Summary
Flüssigkeit-Fütterung Insekten haben die Fähigkeit, kleinste Mengen von Flüssigkeiten aus porösen Oberflächen zu erwerben. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode um die Fähigkeit der Insekten zu Verschlucken von Flüssigkeiten aus porösen Oberflächen mit Fütterung Lösungen mit Leuchtstofflampen, magnetische Nanopartikel direkt zu bestimmen.
Abstract
Flüssigkeit-Fütterung Insekten nehmen eine Vielzahl von Flüssigkeiten, die in der Umwelt als Pools, Filme, oder beschränkt sich auf kleine Poren. Studien von flüssigen Erwerb erfordern Beurteilung Mouthpart Struktur und Funktion Beziehungen; flüssige Aufnahme Mechanismen sind jedoch historisch aus der Beobachtung der strukturellen Architektur, manchmal ohne Begleitung mit experimentellen Beweis abgeleitet. Hier berichten wir über eine neuartige Methode zur Beurteilung der Fähigkeiten der Flüssigkeit-Aufnahme mit Schmetterlingen (Lepidoptera) und fliegen (Diptera) mit kleinen Mengen von Flüssigkeiten. Insekten werden mit 20 % Saccharose-Lösung gemischt mit Leuchtstofflampen, magnetische Nanopartikel aus Filterpapiere bestimmten Porengrößen gefüttert. Die Ernte (interne Struktur zum Speichern von Flüssigkeiten verwendet) ist das Insekt entnommen und auf einem confocal Mikroskop gelegt. Ein Magnet ist winkte, von der Ernte, das Vorhandensein von Nanopartikeln, zu bestimmen, die angeben, ob die Insekten Flüssigkeiten aufnehmen können. Diese Methode wird verwendet, um einen weit verbreiteten Fütterung Mechanismus (Kapillarwirkung und flüssigen Brückenbildung) aufzudecken, der möglicherweise unter Lepidoptera und Diptera geteilt wird, bei der Fütterung von porösen Oberflächen. Darüber hinaus können mit dieser Methode für Studien der Fütterung Mechanismen unter einer Vielzahl von Flüssigkeit-Fütterung Insekten, darunter diejenigen wichtig in einer Krankheitsübertragung und Biomimetik und möglicherweise andere Studien, die Nano-Mikro-Größe oder Leitungen beinhalten wo Flüssigkeitstransport erfordert Überprüfung.
Introduction
Viele Insektengruppen haben Mundwerkzeuge (Proboscises) geeignet für die Fütterung auf Flüssigkeiten, wie Nektar, faulenden Früchten, sap, fließt (z.B. Diptera1, Lepidoptera2, Hymenoptera3), Xylem (Hemiptera4), Tränen (Lepidoptera ( 5), und Blut (Phthiraptera6, besitzen7, Diptera7, Hemiptera8, Lepidoptera9). Die Fähigkeit der Insekten ernähren sich von Flüssigkeiten ist Krankheit Getriebe4,11, Biodiversification2,12, Studien und Ökosystem Gesundheit (z. B. Bestäubung10) konvergente Entwicklung13. Trotz der Vielzahl von Nahrungsquellen ist ein Thema unter einigen Insekten Fluid-Fütterung die Möglichkeit, kleine Mengen von Flüssigkeiten, zu erwerben, die auf Mikro-Nano-Größe oder Tropfen, Flüssigkeitsfilme oder porösen Oberflächen beschränkt werden könnte.
Angesichts der umfangreichen Vielfalt der Flüssigkeit-Fütterung Insekten (mehr als 20 % aller Tierarten14,15) und ihre Fähigkeit, auf einer Vielzahl von Nahrungsquellen ernähren, verstehen ihre Fütterung Verhaltensweisen und Mechanismen der Flüssigkeit-Aufnahme ist in vielen Bereichen wichtig. Insekt Mouthpart Funktionalität, hat zum Beispiel eine Rolle bei der Entwicklung von Biomimetic-Technologie, z.B., mikrofluidischen Geräte, die Aufgaben wie der Erwerb von geringen Mengen an Flüssigkeiten mit Methoden, die ähnlich wie die Beschäftigten können durch Insekten16. Ein grundlegendes Problem in den Studien der flüssige Aufnahme Mechanismen, jedoch ist bestimmen nicht nur, wie Insekten auf Flüssigkeiten ernähren, aber experimentelle Beweise, dass den Mechanismus unterstützt zu erwerben. Allein mit Verhalten (z. B. mit dem Rüssel12,17sondieren) als Indikator für die Fütterung unzureichend, ist weil es nicht die erfolgreiche Aufnahme von Flüssigkeiten bestätigen, noch es ein Mittel bietet, um die Route zu bestimmen, Flüssigkeiten zu reisen als Durchgang durch das Insekt. Darüber hinaus stellt die Durchführung von Experimenten mit kleinen Mengen an Flüssigkeiten besser natürliche Fütterung Szenarien, wo Flüssigkeiten eine begrenzende Ressource2,12sind.
