Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

בידוד, טיפוח של אבות עצבית ואחריו Immunoprecipitation-כרומטין של היסטון 3 ליזין 79 Dimethylation מארק

Published: January 26, 2018 doi: 10.3791/56631
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1
1Institute for Anatomy and Cell Biology, Department of Molecular Embryology, Faculty of Medicine, University of Freiburg, 2Faculty of Biology, University of Freiburg

Summary

אנו מציגים שיטה לשחזור ויעילים כדי לבודד את תרבות ובתאים עצבית של רקמת מוח עובריים ופוסט עבור immunoprecipitation כרומטין (ChIP) של היסטון 3 ליזין 79 dimethylation (H3K79me2) - סימן היסטון ממוקם במרחק תחום הכדוריים של היסטון 3.

Abstract

התפתחות המוח הוא תהליך מורכב, שבשליטת באופן מרחבי בעיות מפרק מעברי צבע של אורגניזם ותוכניות תעתיק שונה. בנוסף, שינויים epigenetic כרומטין, כמו היסטון מתילציה, יש תפקיד חשוב עבור ביסוס ושמירה על גורלם תא ספציפי בתוך התהליך הזה. הרוב המכריע של היסטון מתילציה מתרחשת על הזנב היסטון גמיש, הנגיש מכפילי היסטון, מחקים של חלבונים קורא היסטון. לעומת זאת, H3K79 מתילציה ממוקם בתחום הכדוריים היסטון 3, הייתה שם בפונקציות התפתחותיים שונים. מתילציה H3K79 אבולוציונית כולו, ניתן למצוא מגוון רחב של מינים של הומו ספיינס כדי האפייה. השינוי מתרחש בקרב אוכלוסיות תאים שונים בתוך אורגניזמים, כולל אבות עצבית. המיקום של מתילציה H3K79 בתחום הכדוריים של היסטון 3 מקשה להעריך. כאן, אנו מציגים שיטות כדי לבודד, קדמון קורטיקלית התרבות תאים (CPCs) של רקמת מוח קליפתי עובריים (E11.5-E14.5) או אסטרוציטומה נוירון פרטנית אבות (CGNPs) מרקמות כמחנכת (P5-P7), וכדי ביעילות immunoprecipitate H3K79me2 עבור ה-PCR כמותי (qPCR) ורצף הגנום כולו.

Introduction

הפונקציות חושית, מוטורי, קוגניטיבי של המוח הם מורכבים מאוד רגישים לשינויים פיזיים וסביבתיים. המוח מורכב שלושה חלקים כללי הינד-, אמצע, הקדמי, אשר מחוברים עמוקות. בתוך הקדמי, ניתן לחלק את telencephalon של telencephalon הגבי (DT), של telencephalon הגחוני (וי טי). DT של עכברים מורכב שש שכבות קורטיקלית אשר נוצרים בין E11.5 לבין E18.5 אופן "הפוכה"1. VT כולל את הרוחביים ganglionic בפיתוח, המהווים את2,של גרעיני הבסיס3מאוחר יותר. מספר סוגי תאים יכולים להיות מסווגים במערכת העצבים המרכזית יונקים כמו נוירונים, האסטרוציטים או oligodendrocytes להפוך4, אשר להתפתח באופן מרחבי בעיות מפרק5. קודם כל, עצבי ובתאים (NPCs) להצמיח סוגים שונים של נוירונים, interneurons VT ולאחר ההקרנה נוירונים ב- DT, ובהמשך תאי גליה (למשל, האסטרוציטים6). במהלך פיתוח קורטיקלית, השכבה השטחית ביותר (שכבה אני), אשר מכיל תאים Cajal Retzius, נוצר לראשונה. לאחר מכן, בין E12.5 ו E14.5, NPCs צור עצביים לשכבות העמוקות (השישי, V) בזמן בין 14.5, 16.5, אבות להצמיח השכבה העליונה (IV-II) נוירונים7,8. זהות עצביים צוין על ידי מורפוגן-induced בעיות מפרק מרחבי תעתיק תוכניות שונות, בנוסף על-ידי תוכניות epigenetic2.

המוח הקטן, אשר הוא מעורב קואורדינציה, ממוקם על hindbrain ומפתחת בין E10 בערך P20 עכברים9. הוא מכיל קליפת אסטרוציטומה ואת הגרעינים אסטרוציטומה10. קליפת אסטרוציטומה למבוגרים מורכב משלוש שכבות, שבהפסד מולקולרית, השכבה Purkinje תא, השכבה הפנימית ביותר פרטנית המכיל נוירונים פרטנית10. התאים גרגר אסטרוציטומה הנוירונים הקטן ביותר, מייצגים כ- 80% של הנוירונים בכל המוח חוליות11. להתפתח סימנים מקדימים ממוקם באזור נבטי חיצוניים והם נודדים דרך השכבה Purkinje תא היעד שלהם12. כמו ב- telencephalon, ההתפתחות של הצרבלום מוסדר על ידי אורגניזם חשוב מספר, אשר יש פונקציות ספציפיות זמן-מרחב ותלוי וליזום תוכניות תעתיק10מוגדרים.

הפיתוח של שכבות קורטיקליים ו אסטרוציטומה נשלטת על ידי ביטוי גנים ברמת השעתוק של אורגניזם מסוים ועל, לכן, ידי המדינה כרומטין של ה-DNA. בתצוגה פשוטה, כרומטין הברית יכולה להיות מחולקת euchromatin כפעיל transcriptionally הטרוכרומטין כמו אזורים שקטים transcriptionally. נוקלאוזום היחידה הבסיסית של כרומטין מכיל שני עותקים של כל היסטון הליבה H2A, ויזת עבודה H2B, H3 ו- H4, מוקף 147 בסיסי זוגות של הדנ א13. שינויים היסטוניים עוברות שינוי מאוד post-translationally על ידי מתילציה, acetylation, זרחון, ubiquitination, sumoylation, ADP-ribosylation, דיאמינציה פרולין isomerization14,15. היסטון ליזין מתילציה נחשב השינוי היסטון היציב ביותר ששולטת שעתוק, שכפול, רקומבינציה16, נזק לדנ א תגובה17, ו החתמה גנומית18. Lysines יכול להיות מונו, di- או תלת-מפוגל19 , מופיעים לא רק על זנבות היסטון נגיש, אלא גם בתוך תחום הכדוריים של שינויים היסטוניים20. Methylations ספציפי ב H3K4 ו H3K36 קשורים בעיקר עם euchromatin, methylations מסוים H3K9, H3K27 או H4K20 מצויים בעיקר באזורים heterochromatic, למרות כל שאריות ממוקמים בתוך הזנב היסטון14, 19,21. מתילציה H3K79 הינו ממוקם בתוך תחום הכדוריים היסטון, שויכה פעילות גנים ברמת השעתוק, אבל גם עם אזורים גנומית אינרטי transcriptionally22. השינוי אבולוציונית כולו מאז זה נצפתה שמרים, התימוס עגל, עוף ו האנושי23. מונו H3K79 di, trimethylation (H3K79me1, me2, me3) הם מזורז על ידי24,methyltransferases DOT1L25 היסטון גרעיני להגדיר תחום המכיל חלבון 2 (Nsd2)26. DOT1L הייתה שם התפשטות, DNA לתקן ו סלולריים reprograming27. אובדן Dot1l בעכברים מוביל למוות טרום לידתי סביב28,E10.529שלב התפתחותי. במהלך התפתחות הלב, בידול myocardiocyte, DOT1L חיוני עבור ג'ין ביטוי תקנה30. במערכת העצבים המרכזית, פונקציה DOT1L עשוי להיות מעורב בשפופרת פגמים בתעלה פיתוח31, מעורב בדיכוי Tbr1-ביטוי במהלך פיתוח הקדמי32, עשוי לתפקד בוויסות של ER-מתח התגובה הגנים33. תלויי-הקשר הפעלה או המדחיק הפעולה של H3K79me, במיוחד עם ויוו מצבים כמו הפיתוח של מערכת העצבים המרכזית, הוא תאריך רק חלקית הבין32. מאז H3K79 מתילציה ממוקם בתחום הכדוריים היסטון 3, זה sterically פחות נגיש לעומת שינויים על זנבות היסטון גמיש23. כדי להבין את תפקוד H3K79 מתילציה, דרושות שיטות ניתוח לשחזור ואמין כדי לקבוע את מיקום שלה ואת הסביבה גנומית. שיטות העבודה אנו מציגים שיטות בידוד של אבות עצביות שונות (CPCs של קליפת המוח) ו- CGNPs עבור המוח הקטן, טיפול יעיל של מעכבי DOT1L שיטה שבב לנתח מתילציה H3K79 דרך qPCR או רצף זמן שונים נקודות במהלך הפיתוח קורטיקליים ו אסטרוציטומה. לקבלת מבט כולל על הפרוטוקול והאפשרויות שלה, ראה איור 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

רווחת בעלי חיים ועדות של אוניברסיטת פרייבורג, רשויות מקומיות אישר כל ניסויים בבעלי חיים (G12/13, G16/11) מצויה בפרוטוקול הבא.

