wassen.
- Wassen van de cultuur-plaat tweemaal met 1 mL fosfaat buffer zoutoplossing (PBS) om zich te ontdoen van alle de HCl.
- Wassen van de cultuur-plaat twee keer met 1 mL 70% ethanol.
- Spoel de cultuur plaat met 1 mL van de cel specifieke voedingsbodem (hier, gebruik α-MEM aangevuld met 10% warmte geïnactiveerd FBS en 1% niet-essentiële aminozuren).
Opmerking: De plaat van de behandelde cultuur met het kweekmedium kan worden opgeslagen in de CO2 incubator met een luchtbevochtiger bij 37 ° C tot de volgende dag. - De cellen (MSCs en MCF-7 samen cultuur) in de behandelde glazen-bodem goed van de 35-mm cultuur schotel aan 100% confluentie groeien. Samen cultuur 35.000 MSC cellen en 75.000 van MCF7 cellen gedurende 24 uur.
2. voorbereiding van de collageen-gel
- De tips van de micropipet gebruikt voor de collageen-gel in de vriezer pipetteren om te voorkomen dat de polymerisatie van het collageen bij contact opslaan.
Opmerking: Dit is de meest kritische stap. - Bepalen van een volume van rat staart collageen ik moet worden gebruikt op basis van de concentratie van de collageen-voorraad. 100 µL van collageen gel voorbereiden op deze bepaling.
Opmerking: Hoge concentratie van rat staart collageen die ik voorraad werkt beter. Bepaal het volume van 10 x de Dulbecco bewerkt Eagle's Medium moet worden gebruikt voor het verdunnen van de collageen dienovereenkomstig. - Combineren op ijs rat staart collageen I (3.8 µg/mL stockoplossing), 10 x Dulbecco bewerkt Eagle's Medium en 1 x cel kweekmedium aangevuld met 2% foetale runderserum en de juiste chemoattractant om een eindconcentratie van collageen van 2,4 mg/mL.
- Voeg toe aan het mengsel 4,5% natriumbicarbonaat oplossing voor het neutraliseren van de collageen-gel.
Opmerking: Het volume van natriumbicarbonaat oplossing toegevoegd kan variëren afhankelijk van de exacte pH van de andere reagentia. Het is het beste om te testen het mengsel met pH strips zorgen voor neutraal oplossing, of gebruik maken van een pH-indicator in het kweekmedium. - 80 µL van het mengsel van collageen lag over de cellen binnen de glazen-bodem goed van de cultuur-schotel.
- Laat de gel collageen te polymeriseren gedurende 30 min. in een incubator CO2 met een luchtbevochtiger bij 37 ° C.
- Bedek de collageen gel met 2 mL cel medium met verminderde serum (2%) en Incubeer de cellen bij 37 ° C in een incubator van de CO-2 met een luchtbevochtiger voor 24, 48 of 72 uur.
Let op: De plaat moet worden behandeld met zorg om te voorkomen dat de collageen-gel loskoppelen van de glazen bodem.
3. voorbeeld van voorbereiding van collageen gel met behulp van een rat staart collageen voorraad van 3.8 µg /mL
- Op het ijs, combineren 114.5 µL van rat staart collageen, 16.6 µL van 10 x DMEM en 33.1 µL cultuurmedium met de chemoattractant.
- Het mengsel van de collageen met 14.0 µL van natriumbicarbonaat te neutraliseren.
- Zoals in stap 2.5 blijven.
4. beeldvorming van de cellen
- Verwijder voorzichtig het medium van de schotel.
- Spoel zachtjes de gel met 1 mL PBS.
- Herstellen van de cellen met 1 mL van 4% paraformaldehyde gedurende 15 minuten.
- Wassen van de cellen tweemaal met 1 mL PBS.
- Vlek van de cellen met de DAPI oplossing (100 ng/mL) gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
- Het imago van de cellen met behulp van een confocal microscoop op verschillende locaties en 400 µm z-stapel afbeeldingen van elke locatie in 16 µm stappen te nemen. De Microscoop gebruikt heeft een schijf scannen eenheid waarmee confocal geschikt zijn met behulp van een wit licht, arc excitatie bron. Gebruik een 20 X lens gebruikt met numerieke maaswijdte van 0,75.
- Reconstrueren beelden.