X-ray Phase Kontrast Bildgebung mit der Monarchfalter (Danaus Plexippus L.) verwendet wurde, um zu beurteilen, wie Schmetterlinge auf kleine Mengen von Flüssigkeiten aus porösen Oberflächen12ernähren. Monarchfalter verwenden Kapillarwirkung über Leerzeichen zwischen kutikulären Projektionen (dorsale Legulae) entlang der Rüssel, um Flüssigkeiten beschränkt sich auf kleine Poren in den Lebensmittel-Kanal zu bringen. Die eingehenden Flüssigkeiten bilden einen Film auf der Nahrung Kanalwand, das wächst und bricht in eine flüssige Brücke durch Plateau Instabilität12,18, das dann durch Einwirkung der saugende Pumpe in den Kopf, der Schmetterling Darm transportiert wird. Obwohl Röntgenbildgebung Phase Kontrast ein optimales Werkzeug zur Visualisierung von Strömung innerhalb der Insekten12,19,20,21, die Technik ist nicht leicht zugänglich und ein bequemer Methode für schnelle Einschätzung eines Insekts Fähigkeit zur Aufnahme von Flüssigkeiten benötigt wird und schlucken sie.
Um festzustellen, ob die Fütterung Mechanismus für D. Plexippus anderer Lepidoptera und auch fliegen (Diptera) (beide Gruppen ernähren sich von Flüssigkeiten aus porösen Oberflächen), gilt Lehnert Et Al. 13 angewendet eine Technik für die Beurteilung eines Insekts Fähigkeit, ernähren sich von kleinen Mengen an Flüssigkeiten aus porösen Oberflächen, die hier ausführlich berichtet wird. Obwohl das Protokoll hier skizzierten für Studien, mit denen benetzt und porösen Oberflächen ist, kann die Methodik für andere Studien, wie die Adressierung Pool-Fütterung Mechanismen geändert werden. Darüber hinaus erweitern die Anwendungen in anderen Bereichen, einschließlich der Mikrofluidik und Muskelmodelle Technologie.
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Protocol
(1) Insektenarten, Zubereitung von Lösungen und Fütterung Station Setup
Hinweis: Kohl Schmetterlinge (Pieris Rapae L., Pieridae) sind wie die Arten der Vertreter Lepidoptera ausgewählt, weil sie in früheren Studien der Flüssigkeit-Aufnahme Fähigkeiten und Mouthpart Morphologie22,23verwendet wurden. Stubenfliegen (Musca Domestica L., Muscidae) und blaue Flasche fliegt (Hexamerinaufnahme Vomitoria L., Calliphoridae) werden verwendet, da sie oft beobachtet werden, Fütterung auf porösen Oberflächen13.
- Bestellung p. Rapae als Larven von einem Insekt Zulieferer und hinten auf künstliche (siehe Tabelle der MaterialienErnährung) bis sie verpuppen sich und erweisen sich als Erwachsene in einer Klimakammer setzen auf 23 ° C und einer 18 L: 6 Photoperiode. Bestellung M. Domestica und C. Vomitoria als Puppen und sie an den gleichen Umweltbedingungen als p. Rapaehinten. Füttern Sie Erwachsenen Schmetterlinge und fliegen nicht, nachdem sie aus den Puppen vor den Fütterungsversuchen hervorgehen.
