Summary
Questo protocollo descrive un'analisi di invasione verticale invertito che potrebbe essere utilizzata per quantificare le funzionalità di migrazione e invasione delle cellule in un ambiente tridimensionale, preservando il microambiente cellulare. Questo test è adatto per le cellule rare e/o sensibili.
Abstract
Sebbene siano state sviluppate le analisi 3D invasione, la sfida rimane per studiare le cellule senza intaccare l'integrità del loro microambiente. 3D tradizionali dosaggi come la camera di Boyden richiedono che le cellule vengono spostate dalla posizione originale cultura e spostate in un nuovo ambiente. Non solo fa questo interferire con i processi cellulari che sono intrinsechi al microambiente, ma spesso risulta in una perdita di cellule. Questi problemi sono particolarmente impegnativi, quando si tratta di cellule che sono rari, o estremamente sensibili alla loro microambiente. Qui, descriviamo lo sviluppo di un saggio di invasione 3D che evita entrambi preoccupazioni. In questo saggio, cellule sono placcate bene all'interno di una piccola e una matrice di ECM contenente un chemoattractant è disposto in cima le cellule. Ciò non richiede alcun spostamento di cella e permette alle cellule di invadere verso l'alto nella matrice. In questa analisi, l'invasione delle cellule, come pure la morfologia delle cellule può essere valutata all'interno del gel di collagene. Usando questa analisi, ci caratterizzano la capacità invasiva delle cellule rare e sensibile; le cellule di ibrido risultante dalla fusione tra cellule di cancro al seno MCF7 e mesenchimali/multipotenti staminali/stroma cellule (MSCs).
Introduction
Motilità cellulare è un processo fisiologico e dello sviluppo normale delle cellule. Tuttavia, i cambiamenti nel modello e la capacità delle cellule di migrare e invadere sono associati con patologie tra cui malattie infiammatorie e cancro metastasi1,2,3. Metastasi è senza dubbio l'aspetto più mal capito nel cancro. Per riprodurrsi per metastasi, le cellule tumorali devono degradare la matrice extracellulare (ECM), invadere il tessuto locale e intravasate. Una volta in circolazione, le cellule tumorali si diffonderanno al sito distante, MPEG e formare tumori secondari. Di conseguenza, la capacità delle cellule di degradare la ECM, migrare e invadere è relativo al loro potenziale metastatico. Diversi approcci sono stati sviluppati per analizzare e quantificare le funzionalità di migrazione e invasione delle cellule. Gli approcci più utilizzati comprendono la cicatrizzazione di dosaggio, time-lapse microscopia e analisi dell'alloggiamento di Boyden. La ferita guarigione dosaggio4 e tempo lapse microscopia sono analisi semplice e conveniente che vi darà luce preliminare nella migrazione cellulare. Tuttavia, entrambi sono le analisi 2D che non riflettono l'ambiente 3D in cui le cellule si trovano in vivo. Gli studi hanno indicato che le cellule rispondono in modo diverso in un ambiente 3D rispetto ad un 2D si5,6. Inoltre, saggi di guarigione della ferita sono difficili da riprodurre e a produrre risultati quantitativi7,8,9. Analisi della zona di esclusione di cella, che è una modifica 3D della ferita guarigione saggio, è un test più fisiologicamente rilevanti, ma non è adatto per le celle in basse in numero, ad esempio cellule ibride derivanti dalla cella fusione eventi10,11 .