- Open beelden voor een bepaalde gel (ongeveer 25 foto's) en een afbeeldingsstapel maken door te klikken op beeld → stapels → beelden te stapelen. De eerste afbeelding overeenkwam met de onderkant van de gel (z = 0 µm), het tweede beeld kwam overeen met de eerste stap in de richting van de z (z = 16 µm), de derde afbeelding overeenkwam met de tweede stap in de richting van de z (z = 32 µm). Elke kern op elke afbeelding diepte te beoordelen en de diepte waarop de kern werd in scherpste beeld als de diepte van de invasie van dat bepaalde cel aanwijzen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We hebben gebruik gemaakt van een 35-mm cultuur schotel met een glazen bodem en rat staart collageen I bij het ontwikkelen en optimaliseren van een 3D-invasie in vitro assay protocol. Met behulp van deze test, we toonden dat borst kankercellen MCF7 en MSC cellen kunnen binnenvallen in de collageen-gel op een gemiddelde afstand van 0,04 ± 1.8 µm en 41.3 ± 76.0 µm respectievelijk na 48u wanneer IGF1 (18,6 ng/mL) werd gebruikt als chemoattractant (Figuur 2). Nog belangrijker, toonden we dat fusion producten van MSC en MCF7 cellen, die zeldzame cellen, in de collageen-gel zo goed konden binnenvallen. Hun gemiddelde afstand van de invasie in 48 h was 10.7 ± 12.4 µm toen IGF ik bij 18,6 ng/mL werd gebruikt als chemoattractant (Figuur 2). Het verschil in de invasie vermogen tussen MCF7 en MSCs was statistisch significant (P < 0.01)11. Het verschil tussen het vermogen van de invasie van de fusion producten en één van de MCF7 of MCSs was niet statistisch significant. Deze test toonde echter consequent dat de kanker cel fusion producten had een grotere migratiestromen en invasieve vermogen dan de ouderlijke kankercellen, MCF7.
Cellen bleef gezond tijdens de experimenten zoals blijkt uit hun morfologie en hoeveelheid 48u post gel polymerisatie (Figuur 3een). Met de omgekeerde verticale invasie assay design, de kinetiek van cel migratie en invasie kan worden geanalyseerd (Figuur 3b, 4) en morfologie van de cel kan worden beoordeeld (Figuur 4).
Figuur 1 : Tijdlijn van het omgekeerde verticale invasie assay ontwerp Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Invasie vermogen van kanker cel fusion producten. De capaciteit van de invasie van kanker cel fusion producten kon worden bepaald met behulp van de omgekeerde verticale invasie assay. De getallen geven de gemiddelde invasie capaciteit van vier onafhankelijke fusie producten uit drie afzonderlijke CO culturen en hun ouderlijke cellijnen geanalyseerd uit acht verschillende gebieden binnen elke bepaling. Dit experiment werd uitgevoerd in drievoud. ANOVA met Tukey de HSD post hoc test. ** P < 0,01. Foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviatie (SD). Dit percentage is aangepast van 11zijn. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Cel levensvatbaarheid en Z-serie van de omgekeerde verticale invasie assay.
a) 20 X helder veld afbeeldingen tonen de morfologie van cellen onder de collageen-gel na twee dagen. Van links naar rechts MCF7 en MSC co cultuur, MCF7 en MSC; b) weergave van de z-serie tonen twee locaties (i en ii) binnen een gerecht uit de bodem naar de top. Opeenvolgende beelden zijn 16 µm uit elkaar. 3,8% FBS werd gebruikt als een chemoattractant. Groene cirkels op beide panelen geven aan binnenvallende cellen; Note, onscherp aan de onderkant van de gel en focus in de bovenste gel, invasie in de gel. Rode cirkels op beide panelen geven aan cellen blijven op de onderste laag van de z-serie (niet-invading cellen). Schaal bar (a): 15 µm; Schaal bar (b): 10 µm. Dit percentage is aangepast van 11zijn. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Cel morfologie in de omgekeerde verticale invasie assay. Morfologie van MSCs in de collageen-gel op één locatie vanaf de onderkant (Z = 0 µm) tot de Z = 20 µm. 3,8% FBS werd gebruikt als een chemoattractant. De lange pijl geeft het aanhangsel van een invasie van de MSC in de gel. De pijlpunt geeft een MSC, die uitgelijnd langs de onderkant van de gel, en niet binnenvallende is. De blauwe geeft de nucleaire DAPI vlek terwijl de rode de phalloidin gekleurd actine-filamenten toont. Dit percentage is aangepast van 11zijn. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier beschrijven we een eenvoudig omgekeerde verticale invasie assay die handig is voor een aantal celtypes, met inbegrip van cellen die zeldzaam en/of afhankelijk van hun communicatie zijn. In dit 3D invasie assay, cellen blijven in hun oorspronkelijke communicatie en worden gedekt door de collageen-gel met een chemoattractant. De cellen vervolgens migreren en binnen te dringen in het collageen. In deze test, kunnen de cellen worden gekleurd en gemakkelijk gecontroleerd binnen de gel. De eenvoud en de reproduceerbaarheid van deze test maakt het een handig hulpmiddel voor de studie van kanker cel migratie en invasie in een 3D systeem. Sterke chemoattractants lijken echter te verplichten te breken de affiniteit van de cel naar de onderkant van de schotel cultuur.