- Bereiten Sie einen 20 % Saccharoselösung (Kontrolle) und eine 20 % Saccharose Nanopartikel Lösung für flüssige Aufnahme zu testen. Bereiten Sie die Nanopartikel-Lösung durch Zugabe von fluoreszierenden magnetische Nanopartikel (Eisenoxid mit einem Polyacryl Säure-Beschichtung, ca. 20 nm Durchmesser)24 zu einer 20 % Saccharose-Lösung (1 mg/mL dH2O Nanopartikel mit 20 % Saccharose Lösung 1:1). Bereiten Sie eine 1 X Lösung von Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) (10-fach verdünnt auf 1 X dH2O, pH 7,4), die für Sezierungen verwendet wird.
- Einrichten einer Futterstelle, die aus einer manuellen Manipulator mit einer Klemme und einer separaten Fütterung Bühne (eine flache Plattform) besteht (Abbildung 1). Legen Sie eine konkave Folie auf der Fütterung Bühne und haben Sie Nylon net Filter mit Größe Porendurchmesser von 11, 20, 30, 41 oder 60 µm und Membran-Filter mit Poren Größe Durchmesser von 1, 5, 8 oder 10 µm in der Nähe für die Fütterungsversuche.
2. Protokoll Fütterung
- Des Insekts Körper, Beine und Flügel in einem gefalteten Seidenpapier einwickeln. Positionieren Sie das Insekt, so dass nur der Kopf und Mundwerkzeuge ausgesetzt sind. Legen Sie die Flügel der Insekten zwischen zwei Objektträger, die durch die Klammer auf der Manipulator zusammengehalten werden, so dass das Insekt über die Fütterung Bühne (Abbildung 1) ausgesetzt ist.
- Verabreichen Sie ein 30 µL Tröpfchen von der 20 % Saccharose-Lösung oder die 20 % Saccharoselösung Nanopartikel mit einer Mikropipette an die Mitte der konkaven Folie. Legen Sie ein einzelnes Filterpapier von einer bestimmten Porengröße auf der konkaven Folie, so dass die Mitte des Filterpapiers mit den Tropfen der Nanopartikel-Lösung ausgerichtet ist. Der Kontakt zwischen den Tropfen und das Filterpapier führt die Lösung entlang dem Filterpapier, füllen die Poren (Abbildung 1).
Hinweis: Das Filterpapier wird auf das Droplet, anstatt die andere Weise herum, platziert, um das mögliche Vorhandensein von Nanopartikeln auf dem Filterpapier zu minimieren, wo die Insekten ernähren. - Positionieren Sie das Insekt mit dem Manipulator, so dass nur die distale Bereiche der die Mundwerkzeuge der benetzte Filterpapier auf der Fütterung Bühne (Abbildung 1) erreichen können. Verwenden Sie eine Insekt Pin zum verlängern die Mundwerkzeuge auf dem Filterpapier und ermöglichen das Insekt zu Futtermittel für 45 s.
- Zur Minimierung der Chance von Insekten ernähren sich von flüssigen Filme, die auf der Oberfläche des Filterpapiers vorhanden sein können, positionieren Sie die Mundwerkzeuge so, dass sie in Kontakt mit einem Teil des Filterpapiers sind, die berührt die flache Seite der Folie (zB. nicht direkt über die konkave Seite der Folie). Wenn das Insekt ein Interesse in der Fütterung nicht zum Ausdruck bringt, können die Mundwerkzeuge auf dem Filterpapier mit dem Insekt-Pin für die Dauer der Fütterung stattfinden.
(3) Sezierungen
- Legen Sie die PBS-Lösung in einem 50 mm-Uhrglas, so dass es genug Lösung gibt um das Insekt Körper bedecken. Legen Sie das Uhrglas unter ein Stereoskop und Position Insekt sezieren Ausrüstung (Frühling "Micro" sezieren, Schere, Insect Pins, feine Spitze, seziert Zange) neben das Stereoskop.
- Entfernen Sie nach der Fütterung das Insekt aus dem Tissue-Papier und mit Flügeln geschlossen zu halten. Entfernen Sie Kopf, Beine und Flügel der Insekten mit der Feder Mikro sezierenden Schere zu und das Insekt in die PBS-Lösung in das Uhrglas (Abbildung 2).
- Wenn nötig, zu betäuben Insekten vor Dissektionen. Verwenden Sie Zange, um das Insekt durch das Häutchen in der Nähe der distalen Region des Bauches zu halten. Verwenden Sie mit der dominanten Hand den Frühling Micro Präparierscheren, schneiden die Nagelhaut in eine anteriore Richtung entlang der lateralen Seite des Bauches, beginnend am hinteren Ende, bis der Brustkorb erreicht ist. Achten Sie besonders darauf, dass nur die Nagelhaut geschnitten ist und, dass der Verdauungskanal in das Insekt nicht (Abbildung 2 beschädigt).