L'analisi della camera di Boyden è un dosaggio di 3-dimensionale che fornisce microambienti rilevanti per gli studi cellulari. Tuttavia, esso richiede le cellule per essere rimosso dal loro microambiente originale e ad essere depositati nella camera superiore del sistema di dosaggio Boyden di migrare e invadere verso il basso verso il chemoattractant contenente il mezzo. Questo approccio 3D non è appropriato nell'analizzare la capacità di migrazione e l'invasione delle cellule vulnerabili a loro microambiente e/o limitata nel numero10,11,12. Un approccio più recente per analizzare l'invasione e la migrazione cellulare è la microfluidica gradiente camera dosaggio13. Anche se adatto e affidabile negli studi di migrazione e invasione, questo dosaggio è più costoso e potrebbe essere tecnicamente difficile per un tipico laboratorio. Descriviamo qui un saggio di semplice invasione verticale invertito che è compatibile con molti tipi di cellule tra cui cellule sensibili alla loro microambiente e/o ristretta nel numero. Questo test è stato adattato dal protocollo proposto da Hooper et al. 14. in questa analisi, le cellule rimangono nella loro microambiente originale e loro migrazione e invasione è monitorato mentre si muovono verso l'alto nel gel collagene contenente un chemoattractant11. Questo test è riproducibile ed è stato ottimizzato e convalidato nella piastra di coltura di 35 mm. Esso potrebbe essere adattato a diverse metodiche tra cui formati di cella diversa cultura, diverse matrici o forza di adesione e chemiotattici differenti. Questo test potrebbe fungere da piattaforma in vitro per lo screening iniziale nel processo di scoperta di farmaci.
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Protocol
Nota: Il presente protocollo è descritto in McArdle et al. 11. un diario è fornito nella Figura 1.
1. preparazione della piastra di coltura
- Lavare il piatto 35mm cultura che contiene un fondo di vetro 10 mm con 1 mL di 1 M di acido cloridrico (HCl) per 15 min abbassare l'idrofobicità del fondo di vetro.
- Lavare la piastra di coltura due volte con 1 mL di soluzione salina tampone fosfato (PBS) per sbarazzarsi di tutti l'HCl.
- Lavare la piastra di coltura due volte con 1 mL di etanolo al 70%.
- Sciacquare la piastra di coltura con 1 mL di terreno di coltura specifico delle cellule (qui, uso α-MEM completati con 10% calore inattivato FBS e 1% non essenziali aminoacidi).
Nota: La piastra di coltura trattata contenente il terreno di coltura possa essere memorizzata nell'incubatore CO2 con un umidificatore a 37 ° C fino al giorno successivo. - Crescere le cellule (MSCs e MCF-7 co-cultura) nel fondo di vetro trattato bene di piastra di coltura 35mm al confluency di 100%. Co-coltura 35.000 cellule MSC e 75.000 delle cellule MCF7 per 24 h.
2. preparazione del gel collagene
- Conservare le punte di una micropipetta utilizzate per pipettaggio il gel di collagene nel congelatore per prevenire la polimerizzazione del collagene al contatto.
Nota: Questo è il punto più critico. - Determinare un volume collagene coda di ratto io per essere utilizzato sulla base della concentrazione dello stock del collagene. Preparare 100 µ l di gel di collagene per questo test.
Nota: Alta concentrazione di collagene di coda di ratto che Stock funziona meglio. Determinare il volume di 10 x supporto per volta Eagle di Dulbecco da utilizzare per diluire il collagene conseguenza. - Combinare il collagene della coda del ratto ghiaccio I (3,8 µ g/mL di brodo), la media per volta Eagle di 10 x Dulbecco e 1 mezzo di coltura cellulare x completati con 2% di siero bovino fetale e il chemoattractant appropriato a una concentrazione finale di collagene di 2,4 mg/mL.
- Aggiungere il miscela 4,5% di soluzione di bicarbonato di sodio per neutralizzare il gel di collagene.
Nota: Il volume di soluzione di bicarbonato di sodio aggiunto varia in base al pH esatto di altri reagenti. Si consiglia di testare la miscela con strisce di pH per assicurare la soluzione neutra, o utilizzare un indicatore di pH nel terreno di coltura. - Laici 80 µ l di miscela di collagene sopra le cellule all'interno il fondo di vetro ben della piastra di coltura.
- Lasciare che il gel di collagene polimerizzare per 30 min in un incubatore a CO2 con un umidificatore a 37 ° C.
