Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Isolatie en teelt van neurale progenitoren gevolgd door chromatine-Immunoprecipitation van Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark

Published: January 26, 2018 doi: 10.3791/56631
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1
1Institute for Anatomy and Cell Biology, Department of Molecular Embryology, Faculty of Medicine, University of Freiburg, 2Faculty of Biology, University of Freiburg

Summary

Presenteren we een effectieve en reproduceerbare methode om te isoleren en cultuur van neurale voorlopercellen van embryonale en postnatale hersenweefsel voor chromatine immunoprecipitation (ChIP) van Histon 3 lysine 79 dimethylation (H3K79me2) - een Histon mark gelegen binnen de bolvormige domein van Histon 3.

Abstract

Ontwikkeling van de hersenen is een complex proces, dat wordt gecontroleerd in een temporo-ruimtelijke wijze door gradiënten van morphogens en verschillende transcriptionele programma's. Epigenetische chromatine wijzigingen, zoals Histon methylering, hebben bovendien een belangrijke rol voor de totstandbrenging en het onderhoud van specifieke cel lot binnen dit proces. De overgrote meerderheid van Histon methylatie optreedt op de flexibele Histon staart, die toegankelijk is voor Histon modifiers, gummen en Histon lezer eiwitten. In tegenstelling, H3K79 methylation bevindt zich in het bolvormige gebied van Histon 3 en is betrokken bij verschillende ontwikkelings functies. H3K79 methylation is evolutionair bewaard en kan worden gevonden in een breed scala van soorten van Homo sapiens naar Saccharomyces cerevisiae. De wijziging treedt op in verschillende cel populaties binnen organismen, waaronder neurale progenitorcellen. De locatie van methylering van de H3K79 in het bolvormige domein van Histon 3 maakt het moeilijk in te schatten. Hier presenteren we methoden om te isoleren en cultuur corticale voorlopercellen cellen (CPC) van embryonale corticale hersenweefsel (E11.5-E14.5) of cerebellaire granulaire neuron progenitoren (CGNPs) van postnatale weefsel (P5-P7), en naar efficiënt immunoprecipitate H3K79me2 voor kwantitatieve PCR (qPCR) en sequentiebepaling van het genoom-brede.

Introduction

De sensorische, motorische en cognitieve functies van de hersenen zijn zeer complex en gevoelig voor fysieke en ecologische veranderingen. De hersenen bestaat uit drie algemene delen de hind-, midden-, en reukkolf, die diep met elkaar zijn verbonden. Binnen de reukkolf, kan de telencephalon worden onderverdeeld in een dorsale telencephalon (DT) en een ventrale telencephalon (VT). De DT van muizen bestaat uit zes corticale lagen die worden gevormd tussen E11.5 en E18.5 in een "binnenstebuiten" manier1. De VT bevat de ganglionaire eminenties in ontwikkeling, die later het vormen van de basale ganglia2,3. Verschillende soorten cellen kunnen worden ingedeeld in de zoogdieren centrale zenuwstelsel zoals neuronen, astrocyten, oligodendrocyten4, of die zich in een temporo-ruimtelijke wijze5 ontwikkelen. Ten eerste, de neurale voorlopercellen (NPC) aanleiding geven tot verschillende soorten neuronen, interneuronen in de VT en projectie neuronen in het DT, en later naar gliale cellen (bijvoorbeeld, astrocyten6). Tijdens de corticale ontwikkeling, de meest oppervlakkige laag (layer ik), die bevat Cajal-Retzius cellen, eerst wordt gevormd. Vervolgens, tussen E12.5 en E14.5, NPC's genereren diepere neuronale lagen (VI, V) terwijl tussen 14,5 en 16,5, progenitoren aanleiding geven tot7,8van de neuronen van de bovenste laag (IV-II). Neuronale identiteit is opgegeven door de verschillende morphogen-geïnduceerde temporo-ruimtelijke transcriptionele programma's, en daarnaast door epigenetische programma's2.

Het cerebellum, die is betrokken bij de coördinatie van de motor, is gelegen in de hindbrain en ontwikkelt tussen E10 en ongeveer P20 in muizen9. Het bevat de cerebellaire cortex en de cerebellaire kernen10. De volwassen cerebellaire cortex bestaat uit drie lagen, de buitenste laag van de moleculaire, het Purkinje cellaag en de binnenste granulaire laag met granulaire neuronen10. De cerebellaire submodule cellen zijn de kleinste neuronen en vertegenwoordigen ongeveer 80% van alle neuronen in de hersenen van de gewervelde11. Ze migreren door het Purkinje cellaag naar hun bestemming12en ontwikkelen van precursoren in de externe germinal zone bevindt. Zoals in de telencephalon, de ontwikkeling van het cerebellum wordt geregeld door verschillende belangrijke morphogens, die hebben specifieke tijd - en ruimte-afhankelijke functies en initiëren gedefinieerd transcriptionele programma's10.

De ontwikkeling van corticale en cerebellaire lagen wordt gecontroleerd door transcriptionele expressie van specifieke morphogens en, dus, door de staat van de chromatine van het DNA. In een vereenvoudigde weergave, kunnen chromatine-Staten worden onderverdeeld in euchromatine als transcriptionally actief en heterochromatin als transcriptionally stille gebieden. De nucleosoom als de basiseenheid van de chromatine bevat twee kopieën van elke kern Histon H2A, H2B, H3 en H4, omringd door 147 basenparen van DNA13. Histonen zijn zeer post-translationally gewijzigd door methylering, acetylation, fosforylatie, ubiquitination, sumoylation, ADP-ribosylation, deamination en proline isomerisatie14,15. Histon lysine methylering wordt beschouwd als de meest stabiele Histon wijziging die transcriptie, replicatie, recombinatie16, DNA-schade antwoord17en genomische inprenting18 besturingselementen. Lysines worden mono-, di- en tri-gemethyleerd19 en verschijnen niet alleen op de staarten toegankelijk Histon, maar ook binnen het bolvormige domein van histones20. Specifieke methyleringen op H3K4 en H3K36 worden vooral geassocieerd met euchromatine, specifieke methyleringen op H3K9, H3K27 of H4K20 zijn voornamelijk te vinden in de hétérochromatique regio's, hoewel alle residuen bevinden zich binnen de Histon staart14, 19,21. Methylation van H3K79 is bevindt zich in het bolvormige domein van Histon en geassocieerd met een transcriptionele activiteit, maar ook met transcriptionally inerte genomic regio22. De wijziging is evolutionair bewaard aangezien geconstateerd in gist, kalf zwezerik, kip en menselijke23. H3K79 mono-, di- en trimethylation (H3K79me1, me2, me3) worden gekatalyseerd door de Histon methyltransferases DOT1L24,25 en de nucleaire SET Domain-bevattende eiwitten 2 (Nsd2)26. DOT1L is betrokken bij de proliferatie, DNA-reparatie en mobiele reprograming27. Verlies van Dot1l in muizen leidt tot een prenatale dood rond de ontwikkelingsstadium E10.528,29. Tijdens de ontwikkeling van het hart en bij myocardiocyte differentiatie is DOT1L essentieel voor gen expressie verordening30. In het centrale zenuwstelsel, DOT1L functie kan worden betrokken bij de neurale buis ontwikkeling31, het is betrokken bij het onderdrukken van Tbr1-expressie tijdens reukkolf ontwikkeling32, en kan functioneren in de regulering van ER-stress reactie genen33. De context-afhankelijke activeren of de actie van de bestrijding van H3K79me, vooral met in vivo situaties zoals de ontwikkeling van het centrale zenuwstelsel, is tot nu toe slechts gedeeltelijk begrepen32. Aangezien H3K79 methylering zich in het bolvormige gebied van Histon 3 bevindt, is het sterically minder toegankelijk in vergelijking met wijzigingen op de flexibele Histon staarten23. Om te begrijpen van de functie van H3K79 methylering, zijn betrouwbare en reproduceerbare analysemethoden ter bepaling van de locatie en de genomische omgeving nodig. In deze paper methoden presenteren wij isolatie methoden van verschillende neurale progenitoren (CPC voor de cortex) en CGNPs voor het cerebellum, effectieve DOT1L remmer behandeling en een ChIP-methode voor het analyseren van methylation van H3K79 via qPCR of rangschikken op ander moment punten tijdens corticale en Cerebellaire ontwikkeling. Voor een overzicht van het protocol en de mogelijkheden, Zie Figuur 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dierenwelzijn commissies van de Universiteit van Freiburg en de plaatselijke instanties goedgekeurd alle dierproeven (G12/13, G16/11) vermeld in het volgende protocol.

