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Neuroscience

Isolement et culture des progéniteurs neurones suivie par immunoprécipitation de la chromatine de marque d’Histone 3 Lysine 79 MBD

Published: January 26, 2018 doi: 10.3791/56631
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1
1Institute for Anatomy and Cell Biology, Department of Molecular Embryology, Faculty of Medicine, University of Freiburg, 2Faculty of Biology, University of Freiburg

Summary

Nous présentons une méthode efficace et reproductible pour isoler et de la culture des cellules progénitrices neurales de tissus du cerveau embryonnaire et postnatale pour l’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) de l’histone 3 lysine 79 MBD (H3K79me2) - une marque d’histone agrave la domaine globulaire de l’histone 3.

Abstract

Le développement du cerveau est un processus complexe, qui est contrôlé de manière temporo-spatiale par des gradients de morphogènes et différents programmes transcriptionnelles. En outre, des modifications épigénétiques chromatine, comme la méthylation des histones, ont un rôle important pour établir et maintenir des destins de cellule spécifique au sein de ce processus. La grande majorité de la méthylation des histones se produit sur la queue de l’histone flexible, qui est accessible aux modificateurs d’histone, gommes à effacer et histones lecteur. En revanche, la méthylation de l’H3K79 se trouve dans le domaine globulaire de l’histone 3 et est impliquée dans les différentes fonctions du développement. Méthylation de l’H3K79 est conservée évolutives et se trouvent dans un large éventail d’espèces de l’Homo sapiens à Saccharomyces cerevisiae. La modification se produit dans différentes populations cellulaires au sein d’organismes, y compris les progéniteurs neuraux. L’emplacement de la méthylation de H3K79 dans le domaine globulaire de l’histone 3, il est difficile à évaluer. Ici, nous présentons des méthodes pour isoler et progénitrices corticale de la culture des cellules (CPC) de tissus embryonnaires cerveau cortical (E11.5-E14.5) ou les progéniteurs des neurones granulaires cérébelleux (CGNPs) de tissus de postnatal (P5-P7) et efficacement immunoprécipitation H3K79me2 pour la PCR quantitative (qPCR) et le séquençage de génome.

Introduction

Les fonctions sensorielles, motrices et cognitives du cerveau sont très complexes et sensibles aux changements physiques et environnementaux. Le cerveau est constitué de trois parties générales le hind-, moyennes et du cerveau, qui sont profondément liées. Dans le cerveau antérieur, le télencéphale se divisent en une dorsale télencéphale (DT) et un télencéphale ventral (VT). La DT de souris se compose de six couches corticales qui sont forment entre E11.5 et E18.5 dans une façon de « inside-out »1. Le VT comprend les éminences ganglionnaires dans le développement, qui forment plus tard les ganglions de la base2,3. Plusieurs types de cellules peuvent être classés dans le système nerveux central chez les mammifères tels que les neurones, astrocytes, oligodendrocytes4ou qui se développent dans une manière temporo-spatiale5. Tout d’abord, les cellules progénitrices neurales (PNJ) donnent lieu à différents types de neurones, les interneurones dans le VT et des neurones de projection dans la DT et plus tard sur les cellules gliales (p. ex., les astrocytes,6). Au cours du développement cortical, couche la plus superficielle (couche I), qui contient des cellules de Cajal-Retzius, est formé en premier. Puis, entre E12.5 et E14.5, PNJs génèrent des plus profondes couches neuronales (VI, V) tandis qu’entre 14,5 et 16.5, progéniteurs donnent lieu à des neurones de la couche supérieure (IV-II)7,8. Aucune identité neuronale est spécifié par différents programmes temporo-spatiale transcriptionnelles induite sur les capacités et en outre par l’épigénétique programmes2.

Le cervelet, qui est impliqué dans la coordination motrice, est situé dans le cerveau postérieur et se développe entre E10 et environ P20 souris9. Il contient le cortex cérébelleux et les noyaux cérébelleux10. Le cortex cérébelleux adult se compose de trois couches, la couche moléculaire, la couche de cellules de Purkinje et la couche granulaire interne contenant des neurones granulaires10. Les microglies cérébelleuses sont les plus petits neurones et représentent environ 80 % de tous les neurones dans le cerveau de vertébrés11. Ils se développent à partir des précurseurs situés dans la zone externe de germinale et migrent à travers la couche de cellules de Purkinje à leur destination12. Comme dans le télencéphale, le développement du cervelet est régi par plusieurs morphogènes importants, qui ont des fonctions spécifique et espace-dépendant du temps et initier défini transcriptionnelle programmes10.

Le développement des couches corticales et cérébelleux est contrôlé par l’expression transcriptionnelle de morphogènes spécifiques et, ainsi, par l’état de la chromatine de l’ADN. Dans une vue simplifiée, les États de la chromatine se divisent en euchromatine comme activité de transcription et hétérochromatine comme régions transcriptionally silencieuses. Le nucléosome est l’unité fondamentale de la chromatine contient deux copies de chaque histone core H2A, H2B, H3 et H4, entouré de 147 paires de bases d’ADN13. Les histones sont hautement post-traductionnellement modifiées par méthylation, acétylation, phosphorylation, ubiquitination, sumoylation, ADP-ribosylation, désamination et proline isomérisation14,15. Méthylation de lysine histone est réputée être la modification d’histone plus stable qui contrôle la transcription, réplication, recombinaison16, dommages à l’ADN réponse17et l’empreinte génomique18. Lysines peuvent être mono-, di- ou tri-méthylés19 et apparaissent non seulement sur les queues d’histone accessible, mais aussi au sein du domaine globulaire d’histones20. Les méthylations spécifiques à H3K4 et H3K36 sont principalement liées à l’euchromatine, méthylations spécifiques au H3K9, H3K27 ou H4K20 se trouvent principalement dans des régions hétérochromatiques, bien que tous les résidus sont situés au sein de l’histone Queue14, 19,,21. Méthylation de l’H3K79 est située dans le domaine globulaire histone et a été associée à l’activité transcriptionnelle, mais aussi avec les régions génomiques transcriptionnellement inerte22. La modification est conservée évolutif puisqu’il a été observé chez la levure, thymus de veau, poulet et humaine23. H3K79 mono, di et triméthylation (H3K79me1, me2, me3) sont catalysées par l’histone methyltransferases DOT1L24,25 et le nucléaire SET contenant du domaine Protein 2 (Nsd2)26. DOT1L est impliqué dans la prolifération et réparation de l’ADN cellulaire reprogrammation27. Perte de Dot1l chez la souris entraîne un décès prénatal autour du stade de développement de28,E10.529. Au cours du développement du cœur et dans la différenciation myocardiocyte, DOT1L est essentiel pour gene expression règlement30. Dans le système nerveux central, DOT1L fonction pourrait être impliquée dans le tube neural development31, il est impliqué dans la répression des Tbr1-expression lors du prosencéphale développement32et peuvent fonctionner dans la régulation du stress du re gènes de réponse33. L’activation dépendante du contexte ou la répression action de H3K79me, en particulier avec in vivo des situations comme le développement du système nerveux central, est à ce jour, seulement partiellement compris32. Méthylation de l’H3K79 se trouve dans le domaine globulaire de l’histone 3, il est stériquement moins accessible par rapport à des modifications sur l’histone flexible queues23. Pour comprendre la fonction de méthylation de l’H3K79, des méthodes d’analyse fiables et reproductibles pour déterminer son emplacement et son environnement génomique sont nécessaires. Dans cet article des méthodes, nous présentons des méthodes d’isolation des différentes progéniteurs neurones (CPC pour le cortex) et CGNPs pour le cervelet, un traitement inhibiteur de la DOT1L efficace et une méthode de puce pour analyser H3K79 méthylation par qPCR ou séquençage en temps différents points au cours du développement cortical et cérébelleux. Pour une vue d’ensemble du protocole et de ses possibilités, voir la Figure 1.