1. תכשירים

  1. ההכנות CPCs בידוד
    1. להגדיר מתוזמן ההזדווגות, כדי להשיג את העוברים בשלבים שונים של התפתחות קליפת המוח (בין E11.5 ו E14.5). השתמש עכברים של המתח NMRI (מכון מחקר רפואי חיל הים) אשר לפחות בן 8 שבועות. לאחר ההזדווגות, שקול פקק הנרתיק חיובי ב- E0.5.
    2. יש מספיק חומר, השתמש המלטה אחת של עכברים NMRI עבור שבב אחד H3K79me2 של cortices של E12.5 או E14.5. עבור מאוחר יותר העובריים, השתמש המלטה אחת עבור ניתוחים שבב נוסף (המלטה הגודל NMRI הממוצע: 10 עוברי).
    3. Precool Hank´s מאוזנת מלח פתרון (HBSS), באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) עד 4 ° C (לאחסון לטווח ארוך ב RT).
    4. Equilibrate 4 ° C המאוחסן טריפסין-EDTA (0.05% w/v) ל- 37 מעלות צלזיוס.
    5. הכן תאים קורטיקליים בינוני (CCM): תוספת האמצעי עבור נוירונים (ראה טבלה של חומרים) עם ריכוזים הסופי של תוספת של 2% (v/v) B-27, 5 µg/mL Apo-Transferrin, 1 µg/mL גלוטתיון, 0.5 מ מגלוטמין, µg 0.8/mL סופראוקסיד דיסמוטאז ו- 1% (v/v) פניצילין-סטרפטומיצין-Neomycin תערובת לאנטיביוטיקה. אחסן אותו ב 4 º C. לניסוי, equilibrate של המדיום כדי 37 מעלות צלזיוס.
    6. הפשרת סרום עגל עוברית (FCS), aliquot אותו (50 מ ל כל אחד), ו equilibrate aliquot אחד 37 מעלות (לאחסון לטווח ארוך ב-20 ° C).
    7. להכין מניות של 1 DNAse (10 מ"ג/מ"ל) ב- H2O תרבית תאים. חנות aliquots ב-20 ° C.
    8. אם יש צורך, להמיס ספציפי מעכבי DOT1L EPZ-5676 או SGC0946 ב דימתיל סולפוקסיד כדי ריכוז מניות של 100 מ מ. חלות של הריכוז בסוף של 1-5 מיקרומטר התאים ביום 0 והחלה המדכא כל יומיים.
    9. לטיפוח עלות לקליק, מעיל תא תרבות צלחות (טוב 6 או 12 טוב) עם מנות פולי-L-ornithine (1 מ"ג/מ"ל ב- pH פנמיות 150 מ מ 8.4) במשך לפחות שעה-RT ואחר כך עם laminin (1 מ"ג/מ"ל) CCM בינוני ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  2. ההכנות CGNP בידוד
    1. לארגן את הזיווג המתאים של עכברים ליצירת חיות P5-P7 בידוד של הצרבלום (3-5 בעלי חיים לכל שבב ותנאי).
    2. להכין HBSS/גלוקוז על-ידי הוספת 6 מ"ג/מ"ל גלוקוז למאגר HBSS.
    3. להכין את המדיום תרבות תא CGNP (CGM) על-ידי הוספת תוספת של 1% (v/v) N2, 1% (v/v) פניצילין-סטרפטומיצין-Neomycin, 25 מ מ של FCS אשלגן ו-10% ל- DMEM-F12. לטיפוח CGNP להכין CGM בינונית ללא FCS אבל כולל µg/mL 0.6 סוניק הקיפוד (ששש) (CGM-ששש), equilibrate אותו ל- C ° 37 בעת הצורך.
    4. מעיל תא. ובכן 6 צלחות תרבות עם 100 µg/mL פולי-D-ליזין עבור h 1-2-RT להסרת תאים עכשיו, דונלד. לאחר מכן לשטוף פעמיים עם ddH סטרילי2O ולתת את הצלחות יבש. חנות את הלוחיות לשבוע אחד מרבי-4 מעלות צלזיוס.
    5. קומפלקסים CGNPs מעיל 6-ובכן תא תרבות צלחות עם פולי-L-ornithine (0.1 מ"ג/מ"ל) ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לאחר מכן לשטוף פעמיים עם H2O תרבית תאים ולתת את הצלחות יבש.
      הערה: הלוחות ניתן לאחסן במשך שבוע אחד מרבי-4 מעלות צלזיוס.
    6. להכין 0.025% טריפסין (w/v) ב- HBSS/גלוקוז, equilibrate אותו ל- C ° 37 בעת הצורך.
  3. ההכנות שבב של H3K79me2
    1. להכין מחברים (1% ב- PBS, pH 8) טרי לפני crosslinking כרומטין. כדי להכין PFA מחממים 50 מ ל PBS במיקרוגל ל מרבי 65 ° C. במהלך בחישה מתמדת להוסיף 0.5 מ ג כדורגלן טוב, מגניב. לאחר מכן להוסיף 50 µL 10 M NaOH, חכה עד PFA היא התפרקה. לאחר מכן, להוסיף 42.5 µL HCl (37% v/v) כדי לקבל pH של 8. בדוק שוב את ה-pH ולהגיע מכן לאפשר הפתרון PFA 1% RT.
    2. הכנת המלאי של RNase (1 מ"ג/מ"ל), Proteinase K (20 µg/µL) סטרילי ddH בנפרד בתוך2O. לאחסן את aliquots ב-20 ° C.
    3. להכין את מאגרי הבאות ואת ריאגנטים: PBS המכיל 0.02% Tween, פירוק מאגר, גליצין, מאגר דילול, צ'יפ מאגר 1, שבב מאגר 2, שבב מאגר 3 ו- TE מאגר ואחסן אותם ב 4 º C. הכנת המאגר • תנאי טרי בכל פעם.
      1. להכין PBS המכיל 0.02% Tween. החנות עבור רוב שבוע ב 4 º C.
      2. להכין מאגר פירוק באמצעות 50 מ"מ טריס ב pH 8.0, 10 מ מ EDTA, dodecyl 1% (w/v) נתרן גופרתי (מרחביות) ו 1 x מעכב פרוטאז.
      3. להכין גליצין 2.5 מטר.
      4. להכין מאגר דילול באמצעות 20 מ מ טריס ב- pH 8.0, 150 מ מ NaCl, 2 מ מ EDTA, 1% (v/v) טריטון X-100 0.25% (w/v) מרחביות, 1 x מעכב פרוטאז.
      5. להכין מאגר שבב 1 באמצעות 20 מ מ טריס ב- pH 8.0, 150 מ מ NaCl, 2 מ מ EDTA, 1% (v/v) טריטון X-100, 0.2% (w/v) מרחביות.
      6. להכין מאגר שבב 2 באמצעות 20 מ מ טריס pH 8.0, 500 מ מ NaCl, 2 מ מ EDTA, 1% (v/v) טריטון X-100, 0.2% (w/v) מרחביות.
      7. להכין את השבב מאגר 3 באמצעות 20 מ מ טריס pH 8.0, 250 מ מ LiCl, 2 מ מ EDTA, 1% (v/v) NP-40 ו- 1% (w/v) מרחביות.
      8. להכין מאגר טה באמצעות 20 מ מ טריס pH 8.0 ו- 2 מ מ EDTA.
      9. להכין טרי • תנאי מאגר המכיל 1% (w/v) מרחביות, 100 מ מ NaHCO3.

2. העצבית קדמון בידוד של רקמת המוח

  1. בידוד וטיפוח אופציונלי של CPCs
    1. המתת חסד החיות בהריון מאת נקע בצוואר הרחם ולהעביר את העוברים HBSS קר כקרח.
    2. אסיר את הגולגולת במספריים לבודד את המוח ואז להסיר את קרומי המוח, במידת הצורך, עם מלקחיים קטנים, ולבודד cortices (שלם, DT או VT) של שתי ההמיספרות על-ידי הסרת כל חלקים אחרים במוח מתחת למיקרוסקופ המשקפת באמצעות מלקחיים קטנים, וכן, אם הצורך, קטנים מספריים. לאחסן את cortices מבודדים במאגר HBSS מ ב 4 ° C בשפופרת 15 מ"ל.
    3. Centrifuge את החומר המוח מבודדים עבור 5 דקות ב 1,000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס.
    4. לשטוף את cortices עם 5 מ"ל HBSS קר כקרח, homogenize אותם עם טיפ פיפטה 1 מ"ל על-ידי pipetting למעלה ולמטה. במידת הצורך, חותכים את קצה קצה פיפטה.
    5. Centrifuge הדגימה homogenized במשך 5 דקות ב 1,000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס. להסיר את HBSS.
    6. להוסיף 3 מ"ל טריפסין, דגירה המדגם למשך 5 דקות ב 37 º C.
    7. להוסיף 1 מ"ל FCS, 5 מ ל CCM ו 30 µL של DNase 1 המדגם, homogenize את הדגימה עם פיפטה זכוכית 5 מ ל על-ידי pipetting בזהירות למעלה ולמטה.
    8. Centrifuge התאים מבודדים למשך 5 דקות ב 1000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס. למחוק את תגובת שיקוע, הוסף 5 מ ל CCM, homogenize את הדגימה שוב.
    9. לדלל עם aliquot של המדגם, תספור עם נויבאואר סופר-תא כמות ממוצעת של 4.5 x 106 תאים לכל העובר צפוי. קומפלקסים CPCs מבודדים המשך עם צעד 2.1.10. שבב, ומיד להמשיך את שלב 3.
    10. לטיפוח-תרגול, צלחת CPCs על פולי-L-ornithine (0.1 mg/mL) ועל laminin (1 מ"ג/מ"ל) מצופה מנות ב צפיפות בין 8 x 104 ו- 2.5 10x5 תאים/cm2 CCM בינוני, דגירה אותם ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2ו- 100% לחות יחסית.
    11. מאז CPCs להפעיל להבדיל לתוך הנוירונים בתרבית תאים (לאחר כ 4 ימים), שקול את התאריך לנתיחה כמו יום במבחנה 0 (יום 0). עבור התנאים יותר של טיפוח-תרגול, לשנות חצי של המדיום כל היום הרביעי בינונית CCM טריים.
    12. החלת 1-5 מיקרומטר SGC0946 או EPZ5676 מומס דימתיל סולפוקסיד ביום 0 (4-5 שעות לאחר בידוד תא) ולרענן אותו בכל יום שני. השתמש דימתיל סולפוקסיד כטיפול שליטה. לבדוק את היעילות של טיפול המדכא באמצעות שיטות immunoblot סטנדרטי, אם נדרש.
  2. בידוד וטיפוח אופציונלי של CGNPs
    1. המתת חסד חיות P5-7 ע י עריפת ראשו באמצעות מספריים. מסירים את העור בקרקפת, לפתוח את הגולגולת, מסירים את המוח באמצעות מספריים קטנים וחדים. לבודד את המוח הקטן, להעביר אותו HBSS הקר/גלוקוז. הסר כל קרומי המוח וכלי הדם, להעביר את cerebella 15 mL צינורות מלאים HBSS קר/גלוקוז.
    2. לשטוף את cerebella שלוש פעמים עם 10 מ"ל HBSS הקר/גלוקוז (לאסוף אותם על ידי צנטריפוגה-g x 650 עבור 5 דקות ב 4 ° C) ו homogenize cerebella לאחר מכן על ידי בעדינות pipetting למעלה ולמטה עם פיפטה 1 מ"ל (המרבי 2 - 3 פעמים) כדי לקבל 0.5-1 מ מ3 שברי.
    3. מוסיפים 5 מ של 0.025% טריפסין HBSS/גלוקוז, דגירה הרקמה תחת ערבוב מתמיד באמבט מים 37 מעלות במשך 15 דקות להפסיק תהליך העיכול על-ידי הוספת 5 מ של CGM, לאסוף את הרקמה על ידי צנטריפוגה-g x 650 עבור 5 דקות ב 4 º C.
    4. הסר את תגובת שיקוע triturate הרקמה עם טיפ pipet 1 מ"ל ב 1 מ"ל CGM, להעביר אותו צינור 15 מ"ל.
      הערה: חשוב להימנע בועות אוויר.
      1. הוסף 5 מ ב- CGM, דגירה את התערובת למשך 2 דקות על הקרח ליישב את שאריות רקמת. להעביר את תגובת שיקוע לתוך צינור 15 מ"ל. להוסיף 2 מ"ל CGM הרקמה שיורית וחזור על התהליך trituration.
    5. מאגר של supernatants (ללא שאריות רקמת, כ- 10 מ"ל סך הכל), צנטריפוגה-g x 650 עבור 5 דקות ב 4 ° C כדי לאסוף את התאים אסטרוציטומה. Resuspend בגדר ב 10 מ"ל CGM.
    6. מאז האסטרוציטים לדבוק מהר יותר וחזק פולי-D-ליזין מאשר CGNPs, לוחית רישוי התאים על 100 µg/mL פולי-D-ליזין מצופה 6-ובכן-פלטות (עד 4 מ"ל לכל טוב), תקופת דגירה של 20 דקות ב 37 ° C כדי להסיר את האסטרוציטים.
    7. לנער את הצלחת ולאסוף את תגובת שיקוע. ואז צנטריפוגה-g x 650 עבור 5 דקות ב 4 ° C בשפופרת 15 מ"ל. Resuspend בגדר ב 10 מ"ל CGM ולספור את התאים עם נויבאואר ספירת קאמרית.
      הערה: CGNPs עגולים, קטנים, ולהראות הילה כאשר צילמו באמצעות מיקרוסקופ לעומת זאת שלב.
    8. אם נדרש, הזרע התאים ב- 37 מעלות צלזיוס מראש חימם CGM על לוחות פולי-L-ornithine-מצופה (3 x 106 תאים לכל 6-טוב), דגירה אותם ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 ו- 100% לחות יחסית.
      הערה: אם לא יבוצע זריעה, להמשיך צעד 3.1.
      1. לאחר 6-12 h, חילופי המדיום כדי CGM-ששש. מתייחסים ה CGNPs 6 מבודדים (או בעת שינוי כדי CGM-ששש) לאחר בידוד עם DOT1L-מעכב, דימתיל סולפוקסיד לשלוט, לחדש אותו כל יום שני (השוואה עם 2.1.12). לבדוק את היעילות של טיפול המדכא באמצעות שיטות immunoblot רגיל אם נדרש. שבב, להמשיך עם שלב 3.3.
        הערה: עוזב CGM על הלוחות (ועם זה FBS) תגרום הבידול של CGNPs לתוך הנוירונים פרטנית אסטרוציטומה (CGNs).

3. קיבוע של תאים, הטיה של כרומטין

הערה: בצע שלבים 3.1 ו- 3.2 אם תאים לא מתורבתים, אם הם המשך לשלב 3.3.

  1. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה במשך 4 דקות ב 1,000 x g ולהוסיף 1.3 mL PBS. להעביר את הדגימה צינור 1.5 מ. צנטריפוגה במשך 4 דקות ב 1000 g x-4 מעלות צלזיוס. לשטוף את הדגימה פעמיים עם 1.3 mL PBS.
  2. שלב קריטי: הוסף 350 µL 1% PFA לדגימת דגירה זה עבור 5 דקות-22 מעלות צלזיוס. כדי להפסיק את התגובה, הוסף 18.4 גליצין µL PBS 1 מ"ל. Centrifuge לדוגמה עבור 5 דקות ב 1000 g x-4 מעלות צלזיוס.
    1. לשטוף את הדגימה פעמיים עם PBS קר כקרח. לאסוף את התאים קבוע על ידי צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 1,000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס. שומרים את הדגימות על קרח מכאן ואילך.
      הערה: הזמן קיבוע חייב להיות בדיוק 5 דקות כדי להשיג תוצאות אופטימליות. מספרי הטלפון הנייד שונים עשויים לדרוש זמן עיבודים.
  3. שלב קריטי: בתרבית CGNPs (או CPCs), להוסיף עד 1 מ ל 1% מחברים ישירות אל הבארות צלחת של התרבות תאים. לאחר דגירה 5 דקות ב 22 ° C, להוסיף כמות מספקת של גליצין ו- PBS, לקצור את התאים עם המגרד התא.
    1. להעביר את התאים לתוך צינורות 1.5 mL ו- centrifuge לדוגמה עבור 5 דקות ב 1,000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס. לשטוף את הדגימה פעמיים עם PBS קר כקרח. לאסוף את התאים קבוע על ידי צנטריפוגה עבור 5 minat 1,000 x g ב 4 º C. שומרים את הדגימות על קרח מכאן ואילך.
  4. שלב קריטי: להוסיף 700 µL של פירוק מאגר (+ מעכב פרוטאז), דגירה המדגם למשך 15 דקות ב 4 º C. מערבולת המדגם בכל 5 דק להטות את כרומטין של התאים lysed 3 x 10 דקות sonicator (30 s דופק, השהה s 30) בעוצמה המרבית.
    1. ודא כי אמצעי האחסון אינו עולה על 350 µL למחזור. מערבולת הדגימות בכל 10 דקות לבדוק את lysate עבור גרעינים הנותרים עם מיקרוסקופ שלב-ניגודיות.
      הערה: חשוב להשיג תוצאות אופטימליות ההטיה (השוואה עם איור 1B) לניתוח בשלב מאוחר יותר. במקרה של שימוש בשיטות אחרות עבור הגז של כרומטין, למטב את הטיית כדי כרומטין שברים בגודל בין 200-500 bp.
  5. גלולה תא שרידים במשך 10 דקות, 13,000 x g, 4 מעלות צלזיוס. השתמש את תגובת שיקוע על הצעד preclearing 5.2. להקפיא את הדגימה ב-20 ° C לשימוש מאוחר יותר, אם יש צורך בכך.

4. הכנת חרוזים, Preclearing

  1. לשטוף 45 µL חלבון א' מגנטי חרוזים/צ'יפ, 20 µL מגנטי חרוזים/ולטעום עם 1 מ"ל PBS קר כקרח המכיל 0.02% Tween שלוש פעמים באמצעות עמדה מגנטי. לאחר מכן, להוסיף 1 מ"ל של PBS קר כקרח החרוזים.
  2. 1 מ"ל PBS קר כקרח, חרוזים µL 45/צ'יפ, להוסיף 3 µg של נוגדן/צ'יפס (H3K79me2 או ארנב IgG). דגירה הדגימות עבור 2 h-4 מעלות צלזיוס על מסובב כדי לאגד הנוגדנים החרוזים. בהתאם הנוגדן, להשתמש נוגדנים µg ~ 3/צ'יפ.
  3. לשטוף את הנוגדן-המאוגד-החרוזים שלוש פעמים עם 1 מ"ל PBS קר כקרח המכיל 0.02% Tween. להוסיף את אמצעי האחסון המתאים חרוז (החל ףקיהב beads מגנטי משמש) ל- PBS קר כקרח שטף הנוגדן-בשילוב-החרוזים.
  4. להוסיף µL 600 דילול מאגר µL 20 של חרוזים שטף מגנטי המדגם עבור preclearing (µL הנפח הכולל 1,320), תקופת דגירה של 2 h-4 מעלות צלזיוס על מסובב. הסר את החרוזים באמצעות עמדה מגנטי. . קח 5% (33 µL) lysates כמו דגימות קלט ומקפיאים ב-20 ° C.

5. כרומטין Immunoprecipitation

  1. לחלק את תמצית precleared שני צינורות (כ 643.5 µL), להוסיף באותו אמצעי אחסון של דילול מאגר, הנוגדן-המאוגד-החרוזים (45 µL מדגם; H3K79me2 או ארנב IgG). דגירה הדגימות-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה על מסובב.
  2. לשטוף את החרוזים עם צ'יפ כקרח מאגר 1, שבב מאגר 2 שבב מאגר 3 10 דקות כל ב 4 ° C-מסובב. לאחר מכן, לשטוף שלוש פעמים עם טה המאגר עבור 5 דקות ב 4 ° C-מסובב.
  3. Elute את החרוזים עם מאגר • תנאי עבור h 1-1400 סל ד ב שייקר בטמפרטורת החדר.
  4. להוסיף 10 µg RNase (1 מ"ג/מ"ל) לכל שבב מדגם 5 µg הדגימות קלט, דגירה בדגימות למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס (1,400 סל ד).
  5. להוסיף 100 µg Proteinase K (20 µg/µL) לכל שבב µg 50 לכל קלט ולדגום, דגירה בין לילה ב 65 ° C ב- 1400 סל ד.

6. טיהור של שבב דגימות

  1. לטהר את השבב ודוגמאות קלט בטהרה ה-DNA קיט (ראה טבלה של חומרים) לפי ספר ההוראות. השתמש עמודות טיהור נוספות כאשר יותר מ 5 µg של ה-DNA הוא צפוי. Elute הדגימה עם 2 x 15 µL של המאגר • תנאי ה-DNA המסופק בערכה.
  2. לבצע כימות של הדגימות (השתמש 1 µL) על-ידי שימוש של fluorophore visualizing fluorospectrometer (ראה טבלה של חומרים).

7. ניתוח דוגמאות שבב ויה qPCR

  1. לעיצוב פריימר לניתוח qPCR, לאחזר רצף גנומית של עניין הדפדפן מציג גנומיקה אינטגרטיבית (igv ב)34. עיצוב תחל סביב האתר התחלה תעתיק (TSS) של הגן, מאז H3K79me2 סביר להניח להימצא שם. כפקד, שקול ללא קידוד גנומית אזורים או אזורים בערך 10 Kb במעלה הזרם של TSS או 10 Kb במורד הזרם של הסוף גנים ברמת השעתוק באתר (מלון טס).
    1. צור את תחל עם https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ באמצעות שגודל המוצר בין 70 ל- 200 bp של טמפרטורה אופטימלית מוגדרת מראש של 60 מעלות צלזיוס. למטרת ניסיון, השתמש תחל עבור אזורים גנומית Aft4, Ddit3, Scd1, Aft3, ו Npm1 המפורטים בטבלה1.
  2. הבדיקה תחל החדש תוכנן עם התוכנית הבאה של qPCR, מיקס מאסטר של שינוי טמפרטורה מחזק בין 58 ° C 63 ° C, ובחרו את הטמפרטורה מחזק עם המוצר ובאיכות הגבוהה.
    1. החל דנ א בג'ל לשלוט על גודל המוצר הצפוי. לניתוח qPCR, להשתמש בזמן אמת PCR לזיהוי במערכת (ראה טבלה של חומרים).
    2. הכנת המיקס הראשי באמצעות DNA פולימראז µL 10 מיקס מאסטר, פריימר µL 0.5 קדימה (10 מיקרומטר), 0.5 פריימר µL הפוכה (10 מיקרומטר), מים ללא נוקלאז µL 4 5 µL דנ א (1 ng/µL).
    3. השתמש בתוכנית qPCR 2 שלבים כדלקמן: 5 דקות ב 95 ° C, 50 x (30 s ב 95 ° C, 30 s-58 ° C - 63 ° C), ומילוי הדרגתי דנטורציה בקביעות ב 4 º C.
  3. צור סידרה דילול של דגימות דנ א גנומי, הוטו, מטוהרים (2 ng/µL, 1 ng/µL, 0.5 ng/µL, 0.25 ng/µL ו 0.125 ng/µL) ומשתמשים 5 µL בדיקת יעילות השימוש qPCR. לקבוע את השיפוע של העקומה סטנדרטי ולחשב את היעילות פריימר על ידי הנוסחה הבאה:
    יעילות (%) = (10^(-1/slope)-1) * 100.
    1. השתמש תחל עם יעילות בין 90% ל- 105% בתיק אידיאלי, או לפחות עם יעילות בין 85% ל- 115%.
  4. כדי לנתח את השבב ודוגמאות קלט, החל 0.1-1 ng של שבב ה-DNA מעורבב עם קדימה בהתאמה ומערבבים הפוכה פריימר נטול נוקלאז ומים DNA פולימראז מאסטר בנפח סופי של 20 µL עבור כל תגובה qPCR.
  5. לקבוע את הערכים מחזור (סיטי) הסף של שבב ודוגמאות קלט, לנרמל את הדגימה Ct Ct ערכים של קלט כדי לחשב העשרה (% קלט) עם הנוסחה הבאה. השימוש Ct ערכים המתקבל IgG הבקרה כדי לקבוע את רמת רקע.
    קלט % = 100-2^(− קלט norm. הנורמה. שבב)
    . נורם. קלט = Ct (קלט) − יומן2(דילול פקטור)
    . נורם. שבב = Ct (ChIP) − יומן2(דילול פקטור)
    הערה: הנורמה. = מנורמל

8. ניתוח דוגמאות שבב באמצעות רצף

  1. להעביר את הדגימות שבב (קלט ו immunoprecipitated דנ א) מתקן רצף.
  2. כדי להכין ספריית שימוש מראש, הכנה הספריה המתאימה קיט (ראה טבלה של חומרים) ולהמיר 2 ng של הקלט DNA והכל ב dna immunoprecipitated לתוך ספריות אינדקס עבור הדור הבא מגה-פלקס רצף- ציינו פלטפורמה (ראה טבלה של חומרים).
  3. שלב קריטי: בעקבות ההוראות קיט, מאתרים ומפסיקים רצף מתאמים (עם ריכוז העבודה של 15 מיקרומטר) לסיים את שברי DNA לתיקון, דה-זנב. רצף מתאמים ו- PCR תחל לשימוש המתאים oligos (ראה טבלה של חומרים). עבור סכום זה של קלט ה-DNA, להשתמש 6-9 מחזורים PCR להעשיר את שברי DNA מתאם מאתרים.
    הערה: בדרך כלל, אין צורך לבצע מבחר בגודל של ה-DNA של מתאם מאתרים. מומלץ להשתמש בכמה מחזורים PCR ככל האפשר, שכן רבים PCR הגברה תוצאה מחזורים PCR כפילויות דעה קדומה GC גבוהה.
  4. בדיקת ספריית הסופי, סעו µL 0.5 התגובה הכולל עבור ניתוח כדי להמחיש את גודל הפצה על התקן המתאים (ראה טבלה של חומרים). על כימות, השתמש צבע visualizing בשילוב עם fluorospectrometer או בשיטות אחרות (ראה טבלה של חומרים).
  5. מאז H3K79me2 שנראה שינוי היסטון, אשר משתרע בהרחבה על אזורים גדולים יותר גנומית, רצף מדגמים מזווגים-הסוף באורך קריאה של 50 bp, עם עומק רצף הקריאות Mio 75.
  6. לנתח את השבב-seq הנתונים עם השרת פרייבורג גלקסי/אוני (galaxy.uni-freiburg.de).
  7. לבצע בקרת איכות עם ChIPseq שהושג עם FastQC ו, ובמידת הצורך, למפות אותן ישירות עם Bowtie2 גירסה 2.2.035 עם או בלי חיתוך. התייחסות מכלול הגנום להשתמש mm9 או את mm10 בגירסה החדשה; כמו התייחסות ביאור Ensembl FTP לשחרר 79.
  8. אופציונלי: הסר קרא כפילויות באמצעות פיקארד MarkDuplicates (http://broadinstitute.github.io/picard) לפני שיא הביקור.
  9. לקרוא פסגות עם MACS2 גירסה 2.1.036 שימוש באפשרות 'הרחב' עבור H3K79me2.
  10. כדי לקבל יחס2 יומן השבב בין מדגם קלט, יומן2 של מספר קריאות הקריאות היחס בין שתי דגימות להשתמש BamCoverage BamCompare.
  11. עבור כל שאר שבב-seq ספציפי ניתוח מעמיק, החל deepTools2 בגירסה 2.3.5 או 2.4.137, דהיינו כדי ליצור קבצי מעקב אחר כיסוי (bamCoverage עבור השבב בלבד, bamCompare לשם השוואה של צ'יפ לכניסה), כדי לאמוד השבב ביצועים להשתמש plotFingerprint ולהשתמש ליצור סקירה כללית computeMatrix, plotHeatmap. בחר K-התכוונתי קיבוץ באשכולות במהלך תהליך computeMatrix אשכול גנומית אזורים על-פי ההתפלגות H3K79me2.
  12. שימוש לאור הנתונים שבב-seq H3K79me2 של E14.5 DT שהופקדו-NCBI למטרת ניסיון (מספר גישה: SRP057733).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ערכת כללי של קדמון העצבי בידוד, טיפוח, שבב H3K79me2 ושיטות ניתוח שבב: איור 1 מציג תרשים זרימה כדי לבצע שבב H3K79me2 של ובתאים קורטיקלית בנקודות זמן שונות במהלך התפתחות המוח עובריים או של נוירון פרטנית אסטרוציטומה אבות בשלבים כמחנכת. כצעד ראשון, המוח צריך להיות מבודד, את telencephalon (בין E11.5 ו E14.5) או המוח הקטן (P5-P7) יש לאחזר. ניתן לנתח את מחוזות שונים telencephalon על-ידי חלוקתו DT ו VT. לאחר מכן הרקמה להיות הומוגני, המוצא לאגס עצבית הפרדה. . עכשיו, זה אפשרי תרבות את ובתאים ולטפל בהם עם מעכבי DOT1L. אפשרות אחרת היא לתקן את המוצא לאגס ישירות מעמיד אותם בפני ההליך שבב. שבב, כרומטין לכסנתם לחלקים של 200-500 bp, מודגרות לאחר מכן עם מגנטי בשילוב חרוזים נוגדנים נגד H3K79me2. לאחר שטיפת החרוזים, מאחזר את ה-DNA, ניתן לנתח את הדנ א precipitated על ידי רצף או qPCR (איור 1 א'). זה חיוני יש התפלגות גודל טוב של השברים כרומטין לאחר הגז, אז רצוי לבדוק את גודל מקטע דנ א בג'ל או בשיטות אחרות (דוגמאות ב איור 1B). בעת בחירת רצף הגנום כולו, צ'יפ-seq-קורא לשכן H3K79me2 יסופק בתור קובץ fastq לצורך ניתוח נוסף (איור 1C). האיכות של הרצף קורא צריך להיות מוערך על ידי יישום של FastQC ו, במידת הצורך, fastq-הקבצים שניתן לחיתוך באמצעות TrimGalore. מיפוי מאסכאלאס הגנום mm9 או mm10 ניתן לבצע עם Bowtie2, נשלט באמצעות PlotFingerprint. מומלץ להסיר פריטים כפולים MarkDuplicates, לנרמל את הקריאות על ידי BamCoverage וכדי להשוות את השבב, דגימות קלט עם BamCompare. כתוצאה מכך, ניתן רחב ב- heatmaps או gene-wise בהפעלות הדפדפן מציג גנומיקה אינטגרטיבית (igv ב) מטמיעים הגנום קריאות שבב-seq.

ובקונגרס תרבות וניגוד DOT1L: CPCs היו מבודדים, מטופלים עם 5 מיקרומטר DOT1L מעכב SGC0946-ביום 0 וביום 2. דימתיל סולפוקסיד ממיס שימש פקד. יום 3, CPCs נקטפו, החלבונים היו מבודדים, לכמת, נותחו באמצעות immunoblot (איור 2 א). איור 2A מראה כי רמות H3K79me2 ביעילות ירד לאחר שלושה ימים של עלות לקליק culturing וניגוד DOT1L הבטחת ערכת טיפול יעיל מעכב. כמות חלבון H3, GAPDH או טובולין-אלפא הגשה לטעון פקדי ובכך לא היה לקוי. Immunostaining של CPCs קבועה עם נוגדנים נגד פעיל קספאז 3 (CASP3 +) לגילוי ואפופטוזיס ו ההיברו/יח להמחשת תאים עצביים המצוין הזה לטיפול CPCs עם מעכבי DOT1L הוביל מוות של תאים מוגברת לאחר שלושה ימים בתרבות, כפי שמוצג ב- איור 2B. כימות של התאים אשר CASP3 / דאפי + או ההיברו/D / דאפי + בתוך התרבות ובקונגרס חשף עלייה משמעותית של CASP3 + תאים חשיפת מתוכנת מוות של תאים על עיכוב DOT1L. מספר הנוירונים ההיברו D-חיובי, אולם נותרו ללא שינוי (איור 2C).

H3K79me2 שבב-qPCR של Aft4, Ddit3, Scd1, Aft3, Npm1 מן CPCs שטופלו DOT1L מעכב: כדי לבדוק אם היחס המדכא SGC0946 DOT1L היה יעיל, הובילה ירידה של H3K79me2 ב ספציפיים הגנים, ביצענו ניתוח שבב ואחריו qPCR של עלות לקליק שטופלו במשך 3 ימים. ארנב IgG שימש פקד שבב. כיוון שידוע כי H3K79me2 ממוקם endoplasmatic מתח מגיב הגנים Aft4, Ddit3, Scd1, ו Aft3 גם על הגן נשק גרעיני Npm133,38, השתמשנו תחל qPCR מכסה את TSS, את מלון טס ואזורי גנומית בתוך הגופים ג'ין כדי לקבוע הבדלים הפצה H3K79me2 לאחר עיכוב DOT1L (איור 3 א). גנים עם רמות H3K79me2 גבוהות מלכתחילה כגון Atf4, Ddit3, ו Npm1 היו היענות ביותר לטיפול מעכב כך שלושה ימים של עיכוב של DOT1L הוביל משמעותי לגרום לירידה של H3K79me2. גנים עם כיסוי H3K79me2 נמוכה יותר, כגון Atf3 ו- Scd1, לא הראה שום שינוי משמעותי ברמות H3K79me2.

ניתוח סקירה של H3K79me2 שבב-seq: ניתוח ברמת הגנום של רמות H3K79me2 CPCs מן E14.5, ולא נותחו על פי ערכות הציג את והפרוטוקולים (איור 1), גילה באיכות מאוד גבוהה שבב. ואילו ספירת נשברתי, מסודרים לפי התדר שלהם הקריאות קלט ב האבן החשופה של טביעות אצבע (איור 4A), חולקו באופן שווה, הסעיפים H3K79me2 הראה העשרה על אזורים ספציפיים (פחי מדורגת עם 1), אשר מציג מוצלח הצטברות של קטעים כרומטין שונה H3K79. Heatmap של H3K79me2 לאורך הגנים בין שלהם TSS שלהם מלון טס ו + /-10Kb במעלה או במורד הזרם מראה (איור 4B) את פסגות H3K79me2 סביב TSS וירידה לכיוון מלון טס באופן כללי. ישנם גנים, אשר יהיו מכוסים לגמרי H3K79me2, גנים, אשר יש לשיא רק בתוך האזור TSS. Endoplasmatic-לחץ הקשור גנים כגון Atf4, Ddit3, ואל הנמל Npm1 nucleophosmin, למשל, רמת H3K79me2 גבוהה-TSS, הוא רק במעט להפחתה לאורך הגוף כולו ג'ין (איור 4C). לעומת זאת, Scd1 יש תפוסה H3K79me2 נמוך את TSS, אין H3K79me2 בתוך הגוף ג'ין. Atf3 כדוגמה האחרון יש שונות נמוכה וחד ברמה H3K79me2 פיקס לאורך הגוף ג'ין.

Figure 1
איור 1: ערכה של פרוטוקול H3K79me2 שבב מבודד CPCs או CGNPs, זרימה של רצף ניתוח. מבט כולל על פרוטוקול הציג (א) . CPC בידוד, המוח E14.5 הראשון יהיה מבודד, ניתן לחלק את cortices לתוך DT VT, במידת הצורך. עבור CGNPs, cerebelli צריך יהיה מאוחזר P5-P7 עכברים. הרקמה יהיה הומוגני, המוצא לאגס הפרדה, ולאחר מכן התאים יכולים להיות תרבותי, שטופלו מעכב המתאים או ישירות משמש שבב. שבב, קיבוע כרומטין ואחריו הטיה, immunoprecipitation עם נוגדן anti-H3K79me2, ארנב IgG הפקד. לאחר הטיהור דנ א, שבב דוגמאות ניתן לנתח באמצעות ספריית והכנה רצף או ניתן לנתח אותם באמצעות qPCR. (B) דוגמאות המתאימה ובאיכות לא הולמת כרומטין. התפלגות מקטע דנ א מוצג ב- bp. (ג) ניתן יהיה נתון שבב-seq תוצאות צינור ניתוח בשרת פרייבורג/גלקסי. לאחר בקרת איכות (FastQC), עשוי להיות מעוטרת TrimGalore של קריאות ואז ממופה דרך Bowtie2 הגנום העכבר (ב mm9 המקרים הציג). PlotFingerprint מעריך את האיכות של השבב. כדי להגדיר פסגות עבור H3K79me2, MACSpeaks יכול להיות מיושם. עבור נרמול BamCoverage, בהשוואה BamCompare קלט שמישים. כדי להמחיש את התוצאות igv ב מתאימים בדפדפן וב -heatmaps. תבניות קובץ הצפוי מופיעים בכתב נטוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: תרבות קדמון קורטיקלית וניגוד DOT1L. Immunoblots (א) מראה רמות H3K79me2 עלות לקליק ב E14.5 לאחר עיכוב DOT1L במשך 3 ימים (יום 3, n = 3-11) בהשוואה הפקד דימתיל סולפוקסיד. אלפא H3, GAPDH וטובולין שימשו טעינת פקדים. (B) Immunocytological מכתים של תרבות ובקונגרס ימים 2 ו- 3. הופעל קספאז 3 (CASP3 ירוק)-חיובי תאים, נוירונים (ההיברו/d: אדום) היו מוכתמים. דאפי (כחול) שימש כדי להמחיש את גרעין התא. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. (ג) כימות immunostainings שהוצגו ב (B). היחס של תאים חיוביים עבור CASP3 / דאפי + או ההיברו/D / דאפי + אחוזים ניתנת. לשם ניתוח סטטיסטי, t-הבדיקות של סטודנט אינטראקצית בוצעו. p < 0.01 * *. איור זה היה שונה. Roidl et al. 33 , 38 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: H3K79me2 שבב-qPCR של Aft4, Ddit3, Aft3, Scd1, Npm1 מן CPCs מטופלים עם מעכבי DOT1L. (א) CPCs E14.5-derived שטופלו 5 מיקרומטר DOT1L מעכבי 4-5 שעות לאחר בידוד, בפעם השנייה-יום 2 בתרבות. CPCs היו קבועים ביום 3, אשר בעקבות כרומטין החילוץ, ניסוי שבב ו- qPCR. תוצאות מיוצגים כ % ממוצע (+ /-SEM) קלט (n = 3). אג שימש פקד שלילי. הממוצע של הרמה IgG מתואר קו מקווקו. ניתוח סטטיסטי, היה מוחל ANOVA דו-כיווני. p < 005 *; p < 0.01 * *, p < 0.001 * * *; TSS התחלה גנים ברמת השעתוק באתר, מלון טס בסוף גנים ברמת השעתוק באתר. איור זה היה שונה. Roidl et al. 33 , 38 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: סקירה של ניתוח H3K79me2 שבב-seq. (א) טביעת אצבע של H3K79me2 שבב-seq מן E14.5, נגזר CPCs בהשוואה קלט מראה של העשרה שברי DNA עבור H3K79me2 הבטחת שבב-seq באיכות גבוהה. (B) H3K79me2 שבב-seq תוצאות ההתוויה של heatmap. אזורים גנומית חזק מועשר מוצגים בכחול. שינוי קנה מידה 0 (אדום כהה) - 45 (כחול כהה). H3K79me2 פיקס ליד TSS, מסרב כיוון 3´ כדי לבדוק כי. (ג) H3K79me2 שבב-seq קריאות היו למפות את הגנום mm9, דמיינו את הצופה הגנום אינטגרטיבית (igv ב). והתפוסה H3K79me2 של גנים מוצג כ- log2 של מספר קריאות יחס בין שבב קריאות קלט לכל kilobase לכל מיליון (שינוי קנה מידה:-10 עד 10). מבנה הגן Refseq מיוצגת בזמן תיבה אדומה מציינת את אקסון הראשון כולל את TSS. הגנים Aft4, Ddit3, Scd1, Aft3, ו Npm1 מוצגים. לשם השוואה, מוצגת אות H3K4me3 של האזור גנומי זהה. TSS התחלה גנים ברמת השעתוק באתר, מלון טס בסוף גנים ברמת השעתוק באתר. איור זה שונה מ- Roidl38. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

ג'ין אזור פריימר לפנים 5' - 3' פריימר הפוכה 5' - 3'
Aft4 TSS GGACGATCTCTAACGCCACA GCCCTAAACCCGCCCTTTAT
Aft4 TSS + 1500 CTCCCGAATATGACATGAACCG TCCATTCGAAACAGAGCATCG
Aft4 מלון טס CCGTAATAGGGTAGTCAGGTGC AAAGAATGACACTGAAAACCCACA
Ddit3 TSS GTACTGGCTCCGTCTAACCC CAAGAGAGGGCCTGTAAGCA
Ddit3 TSS + 2500 TCAAGCAGCCGGTCTCATAG CTCAGATCCCCCAATGGCTT
Ddit3 TSS + 4500 GAGCTGGAAGCCTGGTATGA TCACCTCTTCGTTTCCTGGG
Ddit3 מלון טס CACCAAGCATGAACAGTGGG GTACCGTCTATGTGCAAGCC
Aft3 TSS AACTGAGAGCGCAACTCCTC GCTGCCGTTCTTAGCTGGTA
Aft3 מלון טס CTGTTGGCACAAAGTGGCTC GGGATCTGCCATGGTGGAAA
Scd1 TSS TAGTGACCACACACAAAAGCTC CCCAAGTGTAATTTGGATGATTTCC
Npm1 TSS TCCCCCTCCAGTCAGTTACC CGTCCTTTCCTTGGCGTGA
Npm1 מלון טס AGGGACATACTTAAGACAAGCCAG AGGATTGAGGCAGACTGTCAAT
TSS: התחל גנים ברמת השעתוק באתר
מלון טס: סוף גנים ברמת השעתוק באתר

טבלה 1: רשימת תחל משמש שבב-qPCR.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ישנם שתי דרכים עיקריות לביצוע כרומטין immunoprecipitation כדי לזהות את תפוסת גנומית של שינויים היסטון, גורמי שעתוק, הקוראים קוד היסטון, סופרים או מחקים. אחת היא שיטת צ'יפ מקורי בעזרת נוקלאז מתעכל, יליד כרומטין עבור immunoprecipitation, והשני הוא הציג השיטה באמצעות כרומטין מחברים-קבוע, הוטו, שבו את נוקליאוזומים וחלבונים אחרים צמוד-DNA covalently מאוגדים ל- DNA 39. צ'יפ מקורי עם קצב זיהוי נוגדנים גבוה שלה צריך להיות ישימים עבור היסטון מתילציה מאז כרומטין, methylations היסטון יציבים יחסית לאורך השבב. אבל מאז נדרשת כמות גדולה של חומר מתחיל, זה אינה ישימה עבור לימוד פיתוח בקליפת המוח או אסטרוציטומה, מספר התאים מן מוח העכבר איפה בדרך כלל מוגבלת. למרות נוגדנים גדלים בדרך כלל נגד חומר שאינו קבוע, נוכל להוכיח כי הנוגדן מזהה באופן ספציפי H3K79me2 מאז עיכוב מסוים של הפניות DOT1L אות H3K79me2 ירד בניתוח שבב-qPCR וב -immunoblots (איור 2A , איור 3A). שבב שימוש בחומר צולבים עשוי להיות לא יעיל, אך פרוטוקול הציג מבטיחה חומר מספיק במיוחד מועשר qPCR וניתוח רצף.

שבב יעיל, הריכוז מרחביות של המאגר פירוק יכול להיות מכריע, מאז מרחביות denatures חלבונים והופך אותם נגיש עבור איגוד נוגדן. תכונה זו חשוב במיוחד עבור H3K79me2, אשר הוא שינוי היסטון ממוקם בתוך תחום הכדוריים של היסטון 3 ובתוך ליבת נוקלאוזום היחידה הקטנה ביותר של כרומטין,22. לפיכך, עבור H3K79me2, ריכוז מרחביות גבוה יותר (כ 0.3% w/v) במהלך וזמינותו נחוץ כדי להבטיח נגישות אופטימלית antigene. עם זה ריכוז מרחביות, נוכל מאוד להעשיר H3K79me2 IgG פקדים (איור 3) ושוב קלט (איור 4). לפיכך, איכות החומר-השבב על רצף היה מתאים ולהזין העשרת מעל לזו של H3K4me3 (איור 4). אנו מצפים כי יהיה צורך ריכוז מרחביות זהה עבור השבב של מארק מונו או trimethylation H3K79. באופן כללי, הוא המאגר שבב מחמירים יותר, השברים כרומטין פחות חיובי-false הם immunoprecipitated, אם האיכות של הנוגדן אינו מושפע הנוזל בשימוש. בעתיד, ייתכן האפשריים כדי להחיל את פרוטוקול הציג שינוי היסטון אחר בתוך תחום הכדוריים של שינויים היסטוניים.

אם הנוגדנים מתאימים עבור השבב יציבים בריכוזים גבוהים דטרגנט, הפרוטוקול בעיקר מכילה שני שלבים קריטיים. ראשית, הקיבעון של התאים, אמש עוקבות של כרומטין צריכה להיות אופטימיזציה עבור כל סוג התא ואת כל ultrasonicator. Cross-linking ממושך מוביל קיבוע חפצים, עשויה להפחית את שיעור גילוי נוגדנים מאז אנטיגנים עשוי להיות רעולי פנים. אמש כרומטין צורך להוביל את התפלגות גודל ה-dna בין 200 ל 500 לחץ הדם (איור 1B). נוקליאוזומים מכיל 147 bp של ה-DNA. כרומטין שברי כי הם ארוכים מדי תוביל לתוצאות חיוביות כוזבות ב- qPCRs. במהלך רצף הגנום כולו, התפלגות שגוי יוביל תוצאות שליליות שגויות, שכן לעתים קרובות רק חלקים קטנים נחשבים. השלב הקריטי השני הוא ספריית לקראת רצף הגנום כולו. צעד הגברה דנ א צריך להתבצע באמצעות PCR 6-9-מחזורים. הימנעות מחזורים PCR רבים חיונית מאחר שהן עשויות להוביל דעה קדומה GC גבוהים, ערכים כפולים PCR רבים. עם פרוטוקול שהוצגו, ניתן לאחזר מספיק דנ"א כדי לשמור על מספר מחזורים PCR הכרחי נמוכה.

רקמת המוח מכיל כמות מאוד מגוון של סוגי תאים כגון נוירונים, oligodendrocytes להפוך עכשיו, דונלד תאים4. במהלך התפתחות תאים אלה נובעות תאי גזע עצביים ולבנות אזורים מסוימים במוח באופן זמן ותלוי מיקום3. נוירוג'נסיס של קליפת המוח, למשל, מתקיים בין E11.5 לבין E18.5 בעכברים. בשלבים מוקדמים יותר כגון E11.5 ו- E12.5 כמעט כל התאים לי קדמון זהות1, אך המגוון בהמשך הסלולר צריך להילקח בחשבון. לכן, שבב של רקמות קורטיקליים-E14.5 יכול לחשוף H3K79me2 או כל שינוי היסטון אחרים בשלב זה זמן מסוים אך אין אפשרות להציג תכונות ספציפיות כרומטין סוג התא. בעיה זו ניתן לפתור על ידי העשרת של תאים ספציפיים עם תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS) או תא לפעיל על-מגנטי מיון (מקינטוש-מיון)40, אשר הוא ריאלי לאחר המגון המוח. עם מיון במקינטוש עצבית ובתאים נושא סמנים משטח תאים מסוים יכולים להיות מסומנים עם חרוזים מגנטי, ואז מבודדים באמצעות מעמד מגנטי40. לאחר מכן התאים שניתן תרבותי או ישירות משמש שבב. פרוטוקול הציג עשוי לשמש לא רק עבור ובתאים עצבית, אלא גם עבור אוכלוסיות הומוגניות תאים אחרים. עם תוספת של FACS או מקינטוש, הפרוטוקול יכול להיות מיושם עבור כל התאים isolatable בתוך האורגניזם.

יחדיו, פרוטוקול הציג מאפשר לחקור את השינוי היסטון H3K79me2 בנקודות זמן שונות של פיתוח קורטיקלית אסטרוציטומה בצורה יעילה, לשחזור. זה עשוי להיות רלוונטי שינוי היסטון אחר הממוקם בתוך תוכו היסטון, שניתן להחיל על סוגי תאים הומוגנית אחרים בתוך האורגניזם. מאחר H3K79me2 שינוי היסטון שנשמרת23, הפרוטוקול עשוי גם להיות מתאימים לניתוח H3K79me2 לא רק בעכברים, אלא גם על פני מינים שונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים לא מתחרה

Acknowledgments

אנו מודים הנרייטה Bertemes שעזרת להקים פרוטוקול טיפוח CGN בתוך המעבדה. הנייר בשיטה זו נתמכה על ידי במימון DFG CRC992 אפיגנטיקה רפואי על ידי מימון לטלוויזיה. המחברים להכיר את התמיכה של קבוצת גלקסי פרייבורג (freiburg): Pavankumar Videm, ביורן Grüning, פרופסור רולף Backofen, ביואינפורמטיקה, אוניברסיטת פרייבורג, גרמניה ממומן על ידי שיתופי מחקר מרכז 992 אפיגנטיקה רפואי (DFG גרנט SFB 992/1/2012) גרמניה הפדרלית שר החינוך ואת המחקר (BMBF גרנט 031 A538A RBC (de. אי)).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-GAPDH Abcam ab8245 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:5000
Anti-H3 Abcam ab1791 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:3000
Anti-H3K79me2 Diagenode pAb-051-050 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: ChIP antibody
Anti-H3K79me2 Abcam ab-051-050 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:1000
Anti-rabbit-IgG Diagenode C15410206 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: ChIP Ctrl antibody
Anti-Tubulin alpha Abcam ab108629 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:3000
Apo-Transferrin (1 mg/ml) Sigma-Aldrich T1147 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
B27 Supplement (50x) Life Technologies 17504044 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
Bioanalyzer Agilent technologies G2940CA Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For analysis of sheared chromatin
Bioruptor NextGen Diagenode B01020001 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: Ultrasonicator
Boric acid pH 8.4 Sigma Aldrich B6768 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC culturing
CFX Connect RT PCR Detection System Bio-Rad 1855201 Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Detection system for qPCR
DMEM-F12 Life Technologies 11320-033 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGM
Dynabeads Protein A Invitrogen 10001D Category: ChIP
Abbreviation/Comment: Magnetic beads, for ChIP
EPZ-5676 Selleckchem S7062 Category: DOT1L inhibition
Abbreviation/Comment: For DOT1L inhibition in cell culture
Ethylenediamine tetraacetic acid SERVA 39760.01 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: EDTA
Fetal Bovine Serum 10% (v/v) Gibco 10082147 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC isolation and CGM
Glucose Sigma-Aldrich G5767 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGNP isolation
Glutathione (1.25 mg/ml) Sigma-Aldrich G4251 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
Glycine Carl Roth 3187 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For cell fixation
GoTaq mastermix Promega A6002 Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: DNA polymerase master mix for qPCR
Hank’s Balanced Salt Solution Life Technologies 14025-100 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: HBSS
L-glutamine (200 mM) Life Technologies 25030081 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
Laminin Sigma-Aldrich L2020 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC culturing
Lithium chloride Sigma-Aldrich L4408 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: LiCl
N2 supplement Life Technologies 17502048 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGM
NanoDrop 3300 Thermo Fisher 3300 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: Fluorospectrometer for DNA quantification
NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina NEB E7645S Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Kit for Library preparation
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina NEB E7335 Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Oligos for Library preparation
Neurobasal medium Gibco 21103049 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
NP-40 Alternative Calbiochem 492016 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP buffer
Paraformaldehyde Carl Roth 335 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: PFA, for cell fixation
Penicillin-Streptomycin-Neomycin 1% (v/v) Life Technologies 15640055 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: PSN, for CCM and CGM
Phosphate buffered saline Life Technologies 10010023 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: PBS, for CPC isolation
PicoGreen Kit Thermo Fisher P11496 Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Visualizing dye for DNA quantification
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P6407 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGNP isolation
Poly-L-ornithine hydrobromide Sigma Aldrich P3655 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC culturing
Potassium chloride Thermo Fisher AM9640G Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: KCl, for CGM
Protease inhibitor Roche 4693159001 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP
Proteinase K Sigma-Aldrich 3115879001 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP
Qiagen MinElute Qiagen 28004 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: Kit for DNA purification
RNAse Sigma-Aldrich R6513 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP
SGC0946 Selleckchem S7079 Category: DOT1L inhibition
Abbreviation/Comment: For DOT1L inhibition in cell culture
Sodium bicarbonate Carl Roth 8551.1 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: for Elution buffer
Sodium chloride Carl Roth 9265 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: NaCl, for ChIP buffer
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich 30970 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP
Sodium dodecylsulfate Carl Roth 183 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: SDS, for ChIP
Sonic hedgehock (SHH) Sigma-Aldrich SRP6004 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGNP isolation
Superoxide dismutase (1mg/ml) Sigma-Aldrich S7571 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Carl Roth 9090 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: TRIS, for ChIP buffer
Triton X-100 Carl Roth X100 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP buffer
Trypsin-EDTA 0,05% (w/v) Sigma Aldrich 59417C Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC isolation
Tween20 Carl Roth 28320 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For bead preparation
Other Lab devices: Neubauer counting chamber, Incubator, Rotator, Shaker, Disection set, Water bath
CCM: Cortical cell medium
CGM: CGNP cell culture medium

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R. L., Macklis, J. D. Neuronal subtype specification in the cerebral cortex. Nat. Rev. Neurosci. 8, 427-437 (2007).
  2. Kandel, E. R., Squire, L. R. Neuroscience: breaking down scientific barriers to the study of brain and mind. Science. 290, 1113-1120 (2000).
  3. Götz, M., Sommer, L. Cortical development: the art of generating cell diversity. Dev. Camb. Engl. 132, 3327 (2005).
  4. Hirabayashi, Y., Gotoh, Y. Epigenetic control of neural precursor cell fate during development. Nat. Rev. Neurosci. 11, 377-388 (2010).
  5. Davis, A. A., Temple, S. A self-renewing multipotential stem cell in embryonic rat cerebral cortex. Nature. 372, 263-266 (1994).
  6. Sauvageot, C. M., Stiles, C. D. Molecular mechanisms controlling cortical gliogenesis. Curr. Opin. Neurobiol. 12, 244-249 (2002).
  7. McConnell, S. K., Kaznowski, C. E. Cell cycle dependence of laminar determination in developing neocortex. Science. 254, 282-285 (1991).
  8. Desai, A. R., McConnell, S. K. Progressive restriction in fate potential by neural progenitors during cerebral cortical development. Dev. Camb. Engl. 127, 2863-2872 (2000).
  9. Glickstein, M., Strata, P., Voogd, J. Cerebellum: history. Neuroscience. 162, 549-559 (2009).
  10. Marzban, H., et al. Cellular commitment in the developing cerebellum. Front. Cell. Neurosci. 8, (2015).
  11. Azevedo, F. A. C., et al. Equal numbers of neuronal and nonneuronal cells make the human brain an isometrically scaled-up primate brain. J. Comp. Neurol. 513, 532-541 (2009).
  12. Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48, 17-24 (2005).
  13. Luger, K., Mäder, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389, 251-260 (1997).
  14. Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, 693-705 (2007).
  15. Zhang, Q., et al. Histone modification mapping in human brain reveals aberrant expression of histone H3 lysine 79 dimethylation in neural tube defects. Neurobiol. Dis. 54, 404-413 (2013).
  16. Zhang, Y., Reinberg, D. Transcription regulation by histone methylation: interplay between different covalent modifications of the core histone tails. Genes Dev. 15, 2343-2360 (2001).
  17. Sanders, S. L., et al. Methylation of histone H4 lysine 20 controls recruitment of Crb2 to sites of DNA damage. Cell. 119, 603-614 (2004).
  18. Martin, C., Zhang, Y. The diverse functions of histone lysine methylation. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 838-849 (2005).
  19. Greer, E. L., Shi, Y. Histone methylation: a dynamic mark in health, disease and inheritance. Nat. Rev. Genet. 13, 343-357 (2012).
  20. Ng, H. H., et al. Lysine methylation within the globular domain of histone H3 by Dot1 is important for telomeric silencing and Sir protein association. Genes Dev. 16, 1518-1527 (2002).
  21. Kebede, A. F., Schneider, R., Daujat, S. Novel types and sites of histone modifications emerge as players in the transcriptional regulation contest. FEBS J. 282, 1658-1674 (2015).
  22. Roidl, D., Hacker, C. Histone methylation during neural development. Cell Tissue Res. 356, 539-552 (2014).
  23. Mersfelder, E. L., Parthun, M. R. The tale beyond the tail: histone core domain modifications and the regulation of chromatin structure. Nucleic Acids Res. 34, 2653-2662 (2006).
  24. van Leeuwen, F., Gafken, P. R., Gottschling, D. E. Dot1p Modulates Silencing in Yeast by Methylation of the Nucleosome Core. Cell. 109, 745-756 (2002).
  25. Jones, B., et al. The histone H3K79 methyltransferase Dot1L is essential for mammalian development and heterochromatin structure. PLoS Genet. 4, e1000190 (2008).
  26. Woo Park, J., et al. RE-IIBP Methylates H3K79 and Induces MEIS1-mediated Apoptosis via H2BK120 Ubiquitination by RNF20. Sci. Rep. 5, 12485 (2015).
  27. Vlaming, H., van Leeuwen, F. The upstreams and downstreams of H3K79 methylation by DOT1L. Chromosoma. , (2016).
  28. Jones, B., et al. The histone H3K79 methyltransferase Dot1L is essential for mammalian development and heterochromatin structure. PLoS Genet. 4, e1000190 (2008).
  29. Feng, Y., et al. Early mammalian erythropoiesis requires the Dot1L methyltransferase. Blood. 116, 4483-4491 (2010).
  30. Cattaneo, P., et al. DOT1L-mediated H3K79me2 modification critically regulates gene expression during cardiomyocyte differentiation. Cell Death Differ. 23, 555-564 (2016).
  31. Zhang, Q., et al. Histone modification mapping in human brain reveals aberrant expression of histone H3 lysine 79 dimethylation in neural tube defects. Neurobiol. Dis. 54, 404-413 (2013).
  32. Büttner, N., Johnsen, S. A., Kügler, S., Vogel, T. Af9/Mllt3 interferes with Tbr1 expression through epigenetic modification of histone H3K79 during development of the cerebral cortex. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 7042-7047 (2010).
  33. Roidl, D., et al. DOT1L Activity Promotes Proliferation and Protects Cortical Neural Stem Cells from Activation of ATF4-DDIT3-Mediated ER Stress In Vitro. Stem Cells Dayt. Ohio. 34, 233-245 (2016).
  34. Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nat. Biotechnol. 29, 24-26 (2011).
  35. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat. Methods. 9, 357-359 (2012).
  36. Zhang, Y., et al. Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9, R137 (2008).
  37. Ramírez, F., et al. deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis. Nucleic Acids Res. 44, W160-W165 (2016).
  38. Roidl, D. Histone modifications during cerebral cortex development. , (2015).
  39. Turner, B. ChIP with Native Chromatin: Advantages and Problems Relative to Methods Using Cross-Linked Material. Mapping Protein/DNA Interactions by Cross-Linking. , Institut national de la santé et de la recherche médicale. (2001).
  40. Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S., Whittemore, S. R. Isolation of cortical mouse oligodendrocyte precursor cells. J. Neurosci. Methods. 209, 219-226 (2012).

Tags

מדעי המוח גיליון 131 תרבית תאים אסטרוציטומה תרבית תאים קורטיקליים קליפת פיתוח פיתוח אסטרוציטומה מתילציה H3K79 DOT1L צ'יפ עיכוב DOT1L
בידוד, טיפוח של אבות עצבית ואחריו Immunoprecipitation-כרומטין של היסטון 3 ליזין 79 Dimethylation מארק
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bovio, P., Roidl, D., Heidrich, S.,… More

Bovio, P., Roidl, D., Heidrich, S., Vogel, T., Franz, H. Isolation and Cultivation of Neural Progenitors Followed by Chromatin-Immunoprecipitation of Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark. J. Vis. Exp. (131), e56631, doi:10.3791/56631 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter