Summary
I modsætning til ubiquitin ligases, er par E3 SUMO ligases blevet identificeret. Denne modificerede in vitro- SUMOylation protokol er købedygtig identificere roman SUMO E3 ligases ved en in vitro- rekonstitution assay.
Abstract
Lille ubiquitin-lignende modifier (SUMO) ændring er en vigtig posttranslationel modifikation (PTM) der medierer signaltransduktion primært gennem modulerende protein-protein interaktioner. Lig ubiquitin modifikation, SUMOylation er instrueret af en sekventiel enzym kaskade herunder E1-aktivering enzym (SAE1/SAE2), E2-konjugation enzym (Ubc9) og E3-ligase (dvs., PIA'ER familie, RanBP2 og Pc2). Forskellige fra ubiquitination, en E3 ligase er dog ikke-væsentlige for reaktionen, men ikke giver præcision og effektivitet for SUMO konjugering. Proteiner ændret af SUMOylation kan identificeres ved i vivo assay via immunoprecipitation med substrat-specifikke antistoffer og immunoblotting med SUMO-specifikke antistoffer. Demonstration af protein SUMO E3 ligase aktivitet kræver dog i vitro rekonstituering af SUMOylation assays ved hjælp af renset enzymer, substrat og SUMO proteiner. Da i in vitro- reaktioner, normalt SAE1/SAE2 og Ubc9, alene er tilstrækkeligt til SUMO konjugering, er forbedring af SUMOylation af en formodet E3 ligase ikke altid let at opdage. Her, beskriver vi en modificeret in vitro- SUMOylation-protokollen, der konsekvent identificerer SUMO ændring ved hjælp af en in vitro- rekonstitueres system. En trinvis protokol til at rense katalytisk aktive K-bZIP, en viral SUMO-2/3 E3 ligase, er også præsenteret. Den renset K-bZIP SUMOylation aktiviteter er vist på p53, en velkendt mål af SUMO. Denne protokol kan ikke kun være ansat for belyse roman SUMO E3 ligases, men også for at afsløre deres SUMO paralog specificitet.
Introduction
SUMO ændring blev oprindeligt identificeret som en reversibel posttranslationel modifikation (PTM), der regulerer protein stabilitet1. Ud over direkte konjugering, kan SUMO også være knyttet til et protein gennem non-kovalente interaktion af SUMO interaktion motiver (SIMs)2. Svarende til binding af tyrosyl-fosforylering af molekyler husly Src homologi 2 (SH2) eller phosphotyrosine bindende (PTB) domæner3,4, SUMO ændring giver en yderligere interaktion platform for selektiv rekruttering af SIM-holdige effektor proteiner5,6. Ud over regulering af signaltransduktion tjene SUMOylation transcriptional faktorer og kromatin remodeling molekyler til at modulere gen expression7,8. Undersøgelser af genome-wide SUMOylation mønstre har afsløret, at SUMO ændring er forbundet med enten positive9,10 eller negative10,11,12 transskription forordning, delvis på grund af paralogue, der kendetegner SUMOylation.
Der er tre store SUMO isoformer for protein de tråddannende øjeblikket i pattedyrceller; Disse omfatter SUMO-1, og yderst homologe SUMO-2 og SUMO-3 (benævnt SUMO-2/3)13. SUMO er normalt konjugeret med lysin (K) restkoncentrationer i ψKxD/E konsensus motiv i target proteinet. SIM i SUMO E3 ligases er ansvarlig for paralogue specificiteten14. I modsætning til ubiquitination veje der indeholder hundredvis af E3 ligases, har der kun været et par SUMO E3 ligases identificeret15. SUMO E3 ligases er defineret ved egenskaber, herunder deres evne til at (i) binde Ubc9, (ii) binder SUMO gruppe via et SIM-domæne og III forbedre SUMO overførsel fra Ubc9 over på bærematerialet. E3 ligase ikke er absolut nødvendige for SUMO konjugation16men giver substrat og SUMO-paralogue specificitet. Siden normalt kun en lille brøkdel af den samlede substrat protein er SUMO-modificeret, er påvisning af SUMOylated proteiner i vivo altid en udfordring. Derfor, nøjagtige og reproducerbare assays er nødvendige for at belyse den præcis funktion af SUMO ændring.