1. voorbereiding

  1. Voorbereiding van de CPC's isolatie
    1. Instellen getimede paring om te verkrijgen van embryo's in de verschillende stadia van ontwikkeling van de cortex (tussen E11.5 en E14.5). Gebruik de muizen van de stam NMRI (Naval Medical Research Institute), die ten minste 8 oud weken. Na de paring, overwegen een positieve vaginale stekker aan E0.5.
    2. Als u genoeg materiaal, gebruikt u een nest van NMRI muizen voor een H3K79me2 ChIP van cortices van E12.5 of E14.5. Voor later embryonale stadia, gebruiken een nestje voor meer ChIP analyses (gemiddelde nest grootte NMRI: 10 embryo's).
    3. Precool Hank´s evenwichtig zout oplossing (HBSS) en -fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) tot 4 ° C (langetermijnopslag op RT).
    4. Equilibreer de 4 ° C opgeslagen trypsine-EDTA (0.05% w/v) tot 37 ° C.
    5. Voorbereiden corticale-cel medium (CCM): Het medium voor neuronen (Zie Tabel van materialen) aan te vullen met de eindconcentraties van 2% (v/v) B-27 supplement, 5 µg/mL Apo-transferrine 1 µg/mL glutathion, 0.5 mM L-glutamine, 0.8 µg/mL Superoxide dismutase en 1% (v/v) Penicilline-streptomycine-neomycine antibiotica mengsel. Bewaren bij 4 ° C. Voor het experiment equilibreer middellange tot 37 ° C.
    6. Foetaal kalfsserum (FCS), aliquoot ontdooien het (50 mL elk), en equilibreer één aliquot tot 37 ° C (langetermijnopslag bij-20 ° C).
    7. Voorbereiden op voorraden DNAse 1 (10 mg/mL) in H2O celkweek. Winkel aliquots bij-20 ° C.
    8. Indien nodig, los van de specifieke DOT1L-remmers EPZ-5676 of SGC0946 in DMSO een voorraad concentratie van 100 mM. De concentratie van een einde van 1-5 µM toepassen op de cellen op dag 0 en toepassen van de Inhibitor van de omwenteling om de twee dagen.
    9. Jas voor CPC-teelt, cel cultuur platen (6 goed of 12 goed) met poly-L-ornithine hydrobromide (1 mg/mL in 150 mM boorzuur pH 8.4) gedurende ten minste 1 uur op RT en daarna met laminin (1 mg/mL) in CCM medium bij 37 ° C's nachts.
  2. Preparaten voor CGNP isolatie
    1. Organiseer een passende paring van muizen voor het genereren van P5-P7 dieren voor het isoleren van het cerebellum (3-5 dieren per ChIP en conditie).
    2. Bereiden HBSS/Glucose door toevoeging van 6 mg/mL glucose aan HBSS buffer.
    3. Bereid de CGNP cel kweekmedium (CGM) door toevoeging van 1% (v/v) N2 supplement, 1% (v/v) penicilline-streptomycine-neomycine, 25 mM KCl en 10% FCS tot DMEM-F12. Voor CGNP teelt bereiden CGM medium zonder FCS maar met inbegrip van 0,6 µg/mL sonic hedgehog (SHH) (CGM-SHH) en equilibreer het tot 37 ° C wanneer nodig.
    4. Jas 6-well cel cultuur platen met 100 µg/mL poly-D-lysine voor 1-2 h op RT voor glia cellen verwijderen. Daarna wassen tweemaal met steriele ddH2O en laat de platen droog. Opslaan van de platen gedurende maximaal één week bij 4 ° C.
    5. Voor de teelt van CGNPs vacht 6-well cel cultuur platen met poly-L-ornithine (0,1 mg/mL) bij 4 ° C overnachting. Daarna wassen tweemaal met H2O voor celkweek en laat de platen droog.
      Opmerking: De platen kunnen worden opgeslagen voor maximaal een week bij 4 ° C.
    6. Bereiden van 0,025% trypsine (w/v) in HBSS/Glucose en equilibreer het tot 37 ° C wanneer nodig.
  3. Voorbereiding van de ChIP van H3K79me2
    1. PFA (1% in PBS, pH 8) vers bereiden voordat crosslinking chromatine. Om voor te bereiden Verwarm PFA 50 mL PBS in de magnetron tot maximaal 65 ° C. Voeg 0,5 mg PFA naar de PBS tijdens constant roeren. Voeg vervolgens toe 50 µL 10 M NaOH en wachten tot PFA wordt ontbonden. Daarna, voeg 42.5 µL HCl (37% v/v) om een pH van 8. Controleer de pH opnieuw en laat de 1% PFA oplossing bereiken RT.
    2. Voorraden voor te bereiden inzake RNase (1 mg/mL) en proteïnase K (20 µg/µL) afzonderlijk in steriele ddH2O. bewaren de aliquots bij-20 ° C.
    3. Voorbereiding van de volgende buffers en reagentia: PBS met 0,02% Tween, Lysis-buffermengsel, Glycine, verdunning buffer, ChIP buffer 1, ChIP buffer 2 ChIP buffer 3 en TE buffer en hen bewaren bij 4 ° C. Bereiden de elutie buffer vers telkens.
      1. Bereiden van PBS met 0,02% Tween. Wachten op de meeste één week bij 4 ° C.
      2. Lysis-buffermengsel met behulp van 50 mM Tris op pH 8,0, 10 mM EDTA, 1% (m/v) natrium dodecyl sulfaat (SDS) en 1 x proteaseinhibitor voor te bereiden.
      3. Bereiden van 2,5 M glycine.
      4. Bereiden verdunning buffer met 20 mM Tris op pH 8,0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% (v/v) Triton X-100, 0,25% (m/v) SDS en 1 x proteaseinhibitor.
      5. ChIP buffer 1 met behulp van 20 mM Tris op pH 8,0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% (v/v) Triton X-100, en 0.2% (m/v) SDS voorbereiden.
      6. ChIP buffer 2 met 20 mM Tris pH 8.0, 500 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% (v/v) Triton X-100, en 0.2% (m/v) SDS voorbereiden.
      7. ChIP-buffer 3 met 20 mM Tris pH 8.0, 250 mM LiCl, 2 mM EDTA, 1% (v/v) NP-40, en 1% (m/v) SDS voorbereiden.
      8. Voorbereiden TE buffer met behulp van 20 mM Tris pH 8,0 en 2 mM EDTA.
      9. Bereiden van verse elutie buffer met 1% (m/v) SDS, 100 mM NaHCO3.