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Protocol

Comités de protection des animaux de l’Université de Fribourg et les autorités locales a approuvé toutes les expériences animales (G12/13, G16/11), mentionnés dans le protocole suivant.

1. les préparatifs

  1. Préparations pour l’isolement de la SCD
    1. Mis sur pied chronométrée accouplement afin d’obtenir des embryons à des stades différents du développement du cortex (entre E11.5 et E14.5). Utilisez la souris de la souche NMRI (Naval Medical Research Institute) qui ont au moins 8 semaines. Après l’accouplement, envisager un plug vaginal positif au E0.5.
    2. Pour avoir suffisamment de matière, utiliser une litière de souris NMRI pour une seule puce H3K79me2 des cortex de E12.5 ou E14.5. Pour les stades embryonnaires, utiliser une litière pour des analyses plus de puce (moyenne de la taille des portées NMRI : 10 embryons).
    3. Thermoélectrique Hank´s Balanced Salt Solution (HBSS) et solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à 4 ° C (stockage à long terme à la droite).
    4. Equilibrez la 4 ° C stocké la trypsine-EDTA (0,05 % p/v) à 37 ° C.
    5. Moyenne de cellules corticales Prepare (CCM) : Compléter le support pour les neurones (voir Table des matières) avec la concentration finale de 2 % (v/v) Supplément de B-27, 5 µg/mL Apo-transferrine, 1 µg/mL de glutathion, 0,5 mM de L-glutamine, dismutase de superoxyde de 0,8 µg/mL et 1 % (v/v) Mélange antibiotique de pénicilline-streptomycine-néomycine. Conserver à 4 ° C. Pour l’expérience, équilibrer le milieu à 37 ° C.
    6. Décongeler l’aliquote de sérum de veau foetal (FCS), il (50 mL chacune) et équilibrer une aliquote à 37 ° C (stockage à long terme à-20 ° C).
    7. Préparer des stocks de DNAse 1 (10 mg/mL) en H2O pour la culture cellulaire. Stocker les aliquotes à-20 ° C.
    8. Le cas échéant, dissoudre les inhibiteurs spécifiques de DOT1L EPZ-5676 ou SGC0946 dans le DMSO à une concentration de stock de 100 mM. Appliquer une concentration de fin de 1 à 5 µM pour les cellules au jour J0 et réappliquez l’inhibiteur tous les deux jours.
    9. Pour la culture du CPC, enduire plaques de culture cellulaire (puits 6 ou 12 puits) avec la poly-L-ornithine hydrobromide (1 mg/mL dans le pH de l’acide borique 150 mM 8,4) pendant au moins 1 h à RT et ensuite avec la laminine (1 mg/mL) dans un milieu CCM à 37 ° C pendant la nuit.
  2. Préparations pour l’isolement de CGNP
    1. Organiser un accouplement approprié de souris pour produire des animaux de P5-P7 pour l’isolement du cervelet (3-5 animaux par puce et condition).
    2. Préparer HBSS/Glucose en ajoutant 6 mg/mL de glucose à tampon HBSS.
    3. Préparer le milieu de culture de cellules CGNP (CGM) en ajoutant 1 % (v/v) Supplément de N2, 1 % (v/v) pénicilline-streptomycine-néomycine, 25 mM KCl et 10 % de FCS à DMEM-F12. Pour la culture de CGNP préparer CGM milieu sans FCS, mais dont le hérisson sonic de 0,6 µg/mL (SHH) (CGM-SHH) et elle est proportionnelle à 37 ° C si nécessaire.
    4. Enduire les plaques de culture de 6 puits cellulaire avec 100 µg/mL poly-D-lysine pendant 1-2 h à ta suppression de cellules gliales. Par la suite laver deux fois avec les ddH stérile2O et sécher les plaques. Stocker les plaques pendant maximum une semaine à 4 ° C.
    5. Pour la culture des plaques de culture de 6 puits cellulaire de manteau de CGNPs avec la poly-L-ornithine (0,1 mg/mL) à 4 ° C la nuit. Par la suite laver deux fois avec H2O pour culture cellulaire et sécher les plaques.
      Remarque : Les plaques peuvent être stockés pendant maximum une semaine à 4 ° C.
    6. Préparer la trypsine (p/v) de 0.025 % HBSS/glucose et elle est proportionnelle à 37 ° C si nécessaire.
  3. Préparations pour la puce de H3K79me2
    1. Préparer la PFA (1 % dans du PBS, pH 8) fraîchement avant réticulation chromatine. Pour préparer la PFA chauffer 50 mL de PBS au micro-ondes à maximum 65 ° C. Pendant l’agitation constante ajouter 0,5 mg PFA pour le PBS. Puis ajouter 50 µL 10 M NaOH et attendez que PFA est dissoute. Ajouter par la suite, 42,5 µL HCl (37 % v/v) pour obtenir un pH de 8. Vérifiez le pH à nouveau et puis de laisser la solution de 1 % PFA atteindre RT
    2. Préparer les stocks de RNase (1 mg/mL) et de la protéinase K (20 µg/µL) séparément en stérile ddH2O. stocker les aliquotes à-20 ° C.
    3. Préparer les tampons et les réactifs suivants : PBS contenant 0,02 % Tween, tampon de lyse, Glycine, tampon de Dilution, ChIP mémoire tampon 1, tampon 2 de la puce, puce tampon 3 et tampon TE et les stocker à 4 ° C. Préparer le tampon d’élution fraîchement chaque fois.
      1. Préparer les PBS contenant 0,02 % Tween. Magasin pour au plus une semaine à 4 ° C.
      2. Préparer le tampon de lyse en utilisant 50 mM Tris à pH 8,0, 10 mM EDTA, dodécylsulfate de sodium à 1 % (p/v) (SDS) et 1 x inhibiteur de la protéase.
      3. Préparer la glycine de 2,5 M.
      4. Préparer le tampon de dilution à l’aide de Tris de 20 mM à pH 8,0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 % (v/v) X-100 Triton, SDS de 0,25 % (p/v) et 1 x inhibiteur de la protéase.
      5. Préparer la puce mémoire tampon 1 à l’aide des Tris de 20 mM à pH 8,0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 % (v/v) X-100 Triton et 0,2 % (p/v) SDS.
      6. Préparer la puce mémoire tampon 2 à l’aide de 20 mM Tris pH 8,0, 500 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 % (v/v) X-100 Triton et 0,2 % (p/v) SDS.
      7. Préparer la puce mémoire tampon 3 utilisation 20 mM Tris pH 8,0, LiCl, EDTA, 2 mM 250 mM 1 % (v/v) NP-40 et 1 % (p/v) SDS.
      8. Préparer le tampon TE utilisant 20 mM Tris pH 8,0 et 2 mM EDTA.
      9. Préparer le tampon d’élution frais contenant 1 % (p/v) SDS, 100 mM NaHCO3.