Til i vitro SUMOylation analyse, som evaluerer renset Ubc9 evne til at katalysere SUMOylation af substrat proteiner, er et godt anerkendte assay for at studere SUMO modifikation17. Men SUMO E3 ligase aktivitet i de fleste tilfælde ikke kan registreres eller kan kun påvises med muterede SUMO ligase med høj SUMO E3 ligase aktivitet og lav substrat specificitet ved standardprotokollen på grund af tilstedeværelsen af en rigelig mængde af Ubc918 . Den samlede succes af denne analyse afhænger i høj grad forsigtige titrering af renset Ubc9. Til i vitro SUMOylation analyse beskrevet her er ændret fra et standard SUMOylation protokol (Se Tabel af materialer). Observation af øget global SUMO ændring under Kaposis sarkom-associerede herpesvirus (KSHV) reaktivering foranledigede os til at identificere den virale SUMO E3 ligase, der kan være ansvarlig for op-regulering af SUMOylation. Efter en mindre screening af de interagerende proteiner af viral SUMO E3 ligase K-bZIP, p53 blev identificeret som en roman substrat. I denne protokol viser vi i detaljer i insekt celler trin involveret i den proteinekspression og -oprensning af wild-type K-bZIP, en viral SUMO E3 ligase med SUMO-2/3 specificitet. Den renset K-bZIP evne til at forbedre SUMOylation af p53, en velkendt SUMO substrat, er evalueret i tilstedeværelsen af reducerede mængder af E1 og E2 enzymer. Ved hjælp af denne modificerede SUMOylation assay, kan forskere pålideligt definere evner af SUMO E3 ligase SUMOylate roman eller kendte substrater, som er en primær skridt i studiet af protein SUMOylation. Derudover hjælper denne metode til at identificere roman SUMO E3 ligases med lav ligase aktivitet men høj substrat specificitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse af Baculovirus udtryk konstruktioner
-
Rense SUMO E3 ligase K-bZIP ved kloning af cDNA af K-bZIP19 til en dobbelt udtryk baculovirus vektor (se tabel af materialer) med en N-terminale epitop-tag. Vi har haft succes med en octapeptide tag (angivet i hele protokol som vektor-tag-K-bZIP).
Bemærk: DNA-skabelon til K-bZIP polymerase kædereaktion (PCR) kloning er cDNA omvendt transskriberet fra RNA isoleret fra TREx F3H3-K-Rta BCBL-1 celler efter doxycyclin behandling20.- Overføre den fuld længde K-bZIP cDNA19 i dobbelt udtryk vektor med Cpojeg kloning websteder. CPO Jeg fordøje PCR produkt og 1 µg af dobbelt udtryk vektor ved 37 ° C til 3 h21.
- Adskille og udtrække fordøjet DNA efter elektroforese på en 0,8% Agarosen gel22. Ligate Indsæt (K-bZIP) og vektor af T4 DNA ligase ved 16 ° C i 30 min ifølge producentens anvisninger (Se Tabel af materialer).
- Tilsæt 5 µL af ligatur DNA til 50 µL kompetente E. coli celler "A" (Se Tabel af materialer) i 1,5 mL rør. Lagt på is i 30 min. Altså Ruger 1,5 mL tube i vandbad 42 ° C til 45 s og straks lægge røret på is i 3 min.
- Tilføje 600 µL S.O.C. medium (0,5% (w/v) gærekstrakt, 2% (w/v) trypton, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 20 mM MgSO4og 4% (w/v) glukose) ind i røret og der inkuberes ved 37 ° C i 1 time. Derefter centrifugeres rør ved stuetemperatur i 3 min. 600 x g.
- Fjern supernatanten, resuspend pellet med 60 µL Luria-Bertani medium (LB; 1% (w/v) trypton, 0,5% (w/v) gær extract, og 85 mM NaCl) og spredes på LB agar plader der indeholder 100 µg/mL ampicillin. Inkuber agar plade ved 37 ° C i 16 h23,24.
- Vælg 1 koloni til podes i 5 mL LB medium indeholdende 100 µg/mL ampicillin og kultur ved 37 ° C i 16 h med 250 rpm ryster. Derefter udtrække plasmid, vektor-tag-K-bZIP, af en plasmid udvinding kit ifølge producentens anvisninger (Se Tabel af materialer).
-
Generere den rekombinante bacmid husly tag-K-bZIP ved omdannelsen af vektor-tag-K-bZIP til kompetente E. coli celler "B" (se tabel af materialer).