2. neurale Progenitor isolatie van hersenweefsel

  1. Isolatie en optionele teelt van CPC 's
    1. De drachtige dieren door cervicale dislocatie euthanaseren en transfer van de embryo's naar ijskoude HBSS.
    2. Verwijderen van de schedel met een schaar en het isoleren van de hersenen, dan het verwijderen van de hersenvliezen, indien van toepassing, met kleine pincet en isoleren cortices (geheel, DT, of VT) van beide halfronden door het verwijderen van alle andere hersenen delen onder de binoculair scope met behulp van kleine pincet en, indien nodig, kleine schaar. Bewaar de geïsoleerde cortices in 5 mL HBSS buffer bij 4 ° C in een tube van 15 mL.
    3. Centrifugeer het geïsoleerde hersenen materiaal voor 5 min op 1000 x g- en 4 ° C.
    4. Wassen van de cortices met 5 mL ijskoud HBSS en meng ze met een 1 mL pipet tip door pipetteren omhoog en omlaag. Indien nodig, knip het uiteinde van de pipet-tip.
    5. Centrifugeer het gehomogeniseerde monster gedurende 5 minuten op 1000 x g- en 4 ° C. Verwijder de HBSS.
    6. Voeg 3 mL trypsine en Incubeer het monster gedurende 5 minuten bij 37 ° C.
    7. 1 mL FCS, 5 mL CCM en 30 µL van DNase 1 Voeg aan het monster en meng het monster met een 5 mL glazen pipet door pipetteren zorgvuldig op en neer.
    8. Centrifugeer de geïsoleerde cellen gedurende 5 minuten bij 1000 x g- en 4 ° C. Vloeistof wordt weggeworpen, voeg 5 mL CCM en meng het monster opnieuw.
    9. Verdun een aliquoot gedeelte van het monster en het rekenen met een Neubauer tellen-kamer. Een gemiddeld bedrag van 4,5 x 106 cellen per embryo wordt verwacht. Voor de teelt van het geïsoleerde CPCs gaat u verder met stap 2.1.10. Voor ChIP, onmiddellijk gaat u verder met stap 3.
    10. Voor teelt, plaat het CPCs poly-L-ornithine (0,1 mg/mL) en laminin (1 mg/mL) bekleed gerechten bij een dichtheid tussen de 8 x 104 en 2,5 x 105 cellen/cm2 in CCM medium en hen Incubeer bij 37 ° C, 5% CO2en 100% relatieve vochtigheid.
    11. Omdat het CPCs begint te onderscheiden in de neuronen in de cultuur van de cel (na ongeveer 4 dagen), overwegen de dissectie datum als dag in vitro 0 (dag 0). Voor langere termijnen van teelt, wijzigen de helft van het medium elke vierde dag met verse CCM medium.
    12. 1-5 µM van toepassing SGC0946 of EPZ5676 opgelost in DMSO op dag 0 (4-5 uur na de isolatie van de cel) en vernieuw het elke tweede dag. DMSO gebruiken als een controle behandeling. Het testen van de efficiëntie van de Inhibitor van de omwenteling behandeling via standaard immunoblot methoden, indien nodig.
  2. Isolatie en optionele teelt van CGNPs
    1. Euthanaseren P5-7 dieren door onthoofding met behulp van schaar. Verwijderen van de hoofdhuid huid, open de schedel en de hersenen met behulp van kleine schaar en pincet te verwijderen. Isoleren van het cerebellum en overbrengen naar de ijskoude HBSS/Glucose. Verwijder alle hersenvliezen en bloedvaten en breng de cerebella in 15 mL buizen gevuld met koude HBSS/Glucose.
    2. Wassen van de cerebella drie keer met 10 mL ijskoude HBSS/Glucose (verzamelen door centrifugeren bij 650 x g gedurende 5 min bij 4 ° C) en cerebella vervolgens Meng door zachtjes op en neer met een pipet 1 mL pipetteren (maximaal 2 - 3 keer) om 0,5-1 mm3 fragmenten.
    3. Voeg 5 mL van 0,025% trypsine in HBSS/Glucose en Incubeer het weefsel onder constant roeren in een waterbad 37 ° C gedurende 15 minuten Stop de spijsvertering door toevoeging van 5 mL van CGM en verzamelen van het weefsel door centrifugeren bij 650 x g gedurende 5 min bij 4 ° C.
    4. Verwijder het supernatant en triturate van het weefsel met een uiteinde van de pipet 1 mL in 1 mL CGM en overbrengen naar een nieuwe tube van 15 mL.
      Opmerking: Het is belangrijk te voorkomen dat luchtbellen.
      1. Voeg 5 mL CGM en Incubeer het mengsel gedurende 2 minuten op ijs te regelen de restanten van het weefsel. Breng de bovendrijvende substantie in een nieuwe tube van 15 mL. Voeg 2 mL CGM aan het resterende weefsel en herhaal de procedure verpulvering.
    5. De supernatants (zonder resten weefsel, ongeveer 10 mL in totaal) en centrifugeer bij 650 x g gedurende 5 min bij 4 ° C voor het verzamelen van de cerebellaire cellen. Resuspendeer de pellet in 10 mL CGM.
    6. Aangezien de astrocyten houden sneller en sterker aan poly-D-lysine dan CGNPs, plaat de cellen op 100 µg/mL poly-D-lysine gecoate 6-goed-platen (maximaal 4 mL per putje) en incubeer gedurende 20 minuten bij 37 ° C te verwijderen van de astrocyten.
    7. Schud de plaat en het verzamelen van de bovendrijvende substantie. Centrifugeer dan bij 650 x g gedurende 5 min bij 4 ° C in een tube van 15 mL. Resuspendeer de pellet in 10 mL CGM en cellen tellen met een Neubauer tellen kamer.
      Opmerking: CGNPs zijn ronde, klein, en tonen een halo wanneer beeld met fase contrast microscopie.
    8. Als vereiste, zaad cellen in 37 ° C opgewarmd vooraf CGM op poly-L-ornithine-gecoate platen (3 x 106 cellen per 6-well) en hen Incubeer bij 37 ° C, 5% CO2 en 100% relatieve vochtigheid.
      Opmerking: Als zaaien is niet uitgevoerd, gaat u verder met stap 3.1.
      1. Na 6-12 h, de middellange tot CGM-SHH uit te wisselen. Behandelen van de geïsoleerde CGNPs 6 h (of bij de overgang naar CGM-SHH) na isolatie met een DOT1L-remmer en DMSO besturen en vernieuwen elke tweede dag (vergelijk met 2.1.12). Het testen van de efficiëntie van de Inhibitor van de omwenteling behandeling via standaard immunoblot methoden indien nodig. Voor ChIP, gaat u verder met stap 3.3.
        Opmerking: CGM verlaten op de platen (en met die FBS) zal leiden tot differentiatie van de CGNPs in cerebellaire granulaire neuronen (CGNs).

3. fixatie van de cellen en het afknippen van de chromatine

Opmerking: Voer stap 3.1 en 3.2 als cellen worden niet gekweekt, als ze doorgaan naar stap 3.3.

  1. De cellen verzamelen door centrifugeren voor 4 min op 1000 x g en voeg 1.3 mL PBS. Het monster overbrengen in een 1,5 mL-buis. Centrifugeer gedurende 4 min bij 1.000 x g bij 4° C. Het wassen van het monster twee keer met 1.3 mL PBS.
  2. Kritieke stap: Voeg 350 µL 1% PFA aan het monster en het Incubeer gedurende 5 min bij 22 ° C. Om te stoppen met de reactie, 18.4 µL glycine en 1 mL PBS toevoegen. Centrifugeer het monster gedurende 5 minuten bij 1.000 x g bij 4 ° C.
    1. Het wassen van het monster twee keer met ijskoude PBS. De vaste cellen verzamelen door centrifugeren voor 5 min op 1000 x g- en 4 ° C. Houd de monsters op ijs van nu af aan.
      Opmerking: De tijd van de fixatie moet precies 5 min om optimale resultaten te krijgen. Verschillende cel nummers kan tijd aanpassing nodig is.
  3. Kritieke stap: Aan gekweekte CGNPs (of CPC), tot 1 mL toevoegen 1% PFA rechtstreeks naar de cel cultuur plaat putten. Na een 5 minuten incubatie bij 22 ° C, voeg een passend bedrag van glycine en PBS en oogsten van de cellen met een cel schraper.
    1. Breng de cellen in 1,5 mL buizen en Centrifugeer het monster gedurende 5 minuten op 1000 x g- en 4 ° C. Het wassen van het monster twee keer met ijskoude PBS. De vaste cellen verzamelen door centrifugeren voor 5 minat 1000 x g bij 4 ° C. Houd de monsters op ijs van nu af aan.
  4. Kritieke stap: Voeg 700 µL van lysis-buffermengsel (+ proteaseinhibitor) en Incubeer het monster gedurende 15 minuten staan bij 4 ° C. Vortex het monster elke 5 min. schuintrekken de chromatine van de lysed cellen 3 x 10 min in het ultrasoonapparaat (30 s puls, 30 s pauze) bij maximumvermogen.
    1. Zorg ervoor dat het volume niet meer dan 350 µL per buis. Vortex de monsters elke 10 min. controleren de lysate voor resterende kernen met een Microscoop fase contrast.
      Opmerking: Het is belangrijk om optimale schuintrekken resultaten (in vergelijking met figuur 1B) voor latere analyse. Optimaliseer de schuintrekken naar fragmenten van de chromatine formaat tussen 200-500 bp in geval van met behulp van andere methoden voor het scheren van de chromatine.
  5. Pellet cel restanten voor 10 min, 13.000 x g, 4 ° C. Gebruik het supernatant voor de preclearing stap 5.2. Bevriezen van het monster bij-20 ° C voor later gebruik, indien nodig.