- Coprire il gel di collagene con 2 mL di medium di cellulare con riduttori del siero (2%) e incubare le cellule a 37 ° C in un incubatore a CO2 con un umidificatore per 24, 48 o 72 ore.
Attenzione: La piastra deve essere maneggiata con cura per evitare che il gel di collagene da distaccarsi dal fondo di vetro.
3. esempio di preparazione di collagene gel utilizzando uno stock di collagene coda di ratto di 3,8 µ g/ml
- Su ghiaccio, combinare 114,5 µ l collagene coda di ratto, 16,6 µ l di 10 x DMEM e 33.1 µ l di terreno di coltura contenente il chemoattractant.
- Neutralizzare la miscela di collagene con 14.0 µ l di bicarbonato di sodio.
- Continuare come al punto 2.5.
4. imaging delle cellule
- Rimuovere delicatamente il supporto del piatto.
- Sciacquare delicatamente il gel con 1 mL di PBS.
- Fissare le cellule con 1 mL di paraformaldeide al 4% per 15 min.
- Lavare le cellule due volte con 1 mL di PBS.
- Macchia le celle con soluzione DAPI (100 ng/mL) per 20 minuti a temperatura ambiente.
- Immagine delle celle utilizzando un microscopio confocale in luoghi diversi e prendere 400 µm dello stack z immagini di ogni posizione di 16 µm. Il microscopio utilizzato ha un unità che permette l'imaging confocale utilizzando una luce bianca, la sorgente di eccitazione di arco di scansione del disco. Utilizzare una lente X 20 utilizzata con apertura numerica di 0,75.
- Ricostituire le immagini.
- Aprire le immagini per un determinato gel (circa 25 immagini) e creare una serie di immagini facendo clic su immagine → pile → immagini di stack. La prima immagine corrispondeva alla parte inferiore del gel (z = 0 µm), la seconda immagine corrispondeva al primo passo nella direzione z (z = 16 µm), la terza immagine corrispondeva al secondo passaggio nella direzione z (z = 32 µm). Valutare ogni nucleo ad ogni profondità di immagine e designare la profondità alla quale il nucleo era a fuoco più nitida come la profondità di invasione per quella determinata cella.
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Representative Results
Abbiamo usato una piastra di coltura di 35mm con un vetro inferiore e ratto coda collagene I a sviluppare e ottimizzare un'invasione in vitro 3D analisi di protocollo. Usando questa analisi, abbiamo ha mostrato quel seno cancro cellule MCF7 e MSC cellule potrebbero invadere in gel di collagene per una distanza media di 0,04 ± 1,8 µm e 41,3 ± 76,0 µm rispettivamente dopo 48 h quando IGF1 (18,6 ng/mL) è stato usato come chemoattractant (Figura 2). Ancora più importante, abbiamo dimostrato che i prodotti di fusione dalle cellule MSC e MCF7, che sono cellule rare, potrebbero invadere in gel collagene pure. Loro distanza media di invasione in 48h era 10,7 ± 12,4 µm quando IGF a 18,6 ng/mL è stato usato come chemoattractant (Figura 2). La differenza nella capacità di invasione tra MCF7 e MSCs è risultata statisticamente significativa (P < 0,01)11. La differenza tra la capacità di invasione dei prodotti di fusione e quella di MCF7 o MCSs non era statisticamente significativa. Tuttavia, questo test ha mostrato costantemente che i prodotti di fusione delle cellule cancro avevano una maggiore capacità migratoria ed invasiva rispetto alle cellule parentali cancro, MCF7.
Le cellule sono rimasto sane in tutto gli esperimenti come mostrato dalla loro morfologia e quantità 48h post gel polimerizzazione (Figura 3a). Con la progettazione di test di invasione verticale invertito, la cinetica della migrazione cellulare e invasione può essere analizzato (Figura 3b, 4) e la morfologia delle cellule può essere valutata (Figura 4).