- Bland 0,2 µg vektor-tag-K-bZIP plasmid og 100 µL kompetente E. coli celler "B" i en 1,5 mL rør og sat på isen i 30 min. Ruger røret i 42 ° C vandbad til 45 s og straks lægge røret på is i 3 min.
- Tilføje 900 µL af S.O.C. medium ind i røret og der inkuberes ved 37 ° C i 4 h med rotation på 50 rpm. Næste, tage 10 µL af medium, tilføje en ekstra 50 µL af S.O.C medium at udbrede på LB agar plader der indeholder 50 µg/mL kanamycin, 7 µg/mL gentamicin, 10 µg/mL tetracyclin, 100 µg/mL galactosidase substrat og 40 µg/mL isopropylalkohol β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG ), og der inkuberes plader i 48 timer ved 37 ° C.
- Podes en hvid koloni i 5 mL LB medium indeholdende 50 µg/mL kanamycin, 7 µg/mL gentamicin og 10 µg/mL tetracyclin. Der inkuberes ved 37 ° C med 250 rpm ryster for 16 h.
- Isolere den rekombinante bacmid DNA husly tag-K-bZIP, kvantificere og genopslæmmes i en koncentration på 1 µg/µL25.
-
Generere rekombinante baculoviruses udtrykker tag-K-bZIP af transfecting 1 µg af rekombinante bacmid DNA med tag-K-bZIP i Sf9 celler i en godt af en 6-godt plade.
- Frø 2 x 106 Sf9 celler (Se Tabel af materialer) i 2 mL nåde insekt Medium leveres med 10% føtal bovint serum (FBS) og 1% gentamicin i hver godt af en 6 godt plade, så inkuberes ved 27 ° C i 1 time.
- Opretholde en log fase kultur af Sf9 celler i nådes insekt Medium leveres med 10% FBS, 1% gentamicin og 1% vaskemiddel C (Se Tabel af materialer) på 27 ° C i orbital suspension på 140 rpm. Tælle celler ved hjælp af en hemocytometer og trypan blå pletter; cellernes levedygtighed bør overstige 95%. Vedligeholde celler ved hjælp af et bikulturer forhold på 1:3 hver 2-3 dage (minimal tæthed ~0.5 x 106 celler/mL).
- Tilføj 2 µL bacmid DNA (1 µg/µL) og 98 µL reduceret serum media (Se Tabel af materialer) ind i et 2 mL rør. Derefter tilsættes 4 µL Transfektion reagens (Se Tabel af materialer) til tube og bland godt. Inkuber ved stuetemperatur i 15 min.
- Tilføj denne Transfektion blanding (104 µL) i hver brønd og Inkuber ved 27 ° C i 12-16 h.
- Fjern udmattet medie med blid aspiration, og erstatte med 2 mL frisk nåde insekt Medium leveres med 10% FBS og 1% gentamicin. Sf9 cellerne overholde løst plade overflade og vil ikke blive forstyrret med blid aspiration.
-
Indsamle rekombinante baculovirus efter Transfektion og forstærke baculovirus for at opnå høj-titer bestande (P1) til yderligere forsøg.
- 72 h efter skiftende medium, Skrab Sf9 celler ved hjælp af en steril celle løfteren, indsamle supernatanten fra hver enkelt brønd i en 1,5 mL rør og vortex for 10 s.
- Der centrifugeres ved 4 ° C i 3 min på 150 x g. indsamle supernatanten som P0 baculovirus og alikvot i 1,5 mL rør (1 mL baculovirus i hver tube). Opbevares ved-80 ° C.
- Frø 1 x 107 Sf9 celler i 10 mL nåde insekt Medium leveres med 10% FBS og 1% gentamicin i en 10 cm petriskål og inkuberes ved 27 ° C i 1 time.
- Til forstærkning af rekombinante baculoviruses udtrykker tag-K-bZIP, der tilsættes 0,5 mL P0 baculovirus til seedede Sf9 celler og inkuberes ved 27 ° C for 48 h.
- Indsamle supernatanten som P1 baculovirus i en 15 mL rør og opbevares ved 4 ° C i op til 1 måned.
2. rensning af K-bZIP
- Opretholde en log fase kultur af Sf9 celler i nådes insekt Medium leveres med 10% FBS, 1% gentamicin og 1% vaskemiddel C på 27 ° C i orbital suspension på 140 rpm som beskrevet i trin 1.3.2.
- På dagen for transduktion, der tilsættes 1 mL af baculovirus-holdige supernatanten (P1) i 250 mL af Sf9 celler med en massefylde på 2 x 106 celler/mL.