2. neurales progénitrices isolement du tissu cérébral

  1. Isolement et culture en option du SCD
    1. Euthanasier les animaux gravides par dislocation cervicale et de transférer les embryons à HBSS glacée.
    2. Supprimer le crâne avec des ciseaux et isoler le cerveau, puis supprimer les méninges, le cas échéant, avec les petites pinces et isolat cortex (entiers, DT, soit VT) des deux hémisphères en supprimant toutes les autres parties du cerveau sous le champ binoculaire à l’aide de petites pinces et, le cas nécessaire, petits ciseaux. Stocker le cortex isolé dans un tampon HBSS 5 mL à 4 ° C dans un tube de 15 mL.
    3. Centrifuger le matériau cérébraux isolés pendant 5 min à 1 000 x g et 4 ° C.
    4. Laver le cortex avec 5 mL HBSS glacée et les homogénéiser avec une pointe de pipette de 1 mL par pipetage de haut en bas. Si nécessaire, couper l’extrémité de l’embout de la pipette.
    5. Centrifuger l’échantillon homogénéisé pendant 5 min à 1 000 x g et 4 ° C. Retirez le HBSS.
    6. Ajouter 3 mL de trypsine et incuber l’échantillon pendant 5 min à 37 ° C.
    7. Ajouter 1 mL de FCS et 30 µL de DNase 1 5 mL CCM à l’échantillon et homogénéiser l’échantillon avec une pipette de verre de 5 mL en pipettant également soigneusement de haut en bas.
    8. Centrifuger les cellules isolées pendant 5 min à 1000 x g et 4 ° C. Jeter le surnageant, ajouter 5 mL CCM et homogénéiser l’échantillon de nouveau.
    9. Diluer une aliquote de l’échantillon et le compter avec une chambre de comptage Neubauer. Un montant moyen de 4,5 x 106 cellules par embryon est prévu. Pour la culture de la SCD isolé, passez à l’étape 2.1.10. Pour la puce, procéder immédiatement à l’étape 3.
    10. Pour la culture, plaque le SCD sur la poly-L-ornithine (0,1 mg/mL) et de la laminine (1 mg/mL) enduit plats à une densité variant de 8 x 104 et 2,5 x 105 cellules/cm2 dans le milieu de la CCM et les incuber à 37 ° C, 5 % de CO2et 100 % d’humidité relative.
    11. Comme les CPCs commencent à se différencier en neurones en culture cellulaire (après environ 4 jours), considérer la date de la dissection comme jour in vitro 0 (jour 0). Pour des durées plus longues de la culture, la moitié du milieu changer chaque jour quatrième avec un milieu frais CCM.
    12. Appliquer 1 à 5 µM SGC0946 ou EPZ5676 dissoute dans le DMSO à jour 0 (4-5 h après l’isolement de cellules) et actualisez-le tous les deux jours. Utilisation DMSO comme un traitement de la commande. Tester l’efficacité d’un traitement inhibiteur via des méthodes standard immunoblot, si nécessaire.
  2. Isolement et culture en option du CGNPs
    1. Euthanasier P5-7 animaux par décapitation à l’aide de ciseaux. Enlever la peau du cuir chevelu, ouvrir le crâne et enlever le cerveau à l’aide de pinces et petits ciseaux. Isoler le cervelet et transférez-le vers glacee HBSS/Glucose. Supprimer tous les méninges et les vaisseaux sanguins et transférer le sembable dans 15 mL tubes remplis de froid HBSS/Glucose.
    2. Laver le sembable trois fois avec 10 mL glacee HBSS/Glucose (Collectionnez-les par centrifugation à 650 x g pendant 5 min à 4 ° C) et homogénéiser sembable ultérieurement en pipettant également doucement de haut en bas avec une pipette 1 mL (maximum 2 - 3 fois) pour obtenir 0,5 à 1 mm3 fragments.
    3. Ajouter 5 mL de 0.025 % trypsine HBSS/glucose et incuber le tissu en agitant dans un bain-marie à 37 ° C pendant 15 min. arrêt de la digestion en ajoutant 5 mL du CGM et recueillir le tissu par centrifugation à 650 x g pendant 5 min à 4 ° C.
    4. Retirez le surnageant et triturer les tissus avec une pointe de pipette de 1 mL dans 1 mL CGM et transférez-le dans un nouveau tube de 15 mL.
      Remarque : Il est important d’éviter les bulles d’air.
      1. Ajouter 5 mL CGM et incuber le mélange pendant 2 min sur la glace pour régler les restes de tissus. Transvaser le surnageant dans un nouveau tube de 15 mL. Ajouter 2 mL CGM au tissu résiduel et répéter la procédure de trituration.
    5. Réunir les fractions surnageantes (sans restes de tissu, environ 10 mL au total) et centrifuger à 650 x g pendant 5 min à 4 ° C à recueillir les cellules du cervelet. Resuspendre le culot dans 10 mL CGM.
    6. Car les astrocytes respectent plus vite et plus fort poly-D-lysine que CGNPs, plaque de cellules de 100 µg/mL poly-D-lysine couché 6-puits-plaques (jusqu'à 4 mL par puits) et incuber pendant 20 min à 37 ° C pour éliminer les astrocytes.
    7. Secouer la plaque et de recueillir le liquide surnageant. Puis centrifuger à 650 x g pendant 5 min à 4 ° C dans un tube de 15 mL. Resuspendre le culot dans 10 mL CGM et compter les cellules avec un Neubauer chambre de comptage.
      Remarque : CGNPs sont rondes, petites et de montrer un halo quand image microscope à contraste de phase.
    8. Si nécessaire, les semences les cellules à 37 ° C préchauffé CGM sur plaques de poly-L-ornithine-enduit (3 x 106 cellules / puits-6) et les incuber à 37 ° C, 5 % de CO2 et 100 % d’humidité relative.
      Remarque : Si l’ensemencement n’est pas effectuée, poursuivez étape 3.1.
      1. Après 6-12 h, change le milieu à CGM-SHH. Traiter le h CGNPs 6 isolé (ou lorsque vous passez à CGM-SHH) après l’isolement avec DOT1L-inhibiteur et DMSO contrôler et renouveler tous les deux jours (Comparez avec 2.1.12). Tester l’efficacité d’un traitement inhibiteur via des méthodes standard immunoblot si nécessaire. Pour la puce, passez à l’étape 3.3.
        NOTE : Laissant CGM sur les plaques (et avec cette FBS) se traduira par la différenciation des CGNPs dans les neurones granulaires cérébelleux (SCT).

3. fixation des cellules et l’inclinaison de la chromatine

Remarque : Effectuez des opérations 3.1 et 3.2 si les cellules ne sont pas cultivées, s’ils sont passez à l’étape 3.3.

  1. Recueillir les cellules par centrifugation pendant 4 min à 1000 x g et ajouter 1,3 mL de PBS. Transférer l’échantillon dans un tube de 1,5 mL. Centrifuger pendant 4 min à 1 000 x g à 4° C. Laver l’échantillon deux fois à 1,3 mL PBS.
  2. Étape critique : Ajouter 350 µL 1 % PFA à l’échantillon et il incuber 5 min à 22 ° C. Pour arrêter la réaction, ajoutez 18,4 glycine µL et 1 mL de PBS. Centrifuger l’échantillon pendant 5 min à 1 000 x g à 4 ° C.
    1. Laver l’échantillon deux fois avec du PBS glacée. Recueillir les cellules fixes par centrifugation pendant 5 min à 1 000 x g et 4 ° C. Conserver les échantillons sur glace à l’avenir.
      NOTE : Le temps de fixation doit être précisément 5 min pour obtenir des résultats optimaux. Nombre de cellules différentes peut-être nécessiter des adaptations de temps.
  3. Étape critique : Culture CGNPs (ou SCD), ajouter à 1 mL 1 % PFA directement dans les puits de plaque de culture cellulaire. Après une incubation de 5 min à 22 ° C, ajouter une quantité appropriée de glycine et de PBS et récolter les cellules avec un grattoir de cellules.
    1. Les cellules de transfert dans des tubes de 1,5 mL et centrifuger l’échantillon pendant 5 min à 1 000 x g et 4 ° C. Laver l’échantillon deux fois avec du PBS glacée. Recueillir les cellules fixes par centrifugation pendant 5 minat 1 000 x g à 4 ° C. Conserver les échantillons sur glace à l’avenir.
  4. Étape critique : Ajouter 700 µL de tampon de lyse (+ inhibiteur de protéase) et incuber l’échantillon pendant 15 min à 4 ° C. Vortex l’échantillon chaque 5 min. de cisaillement de la chromatine des cellules lysées 3 x 10 min dans le sonicateur (30 impulsions s, 30 s pause) à la puissance maximale.
    1. Assurez-vous que le volume ne dépasse pas 350 µL par tube. Vortex les échantillons chaque 10 min. vérifier le lysat pour noyaux restants avec un microscope à contraste de phase.
      Remarque : Il est important d’obtenir des résultats optimaux de cisaillement (à comparer avec la Figure 1 b) pour une analyse ultérieure. Dans le cas d’autres méthodes pour la tonte de la chromatine, optimiser la tonte à la chromatine des fragments de taille entre 200-500 PB.
  5. Pellet restes cellulaires pour 10 min, 13 000 x g, 4 ° C. Utiliser le surnageant pour l’étape preclearing 5.2. Congeler les échantillons à-20 ° C pour une utilisation ultérieure, si nécessaire.

4. préparation des perles et présélection

  1. Laver les 45 µL protéine A perles magnétiques/ChIP et 20 µL magnétique perles/échantillon avec 1 mL de PBS glacée contenant 0,02 % Tween trois fois à l’aide d’un support magnétique. Ensuite, ajouter 1 mL de PBS glacée aux talons.
  2. Ajouter à 1 mL de PBS glacée et 45 µL perles/ChIP, 3 µg d’anticorps/puce (H3K79me2 ou lapin IgG). Incuber les échantillons pendant 2 h à 4 ° C sur un agitateur pour lier les anticorps aux talons. En fonction de l’anticorps, utiliser ~ 3 µg anticorps/ChIP.
  3. Lavez les anticorps-bound-perles trois fois avec 1 mL de PBS glacée contenant 0,02 % Tween. Ajouter le volume approprié de perle (à partir du volume de billes magnétiques utilisés) de PBS glacée aux lavé anticorps-couplé-talons.
  4. Ajouter 600 µL de tampon de dilution et de 20 µL de billes magnétiques lavés à l’échantillon de contrôle (volume total 1 320 µL) et incuber pendant 2 h à 4 ° C sur un agitateur. Retirez les perles à l’aide d’un support magnétique. Bénéficiez de 5 % (33 µL) des lysats sous forme d’échantillons d’entrée et les congeler à-20 ° C.

5. immunoprécipitation de la chromatine

  1. Diviser l’extrait pré-approuvée en deux tubes (environ 643,5 µL), ajouter le même volume de tampon de dilution et les anticorps-bound-perles (45 µL/échantillon ; H3K79me2 ou lapin IgG). Incuber les échantillons à 4 ° C durant la nuit sur un rotateur.
  2. Laver les billes avec glacee puce buffer 1, tampon 2 de la puce et ChIP 3 pendant 10 min chaque à 4 ° C sur un agitateur. Par la suite, laver trois fois avec tampon TE pendant 5 min à 4 ° C sur un agitateur.
  3. Éluer les perles avec un tampon d’élution pendant 1 h à 1 400 tr/min dans un shaker à température ambiante.
  4. Ajoute les échantillons d’entrée de 10 µg de RNase (1 mg/mL) par échantillon de puce et de 5 µg et incuber les échantillons pendant 30 min à 37 ° C (1 400 tr/min).
  5. Ajouter 100µg protéinase K (20 µg/µL) par ChIP échantillon et 50 µg / entrée et incuber une nuit à 65 ° C à 1 400 tr/min.

6. purification des échantillons d’éclats

  1. Purifier le ChIP et les échantillons d’entrée avec une purification d’ADN nécessaire (voir la Table des matières) selon le manuel. Utilisez les colonnes de purification plus lorsque plus de 5 µg d’ADN est supposé. Éluer l’échantillon avec 2 x 15 µL de tampon d’élution de l’ADN fourni dans le kit.
  2. Effectuer la quantification des échantillons (utiliser 1 µL) en utilisant un fluorophore visualisation et un fluorospectromètre (voir la Table des matières).

7. l’analyse des échantillons par l’intermédiaire de qPCR

  1. Pour la conception d’amorce pour l’analyse de qPCR, extraire des séquences génomiques d’intérêt depuis le navigateur de visionneuse de génomique intégrative (IGV)34. Concevoir des amorces autour du site d’initiation transcriptionnelle (TSS) d’un gène, car H3K79me2 est susceptible d’être situé là. Comme contrôle, envisager non codantes génomique ou des régions environ 10 Ko en amont du TSS ou 10KO en aval de l’extrémité transcriptionnelle du site (TES).
    1. Générer les amorces avec https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ à l’aide d’une taille de produit entre 70 et 200 PB et une température optimale prédéfinie de 60 ° C. Aux fins du procès, utiliser les amorces pour les régions génomiques, Aft4, Ddit3, Scd1, Aft3 et Npm1 énumérés au tableau 1.
  2. Tester les amorces nouvellement conçus avec le programme suivant de qPCR, mix master et un gradient de température de recuit entre 58 et 63 ° C, puis sélectionnez la température de recuit avec la plus grande quantité de produit et la qualité.
    1. Appliquer l’électrophorèse de gel d’ADN pour contrôler la taille du produit attendu. Pour l’analyse de qPCR, utiliser un système de détection de PCR en temps réel (voir Table des matières).
    2. Préparer le mélange maître utilisant 10 mélange principal de la DNA polymérase µL, apprêt µL 0,5 vers l’avant (10 µM), 0,5 inverse l’apprêt µL (10 µM), l’eau sans nucléase 4 µL et 5 µL ADN (1 ng/µL).
    3. Utiliser un programme de qPCR 2 étapes comme suit : 5 min à 95 ° C, 50 x (30 s à 95 ° C, 30 s à 58 ° C à 63 ° C) et le gradient de dénaturation constamment à 4 ° C.
  3. Créer une série de dilutions d’échantillons d’ADN génomiques, cisaillés, purifiés (2 ng/µL, 1 ng/µL, 0,5 ng/µL, 0,25 ng/µL et 0,125 ng/µL) et d’utiliser 5 µL pour un essai d’efficacité à l’aide de qPCR. Déterminer la pente de la courbe d’étalonnage et de calculer l’efficacité de l’amorce de la formule suivante :
    Rendement (%) = (10^(-1/slope)-1) * 100.
    1. Utiliser des amorces avec des rendements entre 90 % et 105 % dans un cas idéal, ou au moins avec des rendements entre 85 et 115 %.
  4. Pour analyser la puce et les échantillons d’entrée, appliquer 0,1-1 ng de puce ADN mélangé avec respectif avant et apprêt inverse, eau exempte de nucléase et maître de l’ADN polymérase se mélangent dans un volume final de 20 µL de chaque réaction de qPCR.
  5. Déterminer les seuils de cycle (Ct) de puce et échantillons d’entrée et de normaliser l’échantillon Ct Ct les valeurs d’entrée pour calculer l’enrichissement (entrée %) avec la formule suivante. Valeurs det usage C obtenues des IgG contrôle pour déterminer la concentration de fond.
    entrée % = 100-2^(norme − intrants normalisés. ChIP)
    Norm. entrée = Ct (entrée) − journal2(facteur de dilution)
    Norm. Puce = Ct (ChIP) − journal2(facteur de dilution)
    NOTE : norm. = normalisée

8. l’analyse des échantillons d’éclats par séquençage

  1. Transférer les échantillons de puce (échantillon d’ADN d’entrée et immunoprécipitée) à une installation de séquençage.
  2. D’établir un usage de bibliothèque au préalable une préparation de la bibliothèque appropriée nécessaire (voir la Table des matières) et convertir 2 ng de l’entrée de l’ADN et tout de l’ADN d’immunoprécipitée dans les bibliothèques indexées pour la prochaine génération multiplex séquençage sur le indique la plate-forme (voir la Table des matières).
  3. Étape critique : En suivant les instructions du kit, ligaturer adaptateurs de séquençage (avec une concentration de travail de 15 µM) pour mettre fin à des fragments d’ADN réparés et dA à queue. Pour les adaptateurs de séquençage et PCR amorces utilisent oligos approprié (voir la Table des matières). Pour cette quantité d’entrées ADN, utilisez 6 à 9 cycles PCR pour enrichir les fragments d’ADN adaptateur ligaturé.
    Remarque : Normalement, il n’est pas nécessaire d’effectuer une sélection de la taille de l’ADN de l’adaptateur ligaturé. Il est préférable d’utiliser cycles PCR aussi peu que possible, depuis le résultat de cycles de nombreux PCR amplification en PCR double et délivre un GC.
  4. Pour une vérification finale de bibliothèque, prendre 0,5 µL de la réaction totale pour l’analyse de visualiser la distribution de la taille sur un dispositif approprié (voir la Table des matières). Pour la quantification, utiliser un colorant visualisation en combinaison avec un fluorospectromètre ou d’autres méthodes (voir la Table des matières).
  5. Étant donné que H3K79me2 semble être une modification des histones, qui est largement répartie entre grandes régions génomiques, séquencer l’échantillons appariés-fin d’une longueur de lecture de 50 bp et d’une profondeur de séquençage de 75 Mio lectures.
  6. Analyser les données de ChIP-seq avec le Galaxy/Uni Fribourg serveur (galaxy.uni-freiburg.de).
  7. Effectuer le contrôle de la qualité avec ChIPseq obtenu avec FastQC et, le cas échéant, leur carte directement avec Bowtie2 version 2.2.035 avec ou sans coupe. En tant qu’assemblage de génome de référence utiliser mm9 ou le plus récent mm10 version ; et comme annotation référence Ensembl FTP relâcher 79.
  8. Facultatif : Remove lire doublons à l’aide de MarkDuplicates Picard (http://broadinstitute.github.io/picard) avant d’appeler pic.
  9. Appelez les pics avec MACS2 version 2.1.036 à l’aide de l’option « large » pour H3K79me2.
  10. Pour obtenir un ratio de2 log entre la puce et d’échantillonnage en entrée, le journal2 du nombre de lectures des lectures ratio des deux échantillons utilisez BamCoverage et BamCompare.
  11. Pour tous les autre ChIP-seq spécifique analyse approfondie, appliquer deepTools2 version 2.3.5 ou 2.4.137, c'est-à-dire pour générer des fichiers de piste de couverture (bamCoverage pour la puce, bamCompare pour la comparaison de la puce à l’entrée), pour estimer la puce performances utilisez plotFingerprint et pour générer un aperçu général computeMatrix, plotHeatmap. Sélectionnez des K-moyennes de cluster pendant le processus de computeMatrix pour regrouper les régions génomiques selon la distribution de H3K79me2.
  12. Utilisation des données de ChIP-seq publiées comme H3K79me2 de E14.5 DT déposés à NCBI aux fins du procès (numéro d’Accession : SRP057733).

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Representative Results

Régime général d’isolement progénitrices neurales, culture, méthodes d’analyse H3K79me2 puce et puce : La figure 1 montre un diagramme pour effectuer H3K79me2 puce de cellules progénitrices corticales à différents moments au cours du développement du cerveau embryonnaire ou de cellules souches de neurones granulaires cérébelleux en étapes postnatals. Dans un premier temps, le cerveau doit être isolé et le télencéphale (entre E11.5 et E14.5) ou le cervelet (P5-P7) doit être récupérée. Il est possible d’analyser les différentes régions du télencéphale en le divisant en la DT et VT. Par la suite, le tissu va être homogénéisé et les progéniteurs neurones distincts. Maintenant, il est possible de la culture des cellules progénitrices et traitez-les avec des inhibiteurs de la DOT1L. Une autre possibilité consiste à résoudre les progéniteurs directement et les soumettre à la procédure de la puce. Pour la puce, la chromatine est cisaillée en fragments de 200-500 bp et incubée par la suite avec perles magnétiques-couplage d’anticorps contre H3K79me2. Après les perles de lavage et d’extraire l’ADN, l’ADN précipité peut être analysé par séquençage ou de qPCR (Figure 1 a). Il est essentiel d’avoir une distribution de bonne taille des fragments chromatine après la tonte, il est donc conseillé de vérifier la taille du fragment avec électrophorèse d’ADN ou d’autres méthodes (exemples à la Figure 1 b). Lors du choix de séquençage de génome, ChIP-seq-lit pour une occupation H3K79me2 recevront sous forme de fichier-fastq pour une analyse ultérieure (Figure 1). La qualité du séquençage lit doit être évaluée par l’application de FastQC et, le cas échéant, les fichiers fastq peuvent être coupés à l’aide de TrimGalore. Cartographie au Mus musculus génome mm9 ou mm10 peut être réalisée avec Bowtie2 et commandée par l’intermédiaire de PlotFingerprint. Il est conseillé de supprimer les doublons avec MarkDuplicates et pour normaliser les lectures de BamCoverage et de comparer la puce pour les échantillons d’entrée avec BamCompare. Les lectures de ChIP-seq peuvent par la suite être visualisée Génome large heatmaps ou avons dans les sessions de navigateur Viewer de génomique intégrative (IGV).

CPC culture et inhibition de la DOT1L : Les CPC ont été isolés et traités par inhibiteur de DOT1L 5 µM SGC0946 au jour 0 et le jour 2. Le DMSO solvant a été utilisé comme témoin. Au 3e jour, CPC ont été récoltés, les protéines ont été isolées, quantifiés et analysés par immunoblot (Figure 2 a). Figure 2 a montre que les niveaux de l’H3K79me2 sont effectivement diminué après trois jours de culture de CPC et inhibition de DOT1L assurant un régime de traitement inhibiteur efficace. La quantité de protéine de H3, GAPDH ou tubuline-alpha servant de chargement de contrôles n’ont ainsi pas se détériorer. Immunostaining des CPC fixes avec des anticorps contre active caspase 3 (CASP3 +) pour la détection de l’apoptose et HuC/D pour la visualisation des cellules neuronales a indiqué que le traitement des SCD avec inhibiteur de la DOT1L conduit à la mort cellulaire accrue après trois jours de culture, comme le montre dans la Figure 2 b. Quantification des cellules qui sont CASP3 + / DAPI + ou HuC/D + / DAPI + au sein de la culture de la CPC a révélé une augmentation significative des cellules CASP3 + révélant la mort programmée des cellules sur l’inhibition de la DOT1L. Le nombre de neurones HuC/D-positif, cependant, resta inchangée (Figure 2).

H3K79me2 ChIP-qPCR de Aft4, Ddit3, Scd1, Aft3 et Npm1 de CPCs traités par inhibiteur de la DOT1L : pour tester si le traitement inhibiteur de SGC0946 de DOT1L a été efficace et a conduit à une réduction de H3K79me2 à spécifique gènes, nous avons réalisé une analyse de ChIP suivie de qPCR du CPC traité pendant 3 jours. IgG de lapin a été utilisé comme un contrôle de la puce. Comme il est connu que H3K79me2 se trouve aux endoplasmatic gènes sensibles aux stress Aft3 , Aft4, Ddit3et Scd1, aussi bien à la gène de transport nucléaire Npm133,38, nous avons utilisé qPCR amorces couvrant le TSS, TES les régions génomiques au sein des organes de gène pour déterminer les différences dans la distribution de H3K79me2 après l’inhibition de DOT1L (Figure 3 a). Gènes présentant des niveaux élevés de H3K79me2 en premier lieu comme Atf4, Ddit3 et Npm1 étaient plus sensibles au traitement inhibiteur afin que trois jours de l’inhibition de la DOT1L conduit à une importante diminuent de H3K79me2. Gènes avec une couverture inférieure de H3K79me2, tels que Atf3 et Scd1, a montré aucun changement significatif dans les niveaux de H3K79me2.

Vue d’ensemble de H3K79me2 ChIP-seq analyse : Analyse de génome des niveaux H3K79me2 dans CPC de E14.5, effectués et analysés selon les projets présentés et les protocoles (Figure 1), a révélé une puce de très haute qualité. Alors que les comtes binned, triés selon leur fréquence des lectures d’entrée dans la tache d’empreintes digitales (Figure 4 a), ont été répartis, les comtes de H3K79me2 a montré l’enrichissement à des régions spécifiques (bacs au rang 1), qui affiche un succès accumulation de fragments de chromatine modifié à H3K79. Une heatmap de H3K79me2 le long de gènes entre leurs TSS et leur TES et +/-10 Ko en amont ou en aval montre (Figure 4 b) cette pics de H3K79me2 autour de la TSS et diminue vers le TES en général. Il y a des gènes qui sont complètement recouvertes de H3K79me2, et les gènes qui ont un sommet uniquement dans la région de TSS. Endoplasmatic-contrainte connexe de gènes tels Atf4, Ddit3 et le port de Npm1 nucleophosmin, par exemple, un haut niveau de H3K79me2 à la TSS, qui est seulement légèrement diminué le long du corps entier de gène (Figure 4). En revanche, Scd1 possède une faible occupation H3K79me2 TSS et aucun H3K79me2 dans le corps de gène. Atf3 un dernier exemple possède différents forte et faibles à niveau pics H3K79me2 le long du corps de gène.

Figure 1
Figure 1 : schéma du protocole H3K79me2 puce d’isolé SCD ou CGNPs et diagramme d’analyse de la séquence. (A) vue d’ensemble du protocole présenté. Pour l’isolation de la CPC, premier E14.5 cerveau sera isolé et le cortex peut être divisé en DT et VT, si nécessaire. Pour CGNPs, cerebelli doit être Récupérée de souris P5-P7. Le tissu sera homogénéisé, les progéniteurs séparés, et puis les cellules peuvent être cultivées et traitées par un inhibiteur approprié ou directement utilisés pour la puce. Pour la puce, la fixation de la chromatine est suivie de cisaillement et immunoprécipitation avec un anticorps anti-H3K79me2 et les IgG de lapin comme contrôle. Après la purification de l’ADN, échantillons peuvent être analysés par séquençage et préparation de la bibliothèque ou peuvent être analysés par l’intermédiaire de qPCR. Exemples (B) de la chromatine de qualité appropriés et inappropriés. La distribution de fragment d’ADN est montrée dans bp. (C) ChIP-seq résultats peuvent être soumis à un pipeline d’analyse sur le serveur de Freiburg/Galaxy. Après un contrôle de la qualité (FastQC), les lectures peuvent être garnis de TrimGalore et puis mappés via Bowtie2 sur le génome de la souris (dans le cas présenté mm9). PlotFingerprint évalue la qualité de la puce. Pour définir des pics H3K79me2, les MACSpeaks peuvent être appliqués. Normalisation BamCoverage et pour les comparer avec le BamCompare d’entrée sont utilisables. Pour visualiser les résultats IGV navigateur et heatmaps sont appropriés. Fichiers-formats attendus sont indiqués en italique. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : culture des progéniteurs corticales et l’inhibition de la DOT1L. (A) par immunoblot présentaient des niveaux de H3K79me2 dans la CPC à E14.5 après inhibition de DOT1L pendant 3 jours (jour 3, n = 3-11) en comparaison avec le contrôle de DMSO. H3, GAPDH et tubuline alpha ont été utilisés comme contrôles de chargement. (B) immunocytologique coloration d’une culture CPC à jours 2 et 3. Activer la Caspase 3 (CASP3 vert)-positive de cellules et neurones (HuC/D: rouge) ont été colorés. DAPI (bleu) a été utilisé pour visualiser des noyaux cellulaires. Echelle : 100 µm. Quantification (C) de l’immunostainings présentée au point B. Le rapport des cellules positives pour CASP3 + / DAPI + ou HuC/D + / DAPI + en pourcentage est donnée. Pour l’analyse statistique, t-tests de l’étudiant non-appariés ont été effectués. p < 0,01 **. Ce chiffre a été modifié de Roidl et al. 33 , 38 S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : H3K79me2 ChIP-qPCR de Aft4, Ddit3, Aft3, Scd1 et Npm1 de CPCs traités par inhibiteur de la DOT1L. (A) dérivés E14.5 CPC ont été traités par inhibiteur de DOT1L 5 µM 4-5 h après l’isolement et une deuxième fois au jour 2 dans la culture. Les CPC ont été fixées au jour 3, qui a été suivie de l’extraction de la chromatine, expérience de la puce et qPCR. Résultats sont représentés comme le % de moyenne (+/-SEM) entrée (n = 3). IgG a été utilisée comme contrôle négatif. La moyenne de l’IgG est représentée en pointillé. Pour l’analyse statistique, analyse de variance bidirectionnelle a été appliqué. p < 005 * ; p < 0,01 **, p < 0,001 *** ; Site d’initiation transcriptionnelle de TSS, TES transcription fin site. Ce chiffre a été modifié de Roidl et al. 33 , 38 S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : vue d’ensemble de l’analyse H3K79me2 ChIP-seq. (A) d’empreintes digitales de H3K79me2 ChIP-seq de SCD E14.5 dérivé par rapport à l’entrée montre un enrichissement des fragments d’ADN de H3K79me2 assurant une haute qualité de ChIP-seq. (B) H3K79me2 ChIP-seq résultats tracés dans une heatmap. Fortement enrichi des régions génomiques sont présentées en bleu. Mise à l’échelle de 0 (rouge foncé) - 45 (bleu foncé). H3K79me2 pics près du TSS et diminue dans le sens de 3´ à TES. (C) H3K79me2 ChIP-seq lectures étaient mappés au génome mm9 et visualisés à l’aide de la visionneuse de génomique intégrative (IGV). L’occupation de la H3K79me2 d’un gène est affichée comme log2 du nombre de lectures de ratio entre la puce et lectures d’entrée par kilobases par million (Scaling : 09:50). Structure des gènes RefSeq est représenté tandis qu’une boîte rouge indique le premier exon, y compris la TSS. Les gènes Aft4, Ddit3, Scd1, Aft3 et Npm1 apparaissent. Pour comparaison, un signal de H3K4me3 de la même région génomique est affiché. Site d’initiation transcriptionnelle de TSS, TES transcription fin site. Ce chiffre a été modifié de Roidl38. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Gène Région Primer avant 5' - 3' Apprêt inverse 5' - 3'
Aft4 TSS GGACGATCTCTAACGCCACA GCCCTAAACCCGCCCTTTAT
Aft4 TSS + 1500 CTCCCGAATATGACATGAACCG TCCATTCGAAACAGAGCATCG
Aft4 TES CCGTAATAGGGTAGTCAGGTGC AAAGAATGACACTGAAAACCCACA
Ddit3 TSS GTACTGGCTCCGTCTAACCC CAAGAGAGGGCCTGTAAGCA
Ddit3 TSS + 2500 TCAAGCAGCCGGTCTCATAG CTCAGATCCCCCAATGGCTT
Ddit3 TSS + 4500 GAGCTGGAAGCCTGGTATGA TCACCTCTTCGTTTCCTGGG
Ddit3 TES CACCAAGCATGAACAGTGGG GTACCGTCTATGTGCAAGCC
Aft3 TSS AACTGAGAGCGCAACTCCTC GCTGCCGTTCTTAGCTGGTA
Aft3 TES CTGTTGGCACAAAGTGGCTC GGGATCTGCCATGGTGGAAA
Scd1 TSS TAGTGACCACACACAAAAGCTC CCCAAGTGTAATTTGGATGATTTCC
Npm1 TSS TCCCCCTCCAGTCAGTTACC CGTCCTTTCCTTGGCGTGA
Npm1 TES AGGGACATACTTAAGACAAGCCAG AGGATTGAGGCAGACTGTCAAT
TSS : site d’initiation transcriptionnelle
TES : site de transcription fin

Tableau 1 : Liste des amorces utilisées pour puce-qPCR.

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Discussion

Il y a deux façons principales pour effectuer l’immunoprécipitation de la chromatine pour détecter l’occupation génomique des modifications d’histone, facteurs de transcription, lecteurs de code histone, écrivains ou gommes à effacer. On est la méthode native de la puce à l’aide de nucléase digérée, chromatine native pour l’immunoprécipitation, et l’autre est la méthode présentée à l’aide de la chromatine PFA-fixes et cisaillée, dans lequel les nucléosomes et autres protéines ADN-attaché covalente à l’ADN 39. native puce avec son taux de détection des anticorps élevés devraient être applicable pour la méthylation des histones depuis la chromatine et méthylations de l’histone sont relativement stables tout au long de la puce. Mais puisqu’il faut une grande quantité de matière première, il n’est pas applicable pour l’étude du développement cortical ou cérébelleux, où le nombre de cellules du cerveau de souris est généralement limité. Bien que les anticorps sont généralement élevés contre la matière non fixée, nous pourrions prouver que l’anticorps détecte précisément H3K79me2 depuis une inhibition spécifique de la DOT1L conduit à un signal de H3K79me2 une diminution dans l’analyse de la puce-qPCR et en immuno-Blot (Figure 2 a et Figure 3 a). Puce en utilisant le matériau réticulé peut être inefficace, mais le protocole présenté garantit des matières assez spécifiquement enrichi pour qPCR et analyse de la séquence.

Pour une puce efficace, la concentration du tampon de lyse SDS peut être cruciale, étant donné que le SDS dénature les protéines et les rend accessibles aux anticorps. Cette fonctionnalité est particulièrement importante pour les H3K79me2, qui est une modification d’histone située dans le domaine globulaire de l’histone 3 et dans le cœur du nucléosome de chromatine, plus petite unité22. Ainsi, pour H3K79me2, une concentration plus élevée de SDS (environ 0,3 % p/v) au cours de l’essai est nécessaire pour assurer l’accessibilité de l’antigene optimale. Avec cette concentration de SDS, nous pourrions très enrichir H3K79me2 IgG contrôles (Figure 3) et entrée (Figure 4). Ainsi, la qualité de la puce-matériel pour le séquençage était appropriée et l’enrichissement sur entrée comparable à celle de H3K4me3 (Figure 4). Nous prévoyons qu’il faudrait la même concentration de SDS pour puce de marque mono ou triméthylation de H3K79. En général, plus rigoureux le tampon de la puce est, les fragments de chromatine moins faux-positifs sont immunoprécipitée, si la qualité de l’anticorps n’est pas affectée par le détergent utilisé. Pour l’avenir, il pourrait être possible d’appliquer le protocole présenté d’autres modifications d’histone au sein du domaine globulaire des histones.

Si les anticorps sont aptes à puce et sont stables à des concentrations plus élevées de détergent, le protocole contient principalement deux étapes cruciales. Tout d’abord, la fixation des cellules et la tonte ultérieure de la chromatine doivent être optimisés pour chaque type de cellule et chaque ultrasonicator. Réticulation prolongée conduit à des artefacts de fixation et peut réduire le taux de détection d’anticorps puisque les antigènes peuvent être masqués. La tonte de la chromatine nécessaires pour conduire une distribution de la taille de l’ADN entre 200 et 500 bp (Figure 1 b). Nucléosomes contient 147 bp d’ADN. Des fragments de chromatine qui sont trop longues conduira à des résultats faussement positifs en y. Lors du séquençage du génome, une distribution de taille incorrecte donnera lieu à des résultats faussement négatifs, estimant souvent que de petits fragments. La deuxième étape critique est la préparation de la bibliothèque pour le séquençage du génome entier. Une étape d’amplification de l’ADN doit être effectuée à l’aide de 6 à 9 cycles de PCR. En évitant de nombreux cycles de PCR est essentiel, car ils peuvent conduire à un biais de GC élevé et de nombreux doublons PCR. Avec le protocole présenté, suffisamment d’ADN peut être récupérée pour maintenir le nombre de cycles PCR nécessaires faible.

Le tissu cérébral est constitué d’une quantité très variée de types de cellules comme les neurones, les oligodendrocytes et les cellules gliales cellules4. Au cours du développement, ces cellules dérivent des cellules souches neurales et construisent des zones spécifiques du cerveau en fonction du temps et de lieu façon3. Neurogenèse du cortex cérébral, par exemple, prend place entre E11.5 et E18.5 chez la souris. À des stades antérieurs tels que E11.5 et E12.5 presque toutes les cellules ont des progéniteurs identité1, mais diversité cellulaire par la suite devra être prise en compte. Par conséquent, un morceau de tissu cortical à E14.5 peut révéler H3K79me2 ou toute autre modification d’histone à ce point de temps spécifiques mais ne peut pas afficher des fonctionnalités spécifiques de chromatine cellulaire-type. Ce problème peut être résolu par un enrichissement de cellules spécifiques avec cellule activée par Fluorescence triant (FACS) ou magnétique activé tri (tri des MaCS)40, qui n’est possible après homogénéisation du cerveau. Avec Tri des MaCS transportant des marqueurs de surface cellulaire spécifique des cellules progénitrices neurales peuvent être étiquetés avec billes magnétiques et ensuite isolement à l’aide d’un support magnétique40. Par la suite les cellules peuvent être cultivées ou utilisées directement pour la puce. Le protocole présenté peut être utilisé non seulement pour des cellules progénitrices neurales, mais aussi d’autres populations cellulaires homogènes. Avec ajout de FACS ou MaCS, le protocole peut être appliqué pour toutes les cellules isolable dans un organisme.

Pris ensemble, le protocole présenté permet d’enquêter sur la modification des histones H3K79me2 à différents moments du développement cortical et cérébelleux de manière efficace et reproductible. Il peut s’appliquer à d’autres modifications d’histone situées dans le cœur de l’histone et peut être appliqué à d’autres types de cellules homogènes au sein de l’organisme. H3K79me2 étant une histone conservée modification23, le protocole peut-être également être adapté pour analyser H3K79me2 non seulement chez les souris, mais aussi à travers les différentes espèces.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes

Acknowledgments

Nous remercions Henriette Bertemes pour aider à l’établissement du protocole de culture CGN au sein du laboratoire. Ce livre de la méthode était soutenu par l’épigénétique financés par le DFG CRC992 médicale en finançant à la télévision. Les auteurs tiennent à souligner le soutien de l’équipe de galaxie de Freiburg : Pavankumar Videm, Björn Grüning et Prof. Rolf Backofen, bioinformatique, Université de Freiburg, en Allemagne, financé par Collaborative Research Centre 992 médical épigénétique (subvention DFG SFB/992/1 2012) et ministère fédéral allemand de l’éducation et la recherche (BMBF subvention 031 A538A RBC (de. NBI)).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-GAPDH Abcam ab8245 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:5000
Anti-H3 Abcam ab1791 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:3000
Anti-H3K79me2 Diagenode pAb-051-050 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: ChIP antibody
Anti-H3K79me2 Abcam ab-051-050 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:1000
Anti-rabbit-IgG Diagenode C15410206 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: ChIP Ctrl antibody
Anti-Tubulin alpha Abcam ab108629 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:3000
Apo-Transferrin (1 mg/ml) Sigma-Aldrich T1147 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
B27 Supplement (50x) Life Technologies 17504044 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
Bioanalyzer Agilent technologies G2940CA Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For analysis of sheared chromatin
Bioruptor NextGen Diagenode B01020001 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: Ultrasonicator
Boric acid pH 8.4 Sigma Aldrich B6768 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC culturing
CFX Connect RT PCR Detection System Bio-Rad 1855201 Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Detection system for qPCR
DMEM-F12 Life Technologies 11320-033 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGM
Dynabeads Protein A Invitrogen 10001D Category: ChIP
Abbreviation/Comment: Magnetic beads, for ChIP
EPZ-5676 Selleckchem S7062 Category: DOT1L inhibition
Abbreviation/Comment: For DOT1L inhibition in cell culture
Ethylenediamine tetraacetic acid SERVA 39760.01 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: EDTA
Fetal Bovine Serum 10% (v/v) Gibco 10082147 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC isolation and CGM
Glucose Sigma-Aldrich G5767 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGNP isolation
Glutathione (1.25 mg/ml) Sigma-Aldrich G4251 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
Glycine Carl Roth 3187 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For cell fixation
GoTaq mastermix Promega A6002 Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: DNA polymerase master mix for qPCR
Hank’s Balanced Salt Solution Life Technologies 14025-100 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: HBSS
L-glutamine (200 mM) Life Technologies 25030081 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
Laminin Sigma-Aldrich L2020 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC culturing
Lithium chloride Sigma-Aldrich L4408 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: LiCl
N2 supplement Life Technologies 17502048 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGM
NanoDrop 3300 Thermo Fisher 3300 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: Fluorospectrometer for DNA quantification
NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina NEB E7645S Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Kit for Library preparation
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina NEB E7335 Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Oligos for Library preparation
Neurobasal medium Gibco 21103049 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
NP-40 Alternative Calbiochem 492016 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP buffer
Paraformaldehyde Carl Roth 335 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: PFA, for cell fixation
Penicillin-Streptomycin-Neomycin 1% (v/v) Life Technologies 15640055 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: PSN, for CCM and CGM
Phosphate buffered saline Life Technologies 10010023 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: PBS, for CPC isolation
PicoGreen Kit Thermo Fisher P11496 Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Visualizing dye for DNA quantification
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P6407 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGNP isolation
Poly-L-ornithine hydrobromide Sigma Aldrich P3655 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC culturing
Potassium chloride Thermo Fisher AM9640G Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: KCl, for CGM
Protease inhibitor Roche 4693159001 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP
Proteinase K Sigma-Aldrich 3115879001 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP
Qiagen MinElute Qiagen 28004 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: Kit for DNA purification
RNAse Sigma-Aldrich R6513 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP
SGC0946 Selleckchem S7079 Category: DOT1L inhibition
Abbreviation/Comment: For DOT1L inhibition in cell culture
Sodium bicarbonate Carl Roth 8551.1 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: for Elution buffer
Sodium chloride Carl Roth 9265 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: NaCl, for ChIP buffer
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich 30970 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP
Sodium dodecylsulfate Carl Roth 183 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: SDS, for ChIP
Sonic hedgehock (SHH) Sigma-Aldrich SRP6004 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGNP isolation
Superoxide dismutase (1mg/ml) Sigma-Aldrich S7571 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Carl Roth 9090 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: TRIS, for ChIP buffer
Triton X-100 Carl Roth X100 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP buffer
Trypsin-EDTA 0,05% (w/v) Sigma Aldrich 59417C Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC isolation
Tween20 Carl Roth 28320 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For bead preparation
Other Lab devices: Neubauer counting chamber, Incubator, Rotator, Shaker, Disection set, Water bath
CCM: Cortical cell medium
CGM: CGNP cell culture medium

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References

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Neurosciences numéro 131 culture cellulaire cérébelleux culture de cellules corticales développement du cortex développement cérébelleux méthylation de l’H3K79 DOT1L puce inhibition de la DOT1L
Isolement et culture des progéniteurs neurones suivie par immunoprécipitation de la chromatine de marque d’Histone 3 Lysine 79 MBD
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Bovio, P., Roidl, D., Heidrich, S.,… More

Bovio, P., Roidl, D., Heidrich, S., Vogel, T., Franz, H. Isolation and Cultivation of Neural Progenitors Followed by Chromatin-Immunoprecipitation of Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark. J. Vis. Exp. (131), e56631, doi:10.3791/56631 (2018).

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