Figura 1 : Timeline del progetto analisi invasione verticale invertito Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Capacità di invasione dei prodotti di fusione delle cellule tumorali. La capacità di invasione dei prodotti di fusione delle cellule tumorali potrebbe essere determinata mediante l'analisi di invasione verticale invertito. I numeri rappresentano la capacità di invasione medio di quattro prodotti di fusione indipendenti da tre distinte co-culture e le loro linee di cellulare parentale analizzati da otto diversi campi all'interno di ogni dosaggio. Questo esperimento è stato effettuato in triplice copia. ANOVA con test post-hoc di Tukey HSD. * * P < 0.01. Barre di errore rappresentano la deviazione standard (SD). Questa figura è stata adattata da 11. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Vitalità e serie Z del dosaggio invasione verticale invertito delle cellule.
a) 20 X immagini luminose del campo mostrando la morfologia delle cellule sotto il gel di collagene dopo due giorni. Da sinistra a destra MCF7 e co-coltura MSC, MCF7 e MSC; b) rappresentazione di serie di z Mostra due posizioni (i e ii) all'interno di un piatto dal basso verso l'alto. Immagini successive sono 16 µm apart. 3,8% FBS è stato usato come un fattore chemiotattico. Verde cerchi su entrambi i pannelli indicano le cellule d'invasione; Nota, fuori fuoco nella parte inferiore del gel e messo a fuoco nel top gel, invadendo in gel. Cerchi rossi su entrambi i pannelli indicano cellule residue nel livello inferiore della serie z (non invadere cellule). Barra della scala (a): 15 µm; Scala bar (b): 10 µm. Questa figura è stata adattata da 11. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Morfologia nell'analisi della invasione verticale invertito di cell. Morfologia di MSCs nel collagene gel in un'unica sede dal basso (Z = 0 µm) alla Z = 20 µm. 3,8% FBS è stato usato come un fattore chemiotattico. La freccia lunga indica l'appendice di un'invasione di MSC in gel. La punta della freccia indica un MSC, che è allineata lungo la parte inferiore del gel e non invadente. Il blu indica la macchia DAPI nucleare mentre il rosso indica i filamenti di actina falloidina macchiato. Questa figura è stata adattata da 11. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Qui, descriviamo un'analisi semplice di invasione verticale invertito che è conveniente per una varietà di tipi di cellule, compreso le cellule che sono rare e/o dipendente da loro microambiente. In questa analisi 3D di invasione, le cellule rimangono nel loro microambiente originale e sono coperti dal gel di collagene che contiene un fattore chemiotattico. Le cellule quindi migrano e invadono nel collagene. In questa analisi, le cellule possono essere macchiate e facilmente monitorate all'interno il gel. La semplicità e la riproducibilità di questo test, lo rende un comodo strumento per studiare la migrazione delle cellule tumorali e l'invasione in un sistema 3D. Tuttavia, forte chemioattrattanti sembrano essere necessari per rompere l'affinità delle cellule sul fondo della piastra di coltura.
Abbiamo ottimizzato l'analisi di invasione verticale invertito nella piastra di coltura di 35 mm. Questo piatto di cultura ha un fondo di vetro 10 mm che è ben attrezzata per l'imaging. Una limitazione di questo piatto di cultura è la notevole quantità di collagene gel necessari per eseguire un test. Individuazione più piccole piastre di coltura con un design compatibile con formazione immagine sarebbe più economici. Lo strato di gel appropriato per la progettazione di 35 mm piatto è molto delicato a causa della sua forza e può facilmente staccare dalla parte inferiore della piastra se non maneggiate con cura. Un disegno di cultura diversa cella potrebbe migliorare la stabilità di strato di gel di collagene, ma dovrebbe essere ottimizzata la compatibilità tra la vitalità di forza e delle cellule gel di collagene.