- Inkubér Sf9 celler i 72 timer ved 27 ° C på en orbitalryster med 140 rpm ryster og derefter indsamle ved centrifugering ved 2,740 x g i 15 min. ved 4 ° C.
- Fjern supernatanten og lyse celle pellets i 10 mL lysisbuffer (20 mM HEPES pH 7,9, 0,5 M NaCl, 1% vaskemiddel en (Se Tabel af materialer), 2% glycerol, protease hæmmer cocktail) og rotere på 50 rpm ved hjælp af en suspension mixer ved 4 ° C i 30 min.
- Centrifuge celle lysate på 15.000 x g i 15 min. at indsamle supernatanten.
- For at rense tag-K-bZIP, inkuberes cellelysater (10 mL) med 50 µL antistof-tagged magnetiske perler i 14 mL polypropylen rør og rotere på 50 rpm i 3 timer ved 4 ° C ved hjælp af en suspension mixer. Efter protein capture, pellet perler på 800 x g centrifugering for 30 s ved 4 ° C. Fjerne de fleste af supernatanten, genopslæmmes perlerne i residualvolumen omkring 1 ml, og overføre til en 1,5 mL tube til vask.
- Vask de erobrede protein ved at placere røret indeholder perler på en magnetisk stå, og Fjern supernatanten når de magnetiske perler har fuldt ud levet op til siden af røret.
-
Vask perler med lysisbuffer fire gange.
- Tilsæt 1 mL lysisbuffer i 1,5 mL rør, og vend rør 10 gange. 1,5 mL røret anbringes på en magnetisk stå og Fjern supernatanten som beskrevet i 2.7.
- Gentag det forrige trin en anden 3 gange.
-
Vask perler med fosfatbufferet saltopløsning (PBS) én gang.
- Der tilsættes 1 mL PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1,5 mM KH2PO4) i 1,5 mL rør, og vend rør 10 gange.
- Sætte 1,5 mL tuben på en magnetisk stand og derefter på Fjern supernatanten.
- Elueres tag-K-bZIP protein fra de antistof-tagged magnetiske perler ved at tilføje 100 µL af 150 µg/mL octapeptide fortyndes i PBS til en 1,5 mL tube. Rotere røret i 10 min på 50 rpm ved suspension mixer ved stuetemperatur. Derefter placere røret tilbage på den magnetiske stå og samle de K-bZIP-holdige supernatanten i en ren 1,5 mL tube.
- Analysere 1-5 µL renset tag-K-bZIP protein af SDS-PAGE efterfulgt af Coomassie blå farvning26. Indlæse 2 µg, 1 µg, og 0,5 µg prøver af bovint serumalbumin (BSA) på samme gel og bruge det til kvantificering med et billede behandlingsprogram, ligesom ImageJ. Anslå K-bZIP koncentrationen ved sammenligning BSA standarder.
- Den renset K-bZIP er nu klar til at blive brugt i hver SUMOylation assay. Fortyndes K-bZIP i PBS til en endelig koncentration på 100 ng/µL og opbevares i små alikvoter ved-80 ° C.
3. SUMOylation indhold
- Tilføje 3 µL af 100 ng/µL af renset tag-K-bZIP i master mix af hver in vitro- SUMOylation reaktion. Komponenter i master mix indeholder 1 µL protein buffer, 1 x SUMOylation buffer, 0,5 µL p53 protein (0,5 mg/mL), 25 nM E1 aktivering enzym (bestanden koncentreret: 1 µM), 50 nM E2 de tråddannende enzym (bestanden koncentreret: 10 µM), og 250 nM SUMO peptider (SUMO-1 , SUMO-2 eller SUMO-3; bestanden koncentreret: 5 µM) til en endelige mængden af 17 µL.
- Bland indholdet forsigtigt og inkuberes reaktion ved 30 ° C til 3 h. Stop reaktionen ved at tilføje 20 µL af 2 x SDS-PAGE loading bufferen (100 mM Tris-HCL pH 6,8, 4% sodium dodecyl sulfat, 0,2% (w/v) bromophenol blå, 20% (v/v) glycerol og 200 mM β-mercaptoethanol) og denaturere prøver ved 95 ° C i 5 min.
-
Separate prøver på SDS-PAGE, overføre de adskilt proteiner på PVDF membran ved hjælp af en halvtør elektroforese overførsel apparater, og analysere af vestlige skamplet ved hjælp af anti-p53 antistof.