- Machen Sie weitere Kürzungen der Nagelhaut mit der sezierenden Schere öffnet den Bauch um den Verdauungskanal innen (Abbildung 2) sichtbar zu machen. Entfernen Sie der Abdominal-Kutikula, dicken Körper und andere Strukturen mit Hilfe von Insekten Pins und außerhalb das Uhrglas für anschließende Entsorgung, so dass nur die Thorax und Verdauungskanal in das Uhrglas zu verlagern.
Hinweis: Die Zerlegung wird die Ernte zeigen, die was einen Sac-artige Struktur (Verlängerung der Verdauungskanal) in der Nähe der Stelle des Thorax und Abdomen ist. - Wenn die Ernte nicht ausgesetzt ist, stellen Sie zusätzliche Einschnitte in den Brustkorb mit der Schere bis die Ernte offenbart. Sobald die Ernte sichtbar ist, schneiden Sie die restlichen Teile des Insekts verlassen nur den Verdauungskanal mit der Ernte in das Uhrglas (Abbildung 2).
Hinweis: Die Lepidoptera Ernte ist fast transparent und Cellophan-wie in der Natur, die möglicherweise schwer zu erkennen, wenn sie nicht mit Flüssigkeiten gefüllt und erweitert oder wenn es während der Präparation geschnitten wird. - Verwenden Sie feine Spitze, seziert Zange um die Ernte auf einem Deckgläschen (24 x 24 mm) zu platzieren, für nachfolgende Bildgebung (Abbildung 2).
4. Bestimmung des aufgenommenen Nanopartikel
- Position der Ernte auf dem Deckglas mit der feinen Spitze sezierenden Zange mit darauf, dass kein bersten die Ernte. Verwenden Sie die CY3 Kanal (oder Phasenkontrast) auf einem inversen konfokalen Mikroskop für die Bildgebung mit 20 X Vergrößerung. Bild der Erntegutes sofort nach Dissektion damit sie nicht austrocknen.
- Halten Sie einen magnetischen Stir bar (41,3 mm Länge und 8 mm Durchmesser) in die Hand, die keine Kontrolle über die Betriebsphase des Mikroskops ist.
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Representative Results
Die Studie der Muster in Flüssigkeit-Aufnahme Fähigkeiten unter Flüssigkeit-Fütterung Insekten erfordert Entschlossenheit der Fütterung auftreten. Das Protokoll hier skizzierten wird verwendet, um die begrenzende Pore Größe Hypothese unter Lepidoptera und Diptera13. Die begrenzende Pore Größe Hypothese besagt, dass Flüssigkeit-Fütterung Insekten aus Flüssigkeit gefüllten Poren nicht ernähren können, wenn der Porendurchmesser Größe kleiner als der Durchmesser der Fütterung Leitungen12 ist. Eingehenden Flüssigkeiten von der porösen Oberfläche müssen eine stabile flüssige Brücke über Plateau Instabilität18, um die Kapillaren Druck halten die Flüssigkeiten in den Poren zu überwinden und um eine flüssige Oberfläche für die saugende Pumpe einwirken bilden. Insekten mit der Fütterung von Leitungen in verschiedenen Größen (Abbildung 3) werden voraussichtlich in der kleinste Porengröße unterscheiden sich von denen sie sich ernähren können.
Die begrenzende Porengröße für jede Art errechnet sich die Möglichkeit für 50 % der getesteten Personen ernähren sich von einer bestimmten Porengröße von Filterpapier13. Insekten gefüttert 20 % Saccharoselösung (Kontrolle) haben keine Nanopartikel in den Beständen. Nach Insekten seziert wurden, um festzustellen, ob Nanopartikel aufgenommen wurden, wurden ihre Mundwerkzeuge mit einem konfokalen Mikroskop, Messen Sie die Leitungen in den proximalen und distalen Regionen (Abbildung 3) abgebildet. Distale und proximale Messungen wurden gemacht, weil es vielleicht dienen als Indikator für die kritische Lage wo Flüssigkeiten geben Sie die Mundwerkzeuge, d. h., eine enge Beziehung zwischen Mouthpart Conduit Größen und Begrenzung der Porengröße könnten indirekte Beweis für Mouthpart Strukturen, die Kapillarwirkung zu erleichtern. Der Durchmesser des Kanals Nahrung für Proboscises von p. Rapae wurden in der Nähe der Spitze Region (distale Messung) und bei 30 % der Rüssel Länge (proximalen Bereich) gemessen. Der mittlere Durchmesser der fünf Pseudotracheae diente als die distalen Messung und der Durchmesser der mündlichen Eröffnung wurde als der proximalen Messung für jede Fliege Probe gemessen.