Nonostante queste limitazioni, l'analisi di invasione verticale invertito presenta molti vantaggi rispetto ad altri formati di analisi 3D invasione. Il vantaggio principale è che le cellule rimangono nel loro ambiente originale di cultura, che non è il caso in analisi dell'alloggiamento di Boyden. Questo protocollo consente di mantenere il microambiente delle cellule che è vantaggioso per le cellule rigorosamente controllate da loro microambiente quali cellule staminali15. Questa analisi impedisce anche di danno delle cellule o perdita delle cellule, soprattutto per le celle che sono delicati o rara10,11. Inoltre, con questa analisi, la morfologia delle cellule e cinetica associato potrebbe essere valutati all'interno del gel, che non è possibile con l'analisi della camera di Boyden. Inoltre, la non-fisiologica in policarbonato o filtro in polipropilene del sistema di dosaggio dell'alloggiamento di Boyden non viene utilizzato nell'analisi della invasione verticale invertito. L'analisi di invasione verticale invertito è un disegno statico, non imitare il in vivo ambiente dinamico che offre la progettazione di test di invasione microfluidici, ma fornisce un più semplice, meno impegnativo e conveniente ambiente 3D per quantificare migrazione e l'invasione di una varietà di tipi di cellule in un microambiente controllato e conservato.
Il saggio di invasione verticale invertito ha molte potenziali applicazioni in studi fisiopatologici. Questo approccio potrebbe servire come una piattaforma in vitro per studiare la motilità delle cellule durante lo sviluppo embrionale, ferita guarigione e/o le risposte infiammatorie3. Interazione della cellula con la ECM e altri tipi di cellule durante la migrazione e l'invasione potrebbe essere studiato anche usando questo protocollo. Questo test potrebbe anche rappresentare uno strumento utile per lo screening di stupefacenti iniziale di farmaci anti-metastatiche. Un sistema di modello della metastasi del cancro organo-specifici potrebbe essere sviluppato utilizzando l'analisi di invasione verticale invertito pure.
L'analisi di invasione verticale invertito è stato sviluppato per eludere la sfida che lo spostamento di alcune cellule da loro microambiente originale presenta il sistema di dosaggio dell'alloggiamento di Boyden. Questo test è semplice, affidabile e riproducibile; è flessibile e può essere utilizzato per quantificare il potenziale dilagante di una vasta gamma di tipi di cellule, inclusi i tipi di cellule sensibili e rara. Questo test può essere applicato per rilevare l'attività migratoria associati con degradazione della matrice e può anche essere adattato per studiare l'attività degradante selettiva su substrati di matrice diversa.
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Disclosures
Gli autori hanno dichiarato che nessun interesse concorrenti esiste.
Acknowledgments
Quest'opera è stata sostenuta dai National Institutes of Health (NIMHD-G12MD007581) attraverso il RCMI-centro per la salute ambientale alla Jackson State University e il dipartimento della difesa, Idea Award 11-1-0205.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MatTek P35G-1.5-10C | MatTek Corporation, Ashland, MA | P35G-1.5-10-C | mattek glass bottom dishes |
| Rat tail collagen I | Corning, Corning, NY, USA | 354236 | Collagen gel |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA | H1758 | HCl |
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA | 10010023 | PBS |
| 10X Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA | D2429 | 10X DMEM |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA | S5761 | NaHCO3 |
| Confocal Fluorescent microscope | Olympus America, Center Valley, PA, USA | Olympus IX81 | Confocal microscope |
| Defined Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences HyClone Laboratories, Utah, USA | SH30070.03 | FBS |
| Ti:Sapphire multi-photon laser scanning microscope | Prarie Technologies, Sioux Falls, SD, USA | 40x NA 0.8 objective | MPLSM |
| Imaris software | Bitplane Inc. Zurich, CH | Imaris 7.5.2 | Imaris software |
| DAPI | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA | D9542 | DAPI |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA | 50980487 | PFA |
| α-minimum essential medium | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA | M0894 | |
| MDA-MB-231 | ATCC; Manassas, VA, USA | HBT-22 | |
| MSC | Trivedi and Hematti, 2007 | ||
| 20X lens UPLAPO | Olympus America, Center Valley, PA, USA | 36-064 | Olympus UPLSAPO 20X Objective |
References
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