- Konfigurere apparatet gel som i trin 2.11, og indlæse 20 µL af prøven i gel brønde.
- Køre 10% gel i en konstant nuværende på 80 V til ca. 120 min. (indtil farvestof bandet når bunden af gelen). Efter afslutningen af elektroforese, slukke for strømforsyningen.
- Afbryde gel apparater og gel kassetter til at tegne en gel, og flyde gel til halvtør overførsel buffer (48 mM Tris-HCl, 39 mM glycin, 20% methanol) i 5 min.
- Tage en anden beholder og blød PVDF membran i methanol i 1 minut. Derefter tage PVDF ud af methanol og sætte i halvtør overførsel buffer. Forsigtigt agitere membran i 5 min.
- Fjern dækslet over sikkerheden af den semi-tør elektroforese apparater.
- Pre våd filtrerpapir, og forberede en gel sandwich på bunden platin anoden som følger: filtrerpapir, PVDF membran, gel og filtrerpapir.
- Sikker katode plade og sikkerhed dække, derefter køre skamplet på 15 V konstant nuværende i 90 min. Turn off strømforsyning, afbryde halvtør apparater, og tage ud PVDF membran.
- Blok PVDF membran med blokerende buffer (5% fedtfrit mælk i TBST buffer (137 mM NaCl2, 20 mM Tris-HCl, 0,1% vaskemiddel B (Se Tabel af materialer), pH 7,6)) ved stuetemperatur i 1 time med 30 rpm ryster af orbitalryster.
- Krydse PVDF membran med anti-p53 antistof fortyndet (1:1, 000) i blokerende buffer i 12-16 timer ved 4 ° C med 30 rpm ryster ved hjælp af en suspension mixer.
- Tag PVDF membranen i en beholder og sætte i TBST. Skyl PVDF membran med TBST to gange mere.
- Blød PVDF membran i TBST i 30 min med 45 rpm ryster af orbitalryster.
- Krydse PVDF membran med anti-kanin antistof konjugeret med peberrodsperoxidase (HRP) fortyndet (1:4, 000) i blokerende buffer i 1 time ved stuetemperatur med 30 rpm ryster ved hjælp af en suspension mixer.
- Vask PVDF membran med TBST 3 gange som beskrevet i trin 3.4.10.
- Blød PVDF membran i TBST i 30 min med 45 rpm ryster ved hjælp af en suspension mixer. Fjerne TBST og tilføje PBS for at bevare PVDF membranen ved 4 ° C i op til 12 timer.
- Bland forstærket kemiluminescerende substrat (ECL substrat) reagens 1 og 2 (1:1) (Se Tabel af materialer). Fjerne PVDF membran fra PBS, duppes kort med et stykke køkkenrulle eller lette visker til at absorbere overskydende fugt, og straks tilføje 400 µL ECL reagens til overfladen af hver membran for 3-5 min. Fjern overskydende ECL reagens ved kortvarigt blotting, men tillader ikke m embrane til helt tørt.
- Udsætte den skamplet, ved hjælp af en luminescence billedbehandlingssystem eller Autoradiografi film27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ifølge de oplysninger, som fabrikanten, standard mængden af E1 og E2 enzym i SUMOylation assay er 50 nM og 500 nM, henholdsvis. Den minimale mængde E2 de tråddannende enzymet Ubc9, som er i stand på SUMOylate p53 blev først fastsat ved en i vitro SUMOylation analyse. Så lavt som en femtedel af størrelsen af Ubc9 bruges i standard i vitro SUMOylation analyse protokol var i stand til effektivt SUMOylate p53 (fig. 1A). Derfor blev halvdelen af mængden E1 enzym i kombination med en tiendedel af beløbet af Ubc9 bruges i standard-protokol bruges til en anden i vitro SUMOylation analyse. En betydelig reduktion af SUMOylation effektivitet var observeret sammenlignet med standard protokollen (figur 1B).
Således, SUMO E3 ligase K-bZIP evne til at forbedre p53 SUMOylation blev bestemt ved hjælp af disse ændrede in vitro- SUMOylation betingelser. Tagged K-bZIP renset fra Sf9 celler (fig. 2A) var ansat i en SUMOylation reaktion med lavere mængder af E1 og E2 Ubc9 enzymer. Disse ændrede betingelser, K-bZIP effektivt kunne katalysere SUMOylation af p53 (figur 2B). Immunoblotting med anti-p53 antistof bekræftet de tilsvarende samlede beløb af p53 i hver reaktion, og også opdaget SUMO ændret p53.