Dieses Protokoll ergab eine enge Beziehung zwischen distalen Mouthpart Leitung Größen und der kleinste Porengröße von der Insekten (Abbildung 4) nähren können. Beweise für die Dipteren Art zuerst in der Pseudotracheae (distale Mouthpart Messung) anstatt der mündlichen Eröffnung (proximalen Mouthpart Messung) vorkommt, dass flüssige Aufnahme angezeigt bei der Fütterung von porösen Oberflächen (Abbildung 4). Interessant ist, die strukturellen Architektur der Pseudotracheae ist ähnlich dem von Lepidoptera Mundwerkzeuge und besteht aus kutikulären Strukturen, die flüssige Aufnahme durch Kapillarwirkung, ein Beispiel von konvergente Entwicklung13fördern könnte. Die enge Beziehung zwischen der Begrenzung der Porengröße und Mouthpart Conduit Größen nachweist, die Kapillarwirkung als einen wichtigen Bestandteil für flüssige Aufnahme unter Lepidoptera und Diptera unterstützt.
Abbildung 1: Versuchsaufbau und Futterstation. (A) das Setup besteht aus das Insekt in einem Papiertuch (Tp) und platzieren das Insekt Flügel zwischen zwei Folien (sl), die durch eine Klammer (cl) mit einem Manipulator (Ma) verbunden mit verstellbaren Knöpfen (ak) zusammengehalten werden. Das Insekt Rüssel (Pr) sinkt auf eine Fütterung Stufe (St), mit einem Filterpapier (fp), die auf ein Tröpfchen (dr) der Nanopartikel-Lösung befindet, die zu einer konkaven Folie (Cs) verabreicht wird. (B) Schaltplan zeigt die Platzierung der Tröpfchen und Filterpapier auf der konkaven Folie. (C) das Tröpfchen der Nanopartikel Lösung verbreitet (Pfeile) durch das Filterpapier über haarartige Tätigkeit um eine poröse Fütterung Oberfläche zu erstellen. (D) fluoreszierende Mikroskopbild der dorsalen Ansicht der Isopore Filtern zeigen Poren (po) (10 µm) mit Nanopartikel Lösung (20 X Vergrößerung, CY3 Channel). Keine flüssigen Film wurde auf der Oberfläche beobachtet. (E) Confocal Mikroskop Z-Stapel Bild zeigt Nanopartikel Lösung (ns) in den Poren des Isopore Filter (10 µm). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Präparation und Nanopartikel Erkennung. (A) Zange (fo) werden verwendet, um das Insekt (M. Domestica abgebildet, fl) zu sichern. (B) das Insekt Flügel, Kopf und Beine werden entfernt. (C) Schere (sc) werden verwendet, um die laterale Seite des Bauches aufgeschnitten. (D) reproduktiven Strukturen (z.B. Eiern) und nicht benötigte Teile des den Verdauungskanal sind mit zusätzlichen Zange entfernt. (E) zusätzliche Strukturen werden entfernt, um die Ernte (Cr) zu isolieren. (F) isoliert Ernte bereit für das Vorhandensein von Nanopartikeln. (G) die Ernte befindet sich auf einem Deckglas (Cs) und wird in einem inversen confocal Mikroskop verschoben. Eine magnetische Stir Bar (Ma) ist in der Nähe der Ernte zu Nanopartikel Bewegung verursachen winkte. (H) Nanopartikel Bewegung (beschrieben im roten Kreis) in der Ernte von C. Vomitoria mit Phasenkontrastmikroskopie. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Lepidoperan und Strukturen der Dipteren Mouthpart. (A) Laser Ablation Tomographie Bild zeigt die Lepidoptera Rüssel (Pr), die aus zwei länglichen maxillaris Galeae, die zusammen kommen besteht, durch die Verknüpfung von Strukturen (Legulae), die einen Lebensmittel-Kanal (fc) erstellen für flüssige Aufnahme. Der Inset (confocal Mikroskopbild) zeigt die dorsalen Legulae (dl) in der Nähe der distalen Region der Rüssel. Die Zwischenräume zwischen den dorsalen Legulae bieten Kapillarwirkung Flüssigkeiten in den Lebensmittel-Kanal zu bringen. (B) jede C-förmige Galea hat eine Luftröhre (tr), der Nerven und der intrinsischen Muskulatur (Im). (C) Dipteren Mundwerkzeuge bestehen aus ein Podest (Ro), Haustellum und einem distalen Lippe (lb), der kleine Leitungen, Pseudotracheae (pt) (siehe konfokale Bild im Einschub), die von einer zentralen oraler Öffnung (Op) ausstrahlen.Der Laser Ablation Tomographie Abbildung auch Facettenauge (ce) und der Oberkiefer Palpi (mp). (D) das Essen-Kanal, der zu der mündlichen Eröffnung verbindet besteht teilweise aus dem Labrum (la) und das Labium (lm). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Beziehung zwischen Insekten Mundwerkzeuge und Pore Größen, aus denen sie sich ernähren können. Die begrenzende Porengröße bezieht sich auf den Durchmesser (Mittelwert ± SEM) die distale Mouthpart Conduits, anstatt den proximalen Essen-Kanälen. Musca Domestica ist unten dargestellt C. Vomitoria. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Insekt Mouthpart Funktionalität ist historisch aus Studien von Brutto Morphologie abgeleitet (z. B.., Lepidoptera Rüssel Funktionalität im Zusammenhang mit einem trinken Stroh25,-26); jedoch haben neuere Studien, die experimentelle Beweise enthalten einen Paradigmenwechsel im Verständnis von der Komplexität der Insekten Mundwerkzeuge und Struktur-Funktions-Beziehungen-2,-12,-13 geführt , 22 , 27. zwar moderne bildgebende Verfahren, wie Scannen Elektronenmikroskopie23, konfokale Mikroskopie22, Mikro-Computertomographie (Mikro-CT)28oder Laser Ablation Tomographie (Abbildung 3), Chancen für detaillierte Studien der Morphologie, Beweise für die Funktionalität mit Experimenten einhergehen muß.
Die hier beschriebene Methode zeigt, dass Kapillarität könnte ein wesentlicher Mechanismus von Insekten beschäftigt, bei der Fütterung von porösen Oberflächen benetzt. Mit Fressverhalten (zB.,12,17sondieren) allein würde nicht ergeben diese Fütterung Mechanismus, wie einige Individuen, die Oberflächen mit ihrer Mundwerkzeuge sondiert nicht in der Lage waren zu ernähren, insbesondere zur Verfügung gestellt Filterpapiere mit pore Größe Durchmesser kleiner als der Durchmesser des Mouthpart Leitungen. Darüber hinaus Inspektion der Ernte um festzustellen, ob es Flüssigkeit gefüllt war auch würde nicht ausreichen, wie die Menge an Flüssigkeiten aufgenommen in diese Experimente waren zu klein für visuelle Beurteilung, d.h., die Ernte einige Insekten erschienen deflationiert, aber Nanopartikel waren noch vorhanden, darauf hinweist, dass Flüssigkeiten aufgenommen wurden.
Die Fähigkeit zur Verarbeitung von kleiner Insekten, manipulieren ihre Mundwerkzeuge mit einem Insekt Pin und führen Sie Sie vorsichtig, Sezierungen repräsentieren einige der kritischen Schritte und Einschränkungen der beschriebenen Methodik. Es gab Fälle, z. B. wo Sezierungen führte zu schneiden die Ernte, die das Insekt unbrauchbar für die Studie gemacht, weil der Inhalt des Getreides (eventuell mit der Nanopartikel-Lösung) mit der PBS-Lösung in das Uhrglas gemischt, so dass es schwierig ist, die Aufnahme von Nanopartikeln zu überprüfen. Darüber hinaus kann die Auto-Fluoreszenz der Insektenhaut behinderen mit Fluoreszenz-Mikroskopie als das einzige Mittel, um die Nanopartikel zu visualisieren; jedoch konfokale Bildgebung mit Phasenkontrast beseitigt dieses Problem und ein weiteres Mittel zur visuellen Beurteilung (Abbildung 2), welche auch, zeigt warum mit magnetischen Nanopartikeln im Gegensatz zu nur fluoreszierende Nanopartikel optimal ist. Obwohl dieses Protokoll ein Mittel zur Beurteilung der Fähigkeit für Insekten bietet, Flüssigkeiten aufzunehmen, ist eine Einschränkung, dass es kein Mittel, um die Nanopartikel sichtbar zu machen, während sie eingenommen werden; Daher eliminiert die Möglichkeit zur Untersuchung der Fluiddynamik während des Aufnahme-Prozess.