4. voorbereiding van de kralen en Preclearing

  1. Wassen van 45 µL EiwitA magnetische kralen/ChIP en 20 µL magnetische kralen/monster met 1 mL ijskoud PBS met 0,02% Tween driemaal een magnetische standaard gebruiken. Dan, voeg 1 mL ijskoud PBS aan de kralen.
  2. Voeg 1 mL ijskoud PBS en 45 µL kralen/ChIP, 3 µg antilichaam/ChIP (H3K79me2 of konijn IgG). Incubeer de monsters gedurende 2 uur bij 4 ° C op een rotator te binden de antilichamen aan de kralen. Afhankelijk van het antilichaam, ~ 3 µg antilichaam/spaander te gebruiken.
  3. Spoel de antilichaam-gebonden-kralen driemaal met 1 mL ijskoud PBS met 0,02% Tween. Het volume van de passende kraal (vanaf volume van magnetische kralen gebruikt) van de ijskoude PBS aan de gewassen antilichaam-combinatie-kralen toevoegen.
  4. 600 µL van verdunning buffer en 20 µL van gewassen magnetische kralen Voeg aan het monster voor de preclearing (totale volume 1.320 µL) en incubeer gedurende 2 uur bij 4 ° C op een rotator. Verwijder de parels een magnetische standaard gebruiken. 5% (33 µL) van de lysates als input monsters nemen en bevriezen ze bij-20 ° C.

5. chromatine Immunoprecipitation

  1. Het precleared extract verdelen in twee buizen (ongeveer 643.5 µL), voeg een gelijk volume verdunning buffer en de antilichaam-gebonden-beads (45 µL/monster; H3K79me2 of konijn IgG). Incubeer de monsters bij 4 ° C's nachts op een rotator.
  2. Het wassen van de kralen met ijskoude ChIP buffer 1, ChIP buffer 2 en ChIP buffer 3 voor elke 10 min bij 4 ° C op een rotator. Spoel daarna driemaal met TE buffer voor 5 min bij 4 ° C op een rotator.
  3. Elueer de kralen met elutie buffer gedurende 1 uur bij 1400 t/min in een shaker bij kamertemperatuur.
  4. 10 µg RNase (1 mg/mL) per ChIP monster en 5 µg toevoegen aan de input monsters en Incubeer de monsters gedurende 30 minuten bij 37 ° C (1400 rpm).
  5. Toevoegen van 100 µg proteïnase K (20 µg/µL) per ChIP monster en 50 µg per ingang en na een nacht bebroeden bij 65 ° C bij 1400 t/min.

6. zuivering van ChIP monsters

  1. Zuiveren van de ChIP en de input monsters met een DNA-zuivering kit (Zie Tabel van materialen) volgens de handleiding. Kolomsgewijs meer zuivering wanneer meer dan 5 µg van DNA wordt verwacht. Elueer de steekproef met 2 x 15 µL van de DNA elutie buffer geleverd in de kit.
  2. Kwantificering van de monsters (gebruik 1 µL) uitvoeren met behulp van een visualiseren fluorophore en een fluorospectrometer (Zie Tabel van materialen).

7. de analyse van monsters van de ChIP via qPCR

  1. Ophalen voor primer design for qPCR analyse, genomic opeenvolgingen van belang van de integratieve Genomics Viewer (IGV) browser34. Inleidingen rond de transcriptionele start site (TSS) van een gen, ontwerpen, want H3K79me2 is waarschijnlijk gelegen om daar te zijn. Een besturingselement, kunt u overwegen niet-coderende genomic regio's of regio's ongeveer 10 Kb stroomopwaarts van de TSS of 10 Kb stroomafwaarts van het transcriptionele einde site (TES).
    1. Genereren van de inleidingen met https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ met behulp van voorinstelling voor de grootte van een product tussen 70 en 200 bp en een optimale temperatuur van 60 ° C. Voor de doeleinden van het proces, door inleidingen voor de genomic regio's Aft4, Ddit3, Scd1, Aft3, en Npm1 vermeld in tabel 1te gebruiken.
  2. Testen van nieuw ontworpen inleidingen met het volgende programma van de qPCR, master mix en een onthardende temperatuur verloop tussen 58 ° C en 63 ° C, en selecteer de onthardende temperatuur met de hoogste product kwantiteit en kwaliteit.
    1. Elektroforese van het gel van DNA om te bepalen van de grootte van de verwachte product van toepassing. P.a. van qPCR, het gebruik van een Real-Time PCR detectiesysteem (Zie Tabel van materialen).
    2. Voorbereiding van de master mix met 10 µL polymerase van DNA master mix, 0,5 µL primer naar voren (10 µM), 0,5 µL primer omgekeerde (10 µM), 4 µL nuclease-gratis water en 5 µL DNA (1 ng/µL).
    3. Gebruik een programma 2-step qPCR als volgt: 5 min bij 95 ° C, 50 x (30 bij 95 ° C, 30 s s bij 58 ° C - 63 ° C), en denaturatie verloop voortdurend bij 4 ° C.
  3. Maken van een verdunningsreeks van genomic, sheared, gezuiverde DNA-monsters (2 ng/µL, 1 ng/µL, 0,5 ng/µL, 0,25 ng/µL en 0,125 ng/µL) en gebruiken 5 µL voor een test van de efficiëntie met behulp van qPCR. Bepaal de helling van de standaard curve en de efficiëntie van de primer berekenen door de volgende formule:
    Rendement (%) = (10-^(-1/slope)-1) * 100.
    1. Inleidingen gebruiken met efficiëntie tussen 90 en 105% in een ideaal geval, of ten minste met efficiëntie tussen 85% en 115%.
  4. Om de ChIP- en input monsters te analyseren, 0,1-1 toepast ng van ChIP DNA gemengd met respectieve forward en reverse primer, nuclease-gratis water en meester van de polymerase van DNA mengen in een eindvolume van 20 µL voor elke reactie qPCR.
  5. Bepalen van de drempelwaarden van de cyclus (Ct) van ChIP en input monsters en normaliseren van het monster, Ct tot Ct -waarden van input voor het berekenen van verrijking (% input) met de volgende formule. Gebruik Ct waarden, verkregen uit IgG controle om te bepalen van het achtergrondniveau.
    % input = 100-2^(norm. input − norm. ChIP)
    norm. invoer = Ct (input) − log2(verdunningsfactor)
    norm. ChIP = Ct (ChIP) − log2(verdunningsfactor)
    Opmerking: norm. = genormaliseerde