Figur 1 : Bestemmelse af den minimale mængde af SUMO enzymer, der anvendes i in vitro- SUMOylation assay. (A) p53 SUMOylation blev evalueret i en in vitro- SUMOylation analyse, indgår en halv og en femte mængden af Ubc9 enzym bruges i standard-protokol. Efter 3 timer af in vitro- SUMOylation reaktion, SUMOylated p53 enzymer blev undersøgt af vestlige duppes med anti-p53 antistof. (B) In vitro SUMOylation af p53 blev yderligere analyseres ved hjælp af halvdelen af E1 enzym i kombination med en tiendedel mængden af Ubc9 bruges i standard-protokol. En vestlige skamplet blev udført som beskrevet i (A). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Styrkelse af p53 SUMOylation af SUMO E3 ligase K-bZIP. (A) renset udtryk for baculovirus K-bZIP protein, analyseret af SDS-PAGE efterfulgt med Coomassie blå farvning. 1 µg BSA og 10 µL renset K-bZIP lastning for sammenlignende protein mængde. (B) K-bZIP forbedret p53 SUMOylation blev evalueret ved hjælp af en in vitro- SUMOylation reaktion med halvdelen af E1 enzym og en tiendedel mængden af Ubc9 anbefale i standard-protokol. SUMOylated p53 blev undersøgt af vestlige skamplet, som beskrevet i figur 1A. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In vitro- SUMOylation protokollen beskrevet her bruges rutinemæssigt til at etablere SUMOylation status for identificerede Ubc9 substrater. Den største begrænsning ved hjælp af standard-protokol til at studere funktionen SUMOylation af SUMO E3 ligase er overfloden af aktivering af SUMO E1 og E2 de tråddannende enzymer Ubc9, at Maksimer SUMO konjugation i in vitro- systemer. I betragtning af denne udfordring mener vi titreringen af mængden af SUMO E1 og E2 enzymer til niveauet, at man knap kan registrere deres aktivitet i SUMOylation er den bare måde anvendelig hen til afgøre SUMO E3 ligase katalytisk aktiviteter ved hjælp af denne in vitro SUMOylation system. Efter denne hypotese, vi med held belyst E3 ligase aktivitet af K-bZIP og identificeret det som en roman SUMO E3 ligase med specificitet mod SUMO-2/3.
Den kritiske trin i protokollen er indarbejdelse af lavere mængder af E1 og E2. Ved hjælp af disse lavere beløb, som vist i figur 2, Roman SUMO E3 ligases med lav ligase aktivitet muligvis kunne identificeres med bevarelse af deres specificitet mod underlaget og SUMO paralogues. En stor begrænsning af teknikken er kravet om en høj kvalitet antistof anerkende SUMO substrat, da kun en meget lille andel af substratet kan være SUMO ændret.
Selvom mange proteiner viser potentiale til at øge SUMOylation efter overekspression i vivo, skal definere en SUMO E3 ligase påvises ved en rekonstitueret in vitro- SUMOylation system ved hjælp af renset E1, E2 og E3 enzymer. I modsætning til hundreder og måske tusinder af ubiquitin E3 ligases identificeret, indtil nu er kun et par SUMO E3 ligases blevet fundet. Dette kan skyldes delvis til brugen af de traditionelle standard i vitro SUMOylation analyse, som maksimerer SUMO konjugation effektivitet og dermed hæmmer funktionen SUMOylation af potentielle SUMO E3 ligases. Denne protokol beskriver en enkel og konsekvent og analyse for at sonde SUMOylation forstærket af en SUMO E3 ligase. Den beskrevne metode er afgørende for identifikation og karakterisering af roman SUMO E3 ligases.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne afslører ingen potentielle interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra ministeriet for videnskab og teknologi (de fleste, 105-2320-B-010-007-MY3 til PCC), fra National Health Research Institute (NHRI-EX105-10215BC til PCC), fra ministeriet for videnskab og teknologi (mest 105-2314-B-400-019 til HJK) og fra National Health Research Institute (NHRI MG-105-SP-10, NHRI MG-106-SP-10 til HJK). Dette arbejde blev også støttet dels med National Yang-Ming University på manuskriptet publikation til PCC. Finansieringskilderne spillede ingen rolle i undersøgelse design, dataindsamling og analyse, beslutningen om at offentliggøre eller erstatning af manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pFastBac | Invitrogen | 10359-016 | dual expression baculovirus vector |