We de bepaling van de omgekeerde verticale invasie in de 35-mm cultuur schotel geoptimaliseerd. Deze cultuur schotel heeft een 10 mm glas-bodem goed die goed is uitgerust voor imaging. Een beperking van de schotel van deze cultuur is de aanzienlijke hoeveelheid collageen gel vereist voor het uitvoeren van een test. Zoeken naar kleinere cultuur gerechten met een compatibel met imaging ontwerp zou zuiniger zijn. De gel laag geschikt zijn voor het ontwerp van de 35-mm schotel is zeer delicaat als gevolg van zijn kracht en kan gemakkelijk losmaken van de onderkant van de plaat als niet zorgvuldig behandeld. Een andere cel cultuur ontwerp kan het verbeteren van de stabiliteit van de collageen gel laag, maar de compatibiliteit tussen de collageen gel sterkte en cel levensvatbaarheid moet worden geoptimaliseerd.
Ondanks deze beperkingen presenteert de omgekeerde verticale invasie assay vele voordelen ten opzichte van andere 3D invasie assay formaten. Het belangrijkste voordeel is dat de cellen blijven in hun oorspronkelijke omgeving van de cultuur, wat niet het geval in de bepaling van Boyden kamer. Dit protocol behoudt de cel communicatie dat is gunstig voor cellen strikt gecontroleerd door hun communicatie zoals stamcellen15. Deze bepaling verhindert ook celbeschadiging of cel verlies vooral voor cellen die delicaat of zeldzame10,11 zijn. Daarnaast, met deze test, kon de morfologie van de cel en de bijbehorende kinetiek worden beoordeeld binnen de gel, wat niet mogelijk is met de bepaling van Boyden kamer. Bovendien, de niet-fysiologische polycarbonaat of polypropyleen filter van het Boyden systeem voor de bepaling van de kamer wordt niet gebruikt in de bepaling van de omgekeerde verticale invasie. De omgekeerde verticale invasie assay is een ontwerp van de statische, het doet niet na te bootsen de in vivo dynamische omgeving die de microfluidic invasie assay ontwerp biedt, maar het biedt een eenvoudiger, minder uitdagende en kosteneffectieve 3D omgeving te kwantificeren migratie en invasie van verschillende celtypes in een bewaard gebleven en gecontroleerde communicatie.
De bepaling van de omgekeerde verticale invasie heeft vele mogelijke toepassingen in pathofysiologische studies. Deze aanpak zou kunnen dienen als een platform in vitro te bestuderen van de beweeglijkheid van de cel tijdens de embryonale ontwikkeling, wond genezing en/of inflammatoire reacties3. Cel interactie met de ECM en andere celtypes tijdens de migratie en invasie kon ook worden onderzocht met behulp van dit protocol. Deze test kan ook een nuttig instrument voor de eerste drug screening van anti-metastatische drugs vertegenwoordigen. Een modelsysteem voor orgel-specifieke kanker uitzaaiingen kan worden ontwikkeld met behulp van de omgekeerde verticale invasie bepaling ook.