8. analyse van ChIP monsters via Sequencing

  1. De ChIP monsters (input en immunoprecipitated DNA-monster) overbrengen in een volgorde faciliteit.
  2. Ter voorbereiding van een bibliotheek vooraf, gebruik een passende bibliotheek voorbereiding kit (Zie Tabel van materialen) en converteren van 2 ng van de input DNA en alles van het DNA van de immunoprecipitated in geïndexeerde bibliotheken voor de volgende generatie multiplex rangschikken op de aangegeven platform (Zie Tabel van materialen).
  3. Kritieke stap: Volg de instructies van de kit, afbinden sequencing adapters (met een concentratie van de werken van 15 µM) ter afsluiting van de gerepareerde en dA-tailed DNA-fragmenten. Voor sequencing adapters en PCR gebruikt inleidingen passende oligos (Zie Tabel van materialen). Gebruik voor deze hoeveelheid input DNA, 6-9 PCR cycli te verrijken adapter afgebonden DNA-fragmenten.
    Opmerking: Het is normaal gesproken niet nodig voor het uitvoeren van een selectie van de grootte van de adapter afgebonden DNA. Het is het beste om te gebruiken, zo weinig cycli van PCR mogelijk, aangezien veel resultaat van de cycli van PCR versterking in PCR duplicaten en een hoge GC bias.
  4. Nemen voor een definitieve bibliotheek check, 0,5 µL van de totale reactie p.a. te visualiseren grootteverdeling op een geschikte inrichting (Zie Tabel van materialen). Kwantificering, gebruiken een visualiseren kleurstof in combinatie met een fluorospectrometer of andere methoden (Zie Tabel van materialen).
  5. Aangezien H3K79me2 lijkt te worden van een wijziging van Histon, die in grote lijnen grotere regio genomic's is gespreid, volgorde van de monsters gekoppeld-einde met een lees lengte van 50 bp en met een diepte van de sequencing van 75 Mio leest.
  6. Het analyseren van de gegevens van de ChIP-seq met de Galaxy/Uni Freiburg Server (galaxy.uni-freiburg.de).
  7. Uitvoeren van kwaliteitscontrole met verkregen ChIPseq met FastQC en, in voorkomend geval, kaart hen rechtstreeks met Bowtie2 versie 2.2.035 met of zonder trimmen. Als referentie gebruiken genoom vergadering mm9 of de nieuwste versie mm10; en als referentie aantekening Ensembl FTP laat 79.
  8. Optioneel: Verwijder duplicaten met behulp van Picard MarkDuplicates (http://broadinstitute.github.io/picard) alvorens leest piek roeping.
  9. Bel pieken met MACS2 versie 2.1.036 met behulp van de "globale" optie voor H3K79me2.
  10. Voor het verkrijgen van een logboek2 verhouding tussen ChIP en input monster, de log-2 van het aantal leesbewerkingen van de luidt gebruiken de verhouding van beide monsters BamCoverage en BamCompare.
  11. Voor alle andere ChIP-seq specifieke diepteanalyse, gelden deepTools2 versie 2.3.5 of 2.4.137, dat wil zeggen dekking track om dossiers te produceren (bamCoverage voor de ChIP alleen, bamCompare voor vergelijking van ChIP aan op de ingang), voor het inschatten van de ChIP prestaties gebruiken plotFingerprint en voor het genereren van een algemeen overzicht computeMatrix, plotHeatmap. K-gemiddelde clustering tijdens het computeMatrix aan de genomic regio's volgens de H3K79me2 verdeling cluster selecteren
  12. Gebruik gepubliceerde ChIP-seq gegevens als H3K79me2 van E14.5 DT gedeponeerd bij NCBI voor verhoor doeleinden (toetreding nummer: SRP057733).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Opzet van neurale voorlopercellen isolatie, teelt, H3K79me2 ChIP en ChIP analysemethoden: Figuur 1 toont een stroomdiagram voor het uitvoeren van H3K79me2 ChIP van corticale voorlopercellen op verschillende tijdstippen tijdens de embryonale hersenontwikkeling of cerebellaire granulaire neuron progenitoren in postnatale stadia. Als een eerste stap, de hersenen moet worden geïsoleerd en de telencephalon (tussen E11.5 en E14.5) of het cerebellum (P5-P7) moet worden opgehaald. Het is mogelijk om het analyseren van de verschillende regio's van de telencephalon door het onder te verdelen in de DT en VT. Daarna het weefsel zal worden gehomogeniseerd en de neurale progenitoren gescheiden. Nu, is het mogelijk om de cultuur van de voorlopercellen en behandel hen met DOT1L-remmers. Een andere mogelijkheid is vast van de progenitoren rechtstreeks te onderwerpen aan de ChIP-procedure. Voor ChIP, worden de chromatine geschoren in fragmenten van 200-500 bp en vervolgens geïncubeerd met magnetische-kralen-coupled antilichaam tegen H3K79me2. Na het wassen van de kralen en ophalen van het DNA, kan de geprecipiteerde DNA worden geanalyseerd door sequentiebepaling of door qPCR (figuur 1A). Het is essentieel om een goede grootteverdeling van de chromatine fragmenten na het scheren, dus het is raadzaam om te controleren van de grootte van het fragment met de Elektroforese van het gel van DNA of met andere methoden (voorbeelden in figuur 1B). Bij het kiezen van genoom-brede sequencing, zal ChIP-seq-leest voor H3K79me2 bezetting worden verstrekt als een fastq-bestand voor verdere analyse (Figuur 1 c). De kwaliteit van de volgorde leest moet worden beoordeeld door toepassing van FastQC en, indien nodig, de fastq-bestanden u kunt knippen met behulp van TrimGalore. Toewijzing aan de Mus musculus genoom mm9 of mm10 kan worden uitgevoerd met Bowtie2 en gecontroleerd via PlotFingerprint. Het is raadzaam voor het verwijderen van duplicaten met MarkDuplicates en normaliseren van de leest door BamCoverage en vergelijken van de ChIP aan de input samples met BamCompare. De ChIP-seq leest kunnen vervolgens gevisualiseerde genoom breed in heatmaps of gene-wise in integratieve Genomics Viewer (IGV) browser zittingen.

CPC cultuur en inhibitie van de DOT1L: CPC's werden geïsoleerd en behandeld met 5 µM DOT1L remmer SGC0946 op dag 0 en dag 2. Het oplosmiddel DMSO werd gebruikt als een besturingselement. Op dag 3, CPCs zijn geoogst, de eiwitten werden geïsoleerd, gekwantificeerd en geanalyseerd via immunoblot (figuur 2A). Figuur 2A toont aan dat H3K79me2 niveaus effectief zijn gedaald na drie dagen van CPC kweken en inhibitie van de DOT1L zorgen voor een effectieve remmer behandelingsschema. De eiwit hoeveelheid H3, GAPDH of tubuline-alpha bijeenkomen laden besturingselementen was daardoor niet aangetast. Immunokleuring van vaste CPCs met antilichamen tegen actieve caspase-3 (CASP3 +) voor het opsporen van apoptosis en HuC/D voor het visualiseren van neuronale cellen aangegeven dat behandeling van CPC's met DOT1L-remmer leidde tot toegenomen celdood na drie dagen in cultuur, zoals in figuur 2B. Kwantificering van de cellen die CASP3 zijn +/ DAPI + of HuC/D +/ DAPI + binnen de CPC cultuur bleek een aanzienlijke stijging van CASP3 + cellen onthullen geprogrammeerde celdood op remming van de DOT1L. Het aantal HuC/D-positieve neuronen, bleef echter onveranderd (figuur 2C).

H3K79me2 ChIP-qPCR van Aft4, Ddit3, Scd1, Aft3, en Npm1 van het CPCs behandeld met DOT1L-remmer: om te testen of de SGC0946-remmer behandelingvan DOT1L efficiënt en heeft geleid tot een vermindering van de H3K79me2 op specifieke was genen, wij uitgevoerd een ChIP analyse gevolgd door qPCR van CPC behandeld voor 3 dagen. Konijn IgG werd gebruikt als een ChIP-besturingselement. Aangezien het is bekend dat H3K79me2 gelegen aan de endoplasmatic stress-responsieve genen Aft4, Aft3 , Ddit3en Scd1, alsmede bij het vervoer van nucleaire gen Npm133,38 is, we gebruikten qPCR inleidingen die betrekking hebben op de TSS TES en genomische regio's binnen de gene organen om te bepalen van verschillen in verdeling van de H3K79me2 na DOT1L inhibitie (figuur 3A). Genen met een hoge H3K79me2 daling in de eerste plaats, zoals Atf4, Ddit3, en Npm1 waren meest ontvankelijk voor de behandeling van de Inhibitor van de omwenteling, zodat de drie dagen van de remming van DOT1L geleid tot een aanzienlijke van de H3K79me2. Genen met een lagere dekking van de H3K79me2, zoals Atf3 en Scd1, toonde geen significante verandering in H3K79me2 niveaus.

Overzicht van H3K79me2 ChIP-seq analyse: Genoom-brede analyse van de niveaus van de H3K79me2 in het CPCs uit E14.5, uitgevoerd en geanalyseerd volgens de voorgestelde regelingen en protocollen (Figuur 1), bleek een zeer hoge kwaliteit ChIP. Overwegende dat de binned graven, gerangschikt volgens hun frequentie van de input leest in de vingerafdruk vlek (figuur 4A), werden gelijkmatig verdeeld, de graven van de H3K79me2 toonde verrijking op specifieke regio's (opslaglocaties gerangschikt met 1), die succesvol toont accumulatie van chromatine fragmenten bewerkt om H3K79. Een heatmap van H3K79me2 langs genen tussen hun TSS en hun TES en +/-10Kb stroomopwaarts of stroomafwaarts toont (figuur 4B) die pieken van de H3K79me2 rond de TSS en daalde naar de TES in het algemeen. Er zijn genen, die volledig zijn bedekt met H3K79me2, en genen, die hebben een piek alleen binnen de regio van TSS. Endoplasmatic-stress gerelateerde genen zoals Atf4, Ddit3, en de nucleophosmin Npm1 haven, bijvoorbeeld, een hoog niveau van H3K79me2 aan de TSS, die is slechts licht gedaald langs het hele gen lichaam (figuur 4C). Daarentegen heeft de Scd1 een lage bezetting van de H3K79me2 op de TSS en geen H3K79me2 binnen het lichaam gen. Atf3 als een laatste voorbeeld heeft verschillende scherp en lage niveau H3K79me2 toppen langs het gen-lichaam.