| pCR2.1-TOPO vector | Invitrogen | PCR product vector | |
| competent cell E. coli DH5α | Yeastern Biotech | FYE678-80VL | competent E. coli cells A |
| E. coli DH10Bac | Invitrogen | 10359-016 | competent E. coli cells B |
| FugeneHD | Roche | 04709705001 | transfection reagent |
| Opti-MEM | Gibco | 31985062 | reduced serum media |
| T4 Ligase | NEW England BioLabs | M0202S | |
| CpoI (RsrII) | Thermo Scientific | ER0741 | |
| Bluo-gal | Thermo Scientific | B1690 | galactosidase substrate |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758-1G | |
| Grace’s Insect Medium | Gibco | 11605094 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10082147 | |
| Gentamicin | Thermo Fisher | 15750060 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393-25G | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | K0254-20ML | |
| gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| tetracyclin | Sigma-Aldrich | 87128-25G | |
| LB Broth | Merk | 1.10285.0500 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-100G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888-5KG | |
| KCl | Merk | 1.04936.1000 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S5136-500G | |
| KH2PO4 | J.T.Baker | 3246-01 | |
| sodium dodecyl sulfate | Merk | 1.13760.1000 | |
| β-mercaptoethanol | Bio-Rad | 161-0710 | |
| TRIS (Base) | J.T.Baker | 4109-06 | |
| Non-fat milk | Fonterra | ||
| glycerol | J.T.Baker | 2136-01 | |
| Triton X-100 | Amresco | 0694-1L | detergent A |
| Tween 20 | Amresco | 0777-500ML | detergent B |
| Poloxamer 188 solution | Sigma-Aldrich | P5556-100ML | detergent C |
| Protease Inhibitor Cocktail Tablet | Roche | 04 693 132 001 | |
| 3x Flag peptide | Sigma | F4799 | |
| anti-FLAG m2 Magnetic beads | Sigma-Aldrich | M8823 | antibody-tagged magnetic beads |
| SUMOlink SUMO-1 Kit | Active Motif | 40120 | standard SUMOylation protocol |
| SUMOlink SUMO-2/3 Kit | Active Motif | 40220 | standard SUMOylation protocol |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
| QIAGEN Plasmid Mini Kit | QIAGEN | 12123 | plasmid extraction kit |
| Polypropylene tubes | Falcon | 352059 | |
| Petri Dish | Falcon | 351029 | |
| Cell lifter | Corning | CNG3008 | |
| Loading tip | Sorenson BioScience | 28480 | |
| PVDF | PerkinElmer | NEF1002 | |
| Blotting filter paper | Bio-Rad | 1703932 | |
| Mini slab gel apparatus (Bio-Rad Mini Protean II Cell) | Bio-Rad | 1658001 EDU | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell | Bio-Rad | 1703940 | |
| Pierce ECL Western Blotting | Thermo | 32106 | ECL reagent |
| suspension mixer | Digisystem laboratory instruments Inc. | SM-3000 | |
| orbital shaker | Kansin instruments Co. | OS701 | |
| ImageQuant LAS 4000 biomolecular imager |
GE Healthcare | 28955810 | |
| Sf9 | Thermo Scientific | B82501 | |
| anti-p53 antibody | Cell Signaling | #9282 | |
| anti-rabbit antibody | GE Healthcare | NA934-1ML |
References
- Bies, J., Markus, J., Wolff, L. Covalent attachment of the SUMO-1 protein to the negative regulatory domain of the c-Myb transcription factor modifies its stability and transactivation capacity. J Biol Chem. 277 (11), 8999-9009 (2002).
- Lin, D. Y., et al. Role of SUMO-interacting motif in Daxx SUMO modification, subnuclear localization, and repression of sumoylated transcription factors. Mol Cell. 24 (3), 341-354 (2006).
- Welsh, M., Jamalpour, M., Zang, G., Akerblom, B. The role of the Src Homology-2 domain containing protein B (SHB) in beta cells. J Mol Endocrinol. 56 (1), 21-31 (2016).
- Huang, W. Q., et al. Structure, function, and pathogenesis of SHP2 in developmental disorders and tumorigenesis. Curr Cancer Drug Targets. 14 (6), 567-588 (2014).
- Perry, J. J., Tainer, J. A., Boddy, M. N. A SIM-ultaneous role for SUMO and ubiquitin. Trends Biochem Sci. 33 (5), 201-208 (2008).