De omgekeerde verticale invasie assay werd ontwikkeld om het omzeilen van de uitdaging die de verplaatsing van enkele cellen uit hun oorspronkelijke communicatie in het Boyden systeem voor de bepaling van de kamer presenteert. Deze test is eenvoudig, betrouwbaar en reproduceerbaar zijn; het is flexibel en kan worden gebruikt voor het kwantificeren van de invasieve potentieel van een breed scala aan celtypen, met inbegrip van gevoelige en zeldzame celtypes. Deze bepaling kan worden toegepast voor het detecteren van de trekkende activiteit geassocieerd met de aantasting van de matrix en kan ook worden aangepast aan het bestuderen van de selectieve vernederende activiteit op verschillende matrix substraten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben verklaard dat er geen concurrerende belang bestaat.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de National Institutes of Health (NIMHD-G12MD007581) door het RCMI-centrum voor milieu en gezondheid aan Jackson State University en het Amerikaanse ministerie van defensie, idee Award 11-1-0205.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MatTek P35G-1.5-10C | MatTek Corporation, Ashland, MA | P35G-1.5-10-C | mattek glass bottom dishes |
| Rat tail collagen I | Corning, Corning, NY, USA | 354236 | Collagen gel |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA | H1758 | HCl |
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA | 10010023 | PBS |
| 10X Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA | D2429 | 10X DMEM |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA | S5761 | NaHCO3 |
| Confocal Fluorescent microscope | Olympus America, Center Valley, PA, USA | Olympus IX81 | Confocal microscope |
| Defined Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences HyClone Laboratories, Utah, USA | SH30070.03 | FBS |
| Ti:Sapphire multi-photon laser scanning microscope | Prarie Technologies, Sioux Falls, SD, USA | 40x NA 0.8 objective | MPLSM |
| Imaris software | Bitplane Inc. Zurich, CH | Imaris 7.5.2 | Imaris software |
| DAPI | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA | D9542 | DAPI |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA | 50980487 | PFA |
| α-minimum essential medium | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA | M0894 | |
| MDA-MB-231 | ATCC; Manassas, VA, USA | HBT-22 | |
| MSC | Trivedi and Hematti, 2007 | ||
| 20X lens UPLAPO | Olympus America, Center Valley, PA, USA | 36-064 | Olympus UPLSAPO 20X Objective |
References
- Friedl, P., Brocker, E. B. The biology of cell locomotion within three-dimensional extracellular matric. Cell Mol Life Sci. 57, 41-64 (2000).
- Bissell, M. J., Rizki, A., Mian, I. S. Tissue architecture: the ultimate regulator of breast epithelial function. Curr Opin Cell Biol. 15, 753-762 (2003).
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer. 3, 362-374 (2003).
- Yarrow, J. C., Perlman, Z. E., Westwood, N. J., Mitchison, T. J. A high-throughput cell migration assay using scratch wound healing, a comparison of image-based readout methods. BMC Biotechnol. 4, 21 (2004).
- Wolf, K., et al. Compensation mechanism in tumor cell migration: mesenchymal-amoeboid transition after blocking of pericellular proteolysis. J Cell Biol. 160, 267-277 (2003).
- Sahai, E., Marshall, C. J. Differing modes of tumour cell invasion have distinct requirements for Rho/ROCK signalling and extracellular proteolysis. Nat Cell Biol. 5, 711-719 (2003).
- Kam, Y., Guess, C., Estrada, L., Weidow, B., Quaranta, V. A novel circular invasion assay mimics in vivo invasive behavior of cancer cell lines and distinguishes single-cell motility in vitro. BMC Cancer. 8, 198 (2008).
- Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int J Exp Pathol. 90, 195-221 (2009).
- Poujade, M., et al. Collective migration of an epithelial monolayer in response to a model wound. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 15988-15993 (2007).
- Noubissi, F. K., Harkness, T., Alexander, C. M., Ogle, B. M. Apoptosis-induced cancer cell fusion: a mechanism of breast cancer metastasis. FASEB J. 29, 4036-4045 (2015).
- McArdle, T. J., Ogle, B. M., Noubissi, F. K. An In Vitro Inverted Vertical Invasion Assay to Avoid Manipulation of Rare or Sensitive Cell Types. J Cancer. 7, 2333-2340 (2016).
- Noubissi, F. K., Ogle, B. M. Cancer Cell Fusion: Mechanisms Slowly Unravel. Int J Mol Sci. 17, (2016).
- Meyvantsson, I., Beebe, D. J. Cell culture models in microfluidic systems. Annu Rev Anal Chem. 1, 423-449 (2008).
- Hooper, S., Marshall, J. F., Sahai, E. Tumor cell migration in three dimensions. Methods In Enzymol. 406, 625-643 (2006).
- Yang, C., Tibbitt, M. W., Basta, L., Anseth, K. S. Mechanical memory and dosing influence stem cell fate. Nat Materials. 13, 645-652 (2014).