Die hier beschriebene Technik bietet eine Methode für die Bewertung der Fähigkeit der Insekten, kleine Mengen an Flüssigkeiten aufnehmen. Angesichts der enorme Vielfalt der Insekten Fluid-Fütterung, konnte dieses Protokoll in anderen Studien von Insekten mit Mikro und Nano-Größe Conduits in ihre Mundwerkzeuge eingesetzt werden. Darüber hinaus könnten zukünftige Studien eine ähnliche Technik verwenden bestimmt den Weg, die Flüssigkeiten Reisen durch den Verdauungskanal, z. B. unter Umgehung der Erntegutes, wie in einigen Insekten Blut-Fütterung beobachtet oder Studien, die untersuchen, wie lange Flüssigkeiten bleiben insbesondere Strukturen, wie den Mitteldarm und Enddarm, solange die Zeit zwischen Fütterung, Sezierungen, und imaging berücksichtigt werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt durch die National Science Foundation (NSF) Nein zu gewähren. IOS 1354956. Wir danken Dr. Andrew D. Warren (McGuire Mitte für Lepidoptera und Biodiversität, Florida Museum of Natural History, University of Florida) für die Erlaubnis zur Verwendung der Schmetterling Bilder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20% sucrose solution | Domino Sugar | Sugar needed to produce the sucrose solution with dH2O | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P5493 | 10X concentration diluted to 1X in dH2O for insect dissections |
| Single depression concave slide | AmScope | BS-C6 | Slide is necessary for feeding stage setup |
| Filter paper | EMD Millipore | NY6004700 (60 µm) | Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding |
| Filter paper | EMD Millipore | NY4104700 (41 µm) | Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding |
| Filter paper | EMD Millipore | NY3004700 (30 µm) | Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding |
| Filter paper | EMD Millipore | NY2004700 (20 µm) | Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding |
| Filter paper | EMD Millipore | NY1104700 (11 µm) | Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding |
| Filter paper | EMD Millipore | TCTP04700 (10 µm) | Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding |
| Filter paper | EMD Millipore | TETP04700 (8 µm) | Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding |
| Filter paper | EMD Millipore | TMTP04700 (5 µm) | Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding |
| Filter paper | EMD Millipore | RTTP04700 (1 µm) | Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding |
| Iris microdissecting scissors | Carolina Biological Supply Company | 623555 | Scissors used for dissections |
| Insect pins (#1) | Bioquip Products | 1208B1 | Pins used during dissections and feeding trials |
| Extra-fine point dissecting forceps | Carolina Biological Supply Company | 624684 | Dissecting equipment |
| Leica M205 C Stereoscope | Leica Microsystems | M205 C | Stereoscope used for dissections |
| Inverted confocal microscope | Olympus | IX81 | Fluorescent microscope used to detect magnetic nanoparticles |
| Fisherbrand PTFE Disposable Stir Bar | Fisherscientific | S68067 | Magnet used to detect nanoparticles |
| Kimtech Science Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | 34155 | Tissues used to secure insects during feeding trials |
| House fly (Musca domestica) pupae | Mantisplace.com | insects for experiments | |
| Blue bottle fly (Calliphora vomitoria) pupae | Mantisplace.com | insects for experiments | |
| Cabbage butterfly (Pieris rapae) larvae | Carolina Biological Supply Company | 144102 | insects for experiments |
| Finnpipette F1 | ThermoFisher Scientific | 4641080N | micropipette for dispensing liquids |
| Finntip 250 pipette tips | ThermoFisher Scientific | 9400250 | micropipette tips |
| Microscope Glass cover slides (=coverslips) (24 x 24 mm) | AmScope | CS-S24-100 | coverslips for viewing the insect's crop on confocal microscope |
References
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