- Sun, H., Leverson, J. D., Hunter, T. Conserved function of RNF4 family proteins in eukaryotes: targeting a ubiquitin ligase to SUMOylated proteins. EMBO J. 26 (18), 4102-4112 (2007).
- Ouyang, J., Shi, Y., Valin, A., Xuan, Y., Gill, G. Direct binding of CoREST1 to SUMO-2/3 contributes to gene-specific repression by the LSD1/CoREST1/HDAC complex. Mol Cell. 34 (2), 145-154 (2009).
- Lyst, M. J., Stancheva, I. A role for SUMO modification in transcriptional repression and activation. Biochem Soc Trans. 35, Pt 6 1389-1392 (2007).
- Liu, H. W., et al. Chromatin modification by SUMO-1 stimulates the promoters of translation machinery genes. Nucleic Acids Res. 40 (20), 10172-10186 (2012).
- Rosonina, E., Duncan, S. M., Manley, J. L. SUMO functions in constitutive transcription and during activation of inducible genes in yeast. Genes Dev. 24 (12), 1242-1252 (2010).
- Chang, P. C., et al. The chromatin modification by SUMO-2/3 but not SUMO-1 prevents the epigenetic activation of key immune-related genes during Kaposi's sarcoma associated herpesvirus reactivation. BMC Genomics. 14, 824 (2013).
- Neyret-Kahn, H., et al. Sumoylation at chromatin governs coordinated repression of a transcriptional program essential for cell growth and proliferation. Genome Res. 23 (10), 1563-1579 (2013).
- Tatham, M. H., et al. Polymeric chains of SUMO-2 and SUMO-3 are conjugated to protein substrates by SAE1/SAE2 and Ubc9. J Biol Chem. 276 (38), 35368-35374 (2001).
- Mattoscio, D., Segre, C. V., Chiocca, S. Viral manipulation of cellular protein conjugation pathways: The SUMO lesson. World J Virol. 2 (2), 79-90 (2013).
- Gareau, J. R., Lima, C. D. The SUMO pathway: emerging mechanisms that shape specificity, conjugation and recognition. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (12), 861-871 (2010).
- Bernier-Villamor, V., Sampson, D. A., Matunis, M. J., Lima, C. D. Structural basis for E2-mediated SUMO conjugation revealed by a complex between ubiquitin-conjugating enzyme Ubc9 and RanGAP1. Cell. 108 (3), 345-356 (2002).
- Knipscheer, P., et al. Ubc9 sumoylation regulates SUMO target discrimination. Mol Cell. 31 (3), 371-382 (2008).
- Vethantham, V., Manley, J. L. In vitro sumoylation of recombinant proteins and subsequent purification for use in enzymatic assays. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (1), 5121 (2009).
- Lin, S. F., Robinson, D. R., Miller, G., Kung, H. J. Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus encodes a bZIP protein with homology to BZLF1 of Epstein-Barr virus. J Virol. 73 (3), 1909-1917 (1999).
- Yang, W. S., Hsu, H. W., Campbell, M., Cheng, C. Y., Chang, P. C. K-bZIP Mediated SUMO-2/3 Specific Modification on the KSHV Genome Negatively Regulates Lytic Gene Expression and Viral Reactivation. PLoS Pathog. 11 (7), 1005051 (2015).
- Connor, C. D., Metcalf, E., Wrighton, C. J., Harris, T. J., Saunders, J. R. RsrII--a novel restriction endonuclease with a heptanucleotide recognition site. Nucleic Acids Res. 12 (17), 6701-6708 (1984).
- Helling, R. B., Goodman, H. M., Boyer, H. W. Analysis of endonuclease R-EcoRI fragments of DNA from lambdoid bacteriophages and other viruses by agarose-gel electrophoresis. J Virol. 14 (5), 1235-1244 (1974).
- Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D'Ari, R. Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth. J Bacteriol. 189 (23), 8746-8749 (2007).
- Gingold, E. B. Bacterial transformation. Methods Mol Biol. 2, 237-240 (1985).
- Brulois, K. F., et al. Construction and manipulation of a new Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus bacterial artificial chromosome clone. J Virol. 86 (18), 9708-9720 (2012).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Ahmed, S., Holt, M., Riedel, D., Jahn, R. Small-scale isolation of synaptic vesicles from mammalian brain. Nat Protoc. 8 (5), 998-1009 (2013).