Figure 1
Figuur 1: schema van H3K79me2 ChIP protocol van geïsoleerde CPCs of CGNPs en een stroomdiagram van sequencing analyse. (A) overzicht van gepresenteerde protocol. Voor CPC-isolatie, eerste E14.5 hersenen worden geisoleerd en de cortices kunnen worden onderverdeeld in DT en VT, indien nodig. Voor CGNPs moeten cerebelli P5-P7 muizen worden opgehaald. Het weefsel zal worden gehomogeniseerd, de progenitoren gescheiden en vervolgens de cellen kunnen worden gekweekt en behandeld met een passende remmer of direct gebruikt voor ChIP. Voor ChIP, is fixatie van de chromatine gevolgd door scheren en immunoprecipitation met een anti-H3K79me2 antistof en konijn IgG als besturingselement. Na de zuivering van DNA, ChIP monsters kunnen worden geanalyseerd via bibliotheek voorbereiding en sequencing of kunnen worden geanalyseerd via qPCR. (B) voorbeelden van geschikte en ongeschikte kwaliteit chromatine. De verdeling van DNA fragment wordt getoond in bp. (C) ChIP-seq resultaten kunnen worden onderworpen aan een analyse-pijpleiding op de Freiburg/Galaxy-server. Na een kwaliteitscontrole (FastQC), kunnen leest worden bijgesneden met TrimGalore en vervolgens toegewezen via Bowtie2 aan het genoom van de muis (in de gepresenteerde gevallen mm9). PlotFingerprint evalueert de kwaliteit van de ChIP. Als u wilt definiëren pieken voor H3K79me2, kan MACSpeaks worden toegepast. Voor normalisatie BamCoverage en voor vergelijking met de input BamCompare zijn bruikbaar. Om te visualiseren van de resultaten van de IGV zijn browser en heatmaps geschikt. Verwachte bestandsindelingen zijn cursief weergegeven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: corticale voorlopercellen cultuur en DOT1L inhibitie. (A) Immunoblots H3K79me2 niveaus in CPC op E14.5 tonen na de remming van de DOT1L voor 3 dagen (dag 3, n = 3-11) in vergelijking met de controle van DMSO. H3, GAPDH en tubuline alpha werden gebruikt als het laden van besturingselementen. (B) Immunocytological kleuring van een CPC-cultuur dagen 2 en 3. Caspase-3 (CASP3 groen) geactiveerd-positieve cellen en neuronen (HuC/D: rood) werden gekleurd. DAPI (blauw) werd gebruikt voor het visualiseren van de celkernen. Schaal bar: 100 µm. (C) kwantificering van de immunostainings gepresenteerd in (B). De verhouding tussen positieve cellen voor CASP3 +/ DAPI + of HuC/D +/ DAPI + in procenten wordt gegeven. Voor statistische analyse, werden ongepaarde Student t-tests uitgevoerd. p < 0.01 **. Dit cijfer werd vanaf Roidl et al. gewijzigd 33 , 38 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: H3K79me2 ChIP-qPCR van Aft4, Ddit3, Aft3, Scd1, en Npm1 van het CPCs behandeld met DOT1L-remmer. (A) E14.5-afgeleide CPCs werden behandeld met 5 µM DOT1L remmer 4-5 h na isolatie en voor een tweede keer op dag 2 in cultuur. CPC's werden vastgesteld op dag 3, die werd gevolgd door chromatine extractie, ChIP experiment en qPCR. Resultaten worden weergegeven als de gemiddelde (+/-SEM) % input (n = 3). IgG werd gebruikt als een negatieve controle. Het gemiddelde van de IgG-niveau wordt afgebeeld als de stippellijn. Voor statistische analyse, werd two-way ANOVA toegepast. p < 005 *; p < 0.01 **, p < 0.001 ***; TSS transcriptionele start site, TES transcriptionele einde site. Dit cijfer werd vanaf Roidl et al. gewijzigd 33 , 38 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: overzicht van H3K79me2 ChIP-seq analyse. (A) de vingerafdruk van H3K79me2 ChIP-seq uit E14.5 afkomstige CPCs vergeleken met ingang toont een verrijking van DNA-fragmenten voor H3K79me2 zorgen voor een hoge kwaliteit van de ChIP-seq. (B) H3K79me2 ChIP-seq resultaten die zijn uitgezet in een heatmap. Sterk verrijkt genomic regio's worden gepresenteerd in het blauw. Schaal van 0 (donkerrood) - 45 (donkerblauw). H3K79me2 in de buurt van het TSS pieken en daalt in de TES 3´ richting. (C) H3K79me2 ChIP-seq leest waren toegewezen aan het genoom mm9 en gevisualiseerd met de integratieve genoom viewer (IGV). De bezetting van de H3K79me2 van een gen wordt weergegeven als log2 van het aantal leest verhouding tussen ChIP en input leest per kilobase per miljoen (schaal: -10 tot en met 10). Refseq gen structuur is vertegenwoordigd, terwijl een rood vak geeft de eerste exon met inbegrip van de TSS. De genen Aft4, Ddit3, Scd1, Aft3, en Npm1 worden weergegeven. Ter vergelijking, wordt een signaal van de H3K4me3 van dezelfde genomic regio weergegeven. TSS transcriptionele start site, TES transcriptionele einde site. Dit cijfer werd vanaf Roidl38gewijzigd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Gen Regio Primer toekomen 5' - 3' Primer reverse-5' - 3'
Aft4 TSS GGACGATCTCTAACGCCACA GCCCTAAACCCGCCCTTTAT
Aft4 TSS + 1500 CTCCCGAATATGACATGAACCG TCCATTCGAAACAGAGCATCG
Aft4 TES CCGTAATAGGGTAGTCAGGTGC AAAGAATGACACTGAAAACCCACA
Ddit3 TSS GTACTGGCTCCGTCTAACCC CAAGAGAGGGCCTGTAAGCA
Ddit3 TSS + 2500 TCAAGCAGCCGGTCTCATAG CTCAGATCCCCCAATGGCTT
Ddit3 TSS + 4500 GAGCTGGAAGCCTGGTATGA TCACCTCTTCGTTTCCTGGG
Ddit3 TES CACCAAGCATGAACAGTGGG GTACCGTCTATGTGCAAGCC
Aft3 TSS AACTGAGAGCGCAACTCCTC GCTGCCGTTCTTAGCTGGTA
Aft3 TES CTGTTGGCACAAAGTGGCTC GGGATCTGCCATGGTGGAAA
Scd1 TSS TAGTGACCACACACAAAAGCTC CCCAAGTGTAATTTGGATGATTTCC
Npm1 TSS TCCCCCTCCAGTCAGTTACC CGTCCTTTCCTTGGCGTGA
Npm1 TES AGGGACATACTTAAGACAAGCCAG AGGATTGAGGCAGACTGTCAAT
TSS: transcriptionele start site
TES: transcriptionele einde site

Tabel 1: Lijst van inleidingen voor ChIP-qPCR gebruikt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Er zijn twee belangrijke manieren voor het uitvoeren van de chromatine immunoprecipitation om te ontdekken de genomic bezetting van Histon modificaties, transcriptiefactoren, histone code lezers, schrijvers of gummen. Een is de inheemse ChIP methode met behulp van de nuclease verteerd, inheemse chromatine voor immunoprecipitation, en anderzijds de onderhavige methode met PFA-vaste, sheared chromatine, waarin de nucleosomes en andere DNA-ingeschrevenen eiwitten wijze aan het DNA covalente 39. native ChIP met haar hoge antilichaam opsporingstarief moet gelden voor Histon methylering sinds de chromatine en Histon methyleringen zijn relatief stabiel gedurende de ChIP. Maar aangezien een grote hoeveelheid grondstof nodig is, het is niet van toepassing voor het bestuderen van de corticale of Cerebellaire ontwikkeling, waar het aantal cellen uit de hersenen van de muis is meestal beperkt. Hoewel de antilichamen zijn over het algemeen tegen niet-vaste materiaal aan de orde gesteld, kunnen we bewijzen dat het antilichaam specifiek H3K79me2 sinds specifieke remming van DOT1L leidt tot een verminderde H3K79me2 signaal in ChIP-qPCR analyse en immunoblots (figuur 2A detecteert en figuur 3A). ChIP met kruislings gekoppelde materiaal zou inefficiënt, maar het voorgestelde protocol zorgt voor genoeg speciaal verrijkt materiaal voor qPCR en sequentie-analyse.

Voor een effectieve ChIP kunnen de SDS-concentratie van de lysis-buffermengsel cruciaal, want SDS eiwitten denatureert en ze toegankelijk voor antilichaam-bindende maakt. Deze functie is met name belangrijk voor H3K79me2, die een wijziging van de Histon gelegen binnen het bolvormige gebied van Histon 3 en binnen de nucleosoom kern van chromatine de kleinste eenheid22. Dus, voor H3K79me2, een hogere concentratie van de SDS (ongeveer 0,3% w/v) tijdens de test is die nodig zijn om optimale antigène toegankelijkheid. Met deze SDS concentratie, kunnen we zeer H3K79me2 verrijken over IgG besturingselementen (Figuur 3) en ingang (Figuur 4). Dus, de kwaliteit van de ChIP-materiaal voor het rangschikken passend was en de verrijking over input vergelijkbaar met die van H3K4me3 (Figuur 4). Wij verwachten dat het dezelfde concentratie van de SDS nodig zou zijn voor de ChIP van de mono- of trimethylation merk H3K79. In het algemeen, de strengere de ChIP buffer is het minder vals-positieve chromatine fragmenten zijn immunoprecipitated, als de kwaliteit van het antilichaam wordt niet beïnvloed door het wasmiddel gebruikt. Voor de toekomst, is het wellicht mogelijk toe te passen van het voorgestelde protocol tot andere histone modificaties binnen het bolvormige domein van histones.

Als de antilichamen geschikt voor ChIP zijn en stabiel bij hogere concentraties van wasmiddel zijn, bevat het protocol hoofdzakelijk twee kritische stappen. Ten eerste, de fixatie van de cellen en de daaropvolgende afknippen van de chromatine moeten worden geoptimaliseerd voor elk celtype en elke ultrasonicator. Langdurige dwarsbinding leidt tot fixatie artefacten en kan verminderen de opsporingstarief antilichaam aangezien antigenen kunnen worden gemaskeerd. De chromatine schuintrekken moest leiden een grootteverdeling van het DNA tussen 200 en 500 bp (figuur 1B). Nucleosomes bevatten 147 bp van DNA. Chromatine fragmenten die te lang zal leiden tot vals-positieve resultaten in de qPCRs. Tijdens genoom-brede sequencing, zal een onjuiste grootteverdeling leiden tot vals-negatieve resultaten, omdat vaak alleen kleine fragmenten worden beschouwd. De tweede cruciale stap is de voorbereiding van de bibliotheek voor het genoom-brede rangschikken. Een DNA-amplificatie stap hoeft te worden uitgevoerd met behulp van 6-9 PCR-cycli. Vermijden van talrijke cycli van PCR is essentieel, omdat ze tot een hoge GC bias en vele PCR duplicaten leiden kunnen. Met het voorgestelde protocol, kan genoeg DNA worden opgehaald het aantal nodige cycli van PCR om laag te houden.

Hersenweefsel bestaat uit een zeer divers hoeveelheid celtypes zoals neuronen, oligodendrocyten en glia cellen4. Tijdens de ontwikkeling van deze cellen ontlenen van neurale stamcellen en bouwen van specifieke gebieden in de hersenen in een tijd - en locatie-afhankelijke manier3. Neurogenese van de hersenschors, bijvoorbeeld plaatsvindt tussen E11.5 en E18.5 in muizen. In eerdere stadia zoals E11.5 en E12.5 hebben bijna alle cellen voorlopercellen identiteit1, maar later cellulaire diversiteit moet rekening worden gehouden. Daarom een ChIP van corticale weefsel bij E14.5 kan onthullen, H3K79me2 of andere Histon wijzigingen op dat specifieke tijdstip maar celtype specifieke chromatine functies kan niet worden weergegeven. Dit probleem kan worden opgelost door de verrijking van bepaalde cellen met fluorescentie-activated cell sorting (FACS) of magnetische-geactiveerde cel sorteren (MaCS-sortering)40, die na de hersenen homogenisering haalbaar is. Met MaCS-sorting neurale voorlopercellen uitvoering van specifieke cel oppervlakte markeringen kunnen gelabeld zijn met magnetische kralen en vervolgens geïsoleerd met een magnetische stand40. Daarna kunnen de cellen worden gekweekt of rechtstreeks gebruikt voor ChIP. De gepresenteerde protocol kan worden gebruikt, niet alleen voor neurale voorlopercellen, maar ook voor andere homogene cel populaties. Met toevoeging van FACS of MaCS, kan het protocol worden toegepast voor alle afgezonderd cellen binnen een organisme.

Samen genomen, maakt het voorgestelde protocol het mogelijk om te onderzoeken de Histon wijziging H3K79me2 op verschillende tijdstippen van de corticale en Cerebellaire ontwikkeling op een efficiënte en reproduceerbare manier. Het kan van toepassing zijn tot andere histone modificaties gelegen in de kern histone en kan worden toegepast op andere homogene celtypes binnen het organisme. Aangezien H3K79me2 een geconserveerde Histon wijziging23, kan het protocol ook geschikt voor het analyseren van H3K79me2, niet alleen in muizen maar over verschillende soorten worden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben

Acknowledgments

We bedanken Henriette Bertemes voor het helpen om het protocol van de teelt van CGN in het lab. Deze methode papier werd gesteund door de Medische epigenetica DFG-gefinancierde CRC992 door financiering van TV. De auteurs erkennen de steun van het Team van de Melkweg Freiburg: Pavankumar Videm, Björn Grüning en Prof. Rolf Backofen, bio-informatica, Universiteit van Freiburg, Duitsland gefinancierd door Collaborative Research Centrum 992 Medische epigenetica (DFG grant SFB 992/1-2012) en het Duitse federale ministerie van onderwijs en onderzoek (goedgekeurd subsidie 031 A538A RBC (de. NBI)).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-GAPDH Abcam ab8245 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:5000
Anti-H3 Abcam ab1791 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:3000
Anti-H3K79me2 Diagenode pAb-051-050 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: ChIP antibody
Anti-H3K79me2 Abcam ab-051-050 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:1000
Anti-rabbit-IgG Diagenode C15410206 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: ChIP Ctrl antibody
Anti-Tubulin alpha Abcam ab108629 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:3000
Apo-Transferrin (1 mg/ml) Sigma-Aldrich T1147 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
B27 Supplement (50x) Life Technologies 17504044 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
Bioanalyzer Agilent technologies G2940CA Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For analysis of sheared chromatin
Bioruptor NextGen Diagenode B01020001 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: Ultrasonicator
Boric acid pH 8.4 Sigma Aldrich B6768 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC culturing
CFX Connect RT PCR Detection System Bio-Rad 1855201 Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Detection system for qPCR
DMEM-F12 Life Technologies 11320-033 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGM
Dynabeads Protein A Invitrogen 10001D Category: ChIP
Abbreviation/Comment: Magnetic beads, for ChIP
EPZ-5676 Selleckchem S7062 Category: DOT1L inhibition
Abbreviation/Comment: For DOT1L inhibition in cell culture
Ethylenediamine tetraacetic acid SERVA 39760.01 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: EDTA
Fetal Bovine Serum 10% (v/v) Gibco 10082147 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC isolation and CGM
Glucose Sigma-Aldrich G5767 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGNP isolation
Glutathione (1.25 mg/ml) Sigma-Aldrich G4251 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
Glycine Carl Roth 3187 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For cell fixation
GoTaq mastermix Promega A6002 Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: DNA polymerase master mix for qPCR
Hank’s Balanced Salt Solution Life Technologies 14025-100 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: HBSS
L-glutamine (200 mM) Life Technologies 25030081 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
Laminin Sigma-Aldrich L2020 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC culturing
Lithium chloride Sigma-Aldrich L4408 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: LiCl
N2 supplement Life Technologies 17502048 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGM
NanoDrop 3300 Thermo Fisher 3300 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: Fluorospectrometer for DNA quantification
NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina NEB E7645S Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Kit for Library preparation
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina NEB E7335 Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Oligos for Library preparation
Neurobasal medium Gibco 21103049 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
NP-40 Alternative Calbiochem 492016 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP buffer
Paraformaldehyde Carl Roth 335 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: PFA, for cell fixation
Penicillin-Streptomycin-Neomycin 1% (v/v) Life Technologies 15640055 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: PSN, for CCM and CGM
Phosphate buffered saline Life Technologies 10010023 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: PBS, for CPC isolation
PicoGreen Kit Thermo Fisher P11496 Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Visualizing dye for DNA quantification
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P6407 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGNP isolation
Poly-L-ornithine hydrobromide Sigma Aldrich P3655 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC culturing
Potassium chloride Thermo Fisher AM9640G Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: KCl, for CGM
Protease inhibitor Roche 4693159001 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP
Proteinase K Sigma-Aldrich 3115879001 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP
Qiagen MinElute Qiagen 28004 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: Kit for DNA purification
RNAse Sigma-Aldrich R6513 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP
SGC0946 Selleckchem S7079 Category: DOT1L inhibition
Abbreviation/Comment: For DOT1L inhibition in cell culture
Sodium bicarbonate Carl Roth 8551.1 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: for Elution buffer
Sodium chloride Carl Roth 9265 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: NaCl, for ChIP buffer
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich 30970 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP
Sodium dodecylsulfate Carl Roth 183 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: SDS, for ChIP
Sonic hedgehock (SHH) Sigma-Aldrich SRP6004 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGNP isolation
Superoxide dismutase (1mg/ml) Sigma-Aldrich S7571 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Carl Roth 9090 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: TRIS, for ChIP buffer
Triton X-100 Carl Roth X100 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP buffer
Trypsin-EDTA 0,05% (w/v) Sigma Aldrich 59417C Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC isolation
Tween20 Carl Roth 28320 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For bead preparation
Other Lab devices: Neubauer counting chamber, Incubator, Rotator, Shaker, Disection set, Water bath
CCM: Cortical cell medium
CGM: CGNP cell culture medium

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R. L., Macklis, J. D. Neuronal subtype specification in the cerebral cortex. Nat. Rev. Neurosci. 8, 427-437 (2007).
  2. Kandel, E. R., Squire, L. R. Neuroscience: breaking down scientific barriers to the study of brain and mind. Science. 290, 1113-1120 (2000).
  3. Götz, M., Sommer, L. Cortical development: the art of generating cell diversity. Dev. Camb. Engl. 132, 3327 (2005).
  4. Hirabayashi, Y., Gotoh, Y. Epigenetic control of neural precursor cell fate during development. Nat. Rev. Neurosci. 11, 377-388 (2010).
  5. Davis, A. A., Temple, S. A self-renewing multipotential stem cell in embryonic rat cerebral cortex. Nature. 372, 263-266 (1994).
  6. Sauvageot, C. M., Stiles, C. D. Molecular mechanisms controlling cortical gliogenesis. Curr. Opin. Neurobiol. 12, 244-249 (2002).
  7. McConnell, S. K., Kaznowski, C. E. Cell cycle dependence of laminar determination in developing neocortex. Science. 254, 282-285 (1991).
  8. Desai, A. R., McConnell, S. K. Progressive restriction in fate potential by neural progenitors during cerebral cortical development. Dev. Camb. Engl. 127, 2863-2872 (2000).
  9. Glickstein, M., Strata, P., Voogd, J. Cerebellum: history. Neuroscience. 162, 549-559 (2009).
  10. Marzban, H., et al. Cellular commitment in the developing cerebellum. Front. Cell. Neurosci. 8, (2015).
  11. Azevedo, F. A. C., et al. Equal numbers of neuronal and nonneuronal cells make the human brain an isometrically scaled-up primate brain. J. Comp. Neurol. 513, 532-541 (2009).
  12. Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48, 17-24 (2005).
  13. Luger, K., Mäder, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389, 251-260 (1997).
  14. Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, 693-705 (2007).
  15. Zhang, Q., et al. Histone modification mapping in human brain reveals aberrant expression of histone H3 lysine 79 dimethylation in neural tube defects. Neurobiol. Dis. 54, 404-413 (2013).
  16. Zhang, Y., Reinberg, D. Transcription regulation by histone methylation: interplay between different covalent modifications of the core histone tails. Genes Dev. 15, 2343-2360 (2001).
  17. Sanders, S. L., et al. Methylation of histone H4 lysine 20 controls recruitment of Crb2 to sites of DNA damage. Cell. 119, 603-614 (2004).
  18. Martin, C., Zhang, Y. The diverse functions of histone lysine methylation. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 838-849 (2005).
  19. Greer, E. L., Shi, Y. Histone methylation: a dynamic mark in health, disease and inheritance. Nat. Rev. Genet. 13, 343-357 (2012).
  20. Ng, H. H., et al. Lysine methylation within the globular domain of histone H3 by Dot1 is important for telomeric silencing and Sir protein association. Genes Dev. 16, 1518-1527 (2002).
  21. Kebede, A. F., Schneider, R., Daujat, S. Novel types and sites of histone modifications emerge as players in the transcriptional regulation contest. FEBS J. 282, 1658-1674 (2015).
  22. Roidl, D., Hacker, C. Histone methylation during neural development. Cell Tissue Res. 356, 539-552 (2014).
  23. Mersfelder, E. L., Parthun, M. R. The tale beyond the tail: histone core domain modifications and the regulation of chromatin structure. Nucleic Acids Res. 34, 2653-2662 (2006).
  24. van Leeuwen, F., Gafken, P. R., Gottschling, D. E. Dot1p Modulates Silencing in Yeast by Methylation of the Nucleosome Core. Cell. 109, 745-756 (2002).
  25. Jones, B., et al. The histone H3K79 methyltransferase Dot1L is essential for mammalian development and heterochromatin structure. PLoS Genet. 4, e1000190 (2008).
  26. Woo Park, J., et al. RE-IIBP Methylates H3K79 and Induces MEIS1-mediated Apoptosis via H2BK120 Ubiquitination by RNF20. Sci. Rep. 5, 12485 (2015).
  27. Vlaming, H., van Leeuwen, F. The upstreams and downstreams of H3K79 methylation by DOT1L. Chromosoma. , (2016).
  28. Jones, B., et al. The histone H3K79 methyltransferase Dot1L is essential for mammalian development and heterochromatin structure. PLoS Genet. 4, e1000190 (2008).
  29. Feng, Y., et al. Early mammalian erythropoiesis requires the Dot1L methyltransferase. Blood. 116, 4483-4491 (2010).
  30. Cattaneo, P., et al. DOT1L-mediated H3K79me2 modification critically regulates gene expression during cardiomyocyte differentiation. Cell Death Differ. 23, 555-564 (2016).
  31. Zhang, Q., et al. Histone modification mapping in human brain reveals aberrant expression of histone H3 lysine 79 dimethylation in neural tube defects. Neurobiol. Dis. 54, 404-413 (2013).
  32. Büttner, N., Johnsen, S. A., Kügler, S., Vogel, T. Af9/Mllt3 interferes with Tbr1 expression through epigenetic modification of histone H3K79 during development of the cerebral cortex. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 7042-7047 (2010).
  33. Roidl, D., et al. DOT1L Activity Promotes Proliferation and Protects Cortical Neural Stem Cells from Activation of ATF4-DDIT3-Mediated ER Stress In Vitro. Stem Cells Dayt. Ohio. 34, 233-245 (2016).
  34. Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nat. Biotechnol. 29, 24-26 (2011).
  35. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat. Methods. 9, 357-359 (2012).
  36. Zhang, Y., et al. Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9, R137 (2008).
  37. Ramírez, F., et al. deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis. Nucleic Acids Res. 44, W160-W165 (2016).
  38. Roidl, D. Histone modifications during cerebral cortex development. , (2015).
  39. Turner, B. ChIP with Native Chromatin: Advantages and Problems Relative to Methods Using Cross-Linked Material. Mapping Protein/DNA Interactions by Cross-Linking. , Institut national de la santé et de la recherche médicale. (2001).
  40. Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S., Whittemore, S. R. Isolation of cortical mouse oligodendrocyte precursor cells. J. Neurosci. Methods. 209, 219-226 (2012).

Tags

Neurowetenschappen kwestie 131 cerebellaire celcultuur corticale celcultuur schors cerebellaire ontwikkelen methylation van H3K79 DOT1L ChIP remming van de DOT1L
Isolatie en teelt van neurale progenitoren gevolgd door chromatine-Immunoprecipitation van Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bovio, P., Roidl, D., Heidrich, S.,… More

Bovio, P., Roidl, D., Heidrich, S., Vogel, T., Franz, H. Isolation and Cultivation of Neural Progenitors Followed by Chromatin-Immunoprecipitation of Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark. J. Vis. Exp. (131), e56631, doi:10.3791/56631 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter