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Neuroscience

Isolamento e coltura dei progenitori neurali seguito da immunoprecipitazione della cromatina di istone 3 lisina 79 Dimethylation Mark

Published: January 26, 2018 doi: 10.3791/56631
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1
1Institute for Anatomy and Cell Biology, Department of Molecular Embryology, Faculty of Medicine, University of Freiburg, 2Faculty of Biology, University of Freiburg

Summary

Presentiamo un metodo efficace e riproducibile per isolare e coltura di cellule progenitrici neurali dal tessuto di cervello embrionale e postnatale per immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) di istone 3 lisina 79 dimethylation (H3K79me2) - un contrassegno dell'istone si trova all'interno del dominio globulare dell'istone 3.

Abstract

Lo sviluppo del cervello è un processo complesso, che è controllato in maniera temporo-spaziale dai gradienti di morfogeni e diversi programmi trascrizionali. Inoltre, modificazioni epigenetiche della cromatina, come metilazione dell'istone, hanno un ruolo importante per stabilire e mantenere destini cellulari specifici all'interno di questo processo. La stragrande maggioranza di metilazione dell'istone si verifica sulla coda dell'istone flessibile, che è accessibile ai modificatori dell'istone, gomme e proteine istoniche lettore. Al contrario, H3K79 metilazione si trova nel dominio globulare dell'istone 3 ed è implicata in diverse funzioni evolutive. H3K79 metilazione è evolutivamente conservata e può essere trovata in una vasta gamma di specie da Homo sapiens di Saccharomyces cerevisiae. La modifica avviene in popolazioni differenti delle cellule all'interno di organismi, comprese le cellule progenitrici neurali. La posizione di metilazione di H3K79 nel dominio globulare dell'istone 3 lo rende difficile da valutare. Qui, presentiamo metodi per isolare e progenitrici corticale cultura cellule (CPCs) dal tessuto cerebrale corticale embrionale (E11.5-e. 14.5) o progenitori del neurone granulare cerebellare (CGNPs) dal tessuto postnatale (P5-P7) e in modo efficiente immunoprecipitate H3K79me2 per PCR quantitativa (qPCR) e sequenziamento del genoma.

Introduction

Le funzioni sensoriali, motorie e cognitive del cervello sono estremamente complessi e sensibili ai cambiamenti fisici ed ambientali. Il cervello è costituito da tre parti generali hind-, mid-e del forebrain, che sono profondamente collegati. All'interno del forebrain, telencefalo può essere diviso in un telencefalo dorsale (DT) e un ventrale telencefalo (VT). Il DT dei topi è costituito da sei strati corticali che si formano tra E11.5 ed E18.5 in un modo "inside-out"1. Il VT comprende le eminenze gangliare in sviluppo, che poi formano i gangli basali2,3. Diversi tipi di cellule possono essere classificati nel sistema nervoso centrale dei mammiferi quali neuroni, astrociti e oligodendrociti4, che si sviluppano in un modo temporo-spaziale5. In primo luogo, le cellule progenitrici neurali (NPC) danno origine a diversi tipi di neuroni, interneuroni nel VT e neuroni di proiezione nella DT e successivamente ai cellule gliali (ad es., gli astrociti6). Durante lo sviluppo corticale, lo strato più superficiale (strato I), che contiene le cellule di Cajal-Retzius, si forma dapprima. Quindi, tra 12.5 ed e 14.5, NPC generano più profondi strati neuronali (VI, V) mentre tra 14,5 e 16,5, progenitori danno origine al livello superiore (IV-II) neuroni7,8. Un neurone identità viene specificata da diversi programmi di transcriptional temporo-spaziale indotta da morfogeno e inoltre da epigenetici programmi2.

Il cervelletto, che è implicato nella coordinazione motoria, si trova del hindbrain e si sviluppa tra E10 e approssimativamente P20 in topi9. Esso contiene la corteccia cerebellare ed i nuclei cerebellari10. La corteccia cerebellare adulta è costituito da tre strati, lo strato molecolare più esterno, lo strato delle cellule di Purkinje e lo strato granulare più interno che contiene neuroni granulari10. Le cellule cerebellari del granello sono i neuroni più piccoli e rappresentano circa l'80% di tutti i neuroni nel cervello dei vertebrati11. Sviluppano da precursori che si trova nella zona germinale esterna e migrano attraverso lo strato di cellule di Purkinje al loro destinazione12. Come nel telencefalo, lo sviluppo del cervelletto è regolato da diversi importanti morfogeni, che hanno funzioni specifiche e spazio-temporale e avviare definiti programmi trascrizionali10.

Lo sviluppo degli strati corticali e cerebellari è controllato dall'espressione trascrizionale di specifici morfogeni e, quindi, dallo stato della cromatina del DNA. In una vista semplificata, gli Stati della cromatina è divisibile in euchromatin come trascrizionalmente attiva e l'eterocromatina come regioni transcriptionally silenziose. Il nucleosoma come unità di base della cromatina contiene due copie di ogni istone core H2A, H2B, H3 e H4, circondato da 147 paia di basi di DNA13. Gli istoni sono altamente traduzionalmente modificati di metilazione, acetilazione, fosforilazione, ubiquitinazione, sumoilazione, ADP-ribosylation, deaminazione e prolina isomerizzazione14,15. Metilazione dell'istone lisina è considerata il più stabile modifica dell'istone che controlla la trascrizione, replica, ricombinazione16, DNA-danno risposta17e imprinting genomico18. Lisine possono essere mono-, di- o tri-metilato19 e appaiono non solo sulle code degli istoni accessibile, ma anche all'interno del dominio globulare di istoni20. Iperomocisteinemici specifici alle H3K4 e H3K36 sono associate principalmente l'eucromatina, specifici iperomocisteinemici H3K9, H3K27 o H4K20 si trovano principalmente in regioni eterocromatiche, anche se tutti i residui sono situati entro l'istone coda14, 19,21. La metilazione di H3K79 si trova all'interno del dominio globulare istone ed è stata associata con l'attività trascrizionale, ma anche con regioni genomiche trascrizionalmente inerte22. La modifica è evolutivamente conservata poiché è stato osservato in lievito, timo di vitello, pollo e umano23. H3K79 mono, di e trimethylation (H3K79me1, me2, me3) sono catalizzate dalle istone metiltransferasi DOT1L24,25 e il nucleare SET dominio-contenente della proteina 2 (Nsd2)26. DOT1L è implicato nella proliferazione e riparazione del DNA cellulare riprogrammazione27. Perdita di Dot1l in topi porta ad una morte prenatale intorno la fase inerente allo sviluppo e 10.528,29. Durante lo sviluppo del cuore e nella differenziazione dei myocardiocyte, DOT1L è essenziale per gene espressione regolamento30. Nel sistema nervoso centrale, DOT1L funzione potrebbe essere implicato nel tubo neurale sviluppo31, è coinvolto nella soppressione Tbr1-espressione nel proencefalo sviluppo32e potrebbe funzionare nella regolazione di sforzo di ER geni di risposta33. Il contesto-dipendente attivando o reprimere azione di H3K79me, soprattutto con situazioni in vivo come lo sviluppo del sistema nervoso centrale, è ad oggi solo parzialmente capito32. Poiché H3K79 metilazione si trova nel dominio globulare dell'istone 3, è stericamente meno accessibile rispetto alle modifiche sui code istoniche flessibile23. Per comprendere la funzione di metilazione di H3K79, sono necessari metodi di analisi affidabili e riproducibili per determinare la sua posizione e ambiente genomica. In questa carta di metodi, presentiamo metodi di isolamento di diversi progenitori neurali (CPC per la corteccia) e CGNPs per il cervelletto, efficace trattamento dell'inibitore di DOT1L e un metodo di ChIP per analizzare la metilazione H3K79 via qPCR o sequenziamento in tempi diversi punti durante lo sviluppo corticale e cerebellare. Per una panoramica del protocollo e delle sue possibilità, Vedi Figura 1.

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Protocol

Comitati di benessere degli animali delle autorità locali e Università di Friburgo ha approvato tutti gli esperimenti sugli animali (G12/13, G16/11) menzionati nel protocollo seguente.

1. preparati

  1. Preparazioni per l'isolamento del CPCs
    1. Impostare tempo accoppiamento per ottenere embrioni a diversi stadi di sviluppo della corteccia (tra E11.5 ed e 14.5). Utilizzare i topi del ceppo NMRI (Naval Medical Research Institute), che sono almeno 8 settimane di vita. Dopo l'accoppiamento, considera un plug vaginale positivo a 0.5.
    2. Per avere materiale sufficiente, è possibile utilizzare una cucciolata di topi NMRI per uno H3K79me2 ChIP da cortecce di 12.5 o e 14.5. Per versioni successive fasi embrionali, utilizzare una cucciolata per ulteriori analisi di ChIP (media dimensione della lettiera NMRI: 10 embrioni).
    3. Preraffreddare Hank´s equilibrato sale soluzione (HBSS) e tampone fosfato salino (PBS) a 4 ° C (stoccaggio a lungo termine a RT).
    4. Equilibrare i 4 ° C memorizzati tripsina-EDTA (0,05% w/v) a 37 ° C.
    5. Mezzo di Prepare corticale-cellulare (CCM): Integrare il supporto per i neuroni (Vedi Tabella materiali) con concentrazioni finali di supplemento di B-27 del 2% (v/v), 5 µ g/mL Apo-transferrina, 1 µ g/mL del glutatione, 0,5 mM L-Glutammina, superossidodismutasi 0,8 µ g/mL e 1% (v/v) Miscela di antibiotici penicillina-streptomicina-neomicina. Conservare a 4 ° C. Per l'esperimento, equilibrare il medium a 37 ° C.
    6. Scongelare il siero fetale di vitello (FCS), aliquota e (50 mL CAD.) ed equilibrare un'aliquota a 37 ° C (stoccaggio a lungo termine a-20 ° C).
    7. Preparare scorte di dnasi 1 (10 mg/mL) in H2O per la coltura cellulare. Conservare le aliquote a-20 ° C.
    8. Se necessario, sciogliere gli inibitori specifici di DOT1L EPZ-5676 o SGC0946 in DMSO ad una concentrazione stock di 100 mM. Applicare una concentrazione finale di 1-5 µM alle celle al giorno 0 e riapplicare l'inibitore ogni due giorni.
    9. Per la coltivazione di CPC, cappotto piastre per colture cellulari (ben 6 o 12 bene) con poli-L-ornitina hydrobromide (1 mg/mL a 150 mM a pH acido borico 8,4) per almeno 1 h a RT e in seguito con laminina (1 mg/mL) nel mezzo CCM a 37 ° C durante la notte.
  2. Preparazioni per l'isolamento CGNP
    1. Organizzare un appropriato accoppiamento dei topi per generare animali P5-P7 per isolamento del cervelletto (3-5 animali per ChIP e condizione).
    2. Preparare HBSS/glucosio con l'aggiunta di 6 mg/mL glucosio al buffer HBSS.
    3. Preparare il terreno di coltura cellulare CGNP (CGM) con l'aggiunta di supplemento N2 di 1% (v/v), 1% (v/v) penicillina-streptomicina-neomicina, 25 mM KCl e 10% FCS a DMEM-F12. Per la coltivazione di CGNP preparare CGM supporto senza FCS ma con riccio sonic a 0,6 µ g/mL (SHH) (CGM-SHH) ed equilibrare e a 37 ° C quando necessario.
    4. Cappotto piastre per colture cellulari a 6 pozzetti con 100 µ g/mL poli-D-lisina per 1-2 h a RT per la rimozione di cellule gliali. In seguito lavare due volte con ddH sterile2O e asciugare i piatti. Conservare le piastre per massimo una settimana a 4 ° C.
    5. Per la coltivazione di CGNPs cappotto piastre per colture cellulari di 6 pozzetti con poli-L-ornitina (0,1 mg/mL) a 4 ° C durante la notte. In seguito lavare due volte con H2O per la coltura cellulare e asciugare i piatti.
      Nota: Le piastre possono essere memorizzate per massimo una settimana a 4 ° C.
    6. Preparare 0.025% tripsina (w/v) in HBSS/glucosio ed equilibrare e a 37 ° C quando necessario.
  3. Preparazioni per il ChIP di H3K79me2
    1. Preparare PFA (1% in PBS, pH 8) appena prima di reticolazione della cromatina. Per preparare il PFA calore 50 mL di PBS nel microonde al massimo 65 ° C. Durante l'agitazione costante aggiungere 0,5 mg PFA per il PBS. Quindi aggiungere 50 µ l 10 M NaOH e attendere fino al PFA è dissolto. In seguito, µ l 42,5 HCl (37% v/v) per ottenere un pH di 8. Verificare il pH nuovamente e poi lasciare che la soluzione di 1% PFA per raggiungere RT
    2. Preparare scorte di RNAsi (1 mg/mL) e proteinasi K (20 µ g / µ l) separatamente in sterile ddH2O. conservare le aliquote a-20 ° C.
    3. Preparare i seguenti reagenti e buffer: PBS contenente 0,02% Tween, buffer di Lisi, glicina, tampone di diluizione, ChIP buffer 1, tampone di ChIP 2, ChIP buffer 3 e buffer di TE e conservarli a 4 ° C. Preparare il tampone di eluizione fresco ogni volta.
      1. Preparare PBS contenente 0,02% Tween. Archivio al maggior parte una settimana a 4 ° C.
      2. Preparare il tampone di lisi utilizzando 50mm Tris pH 8.0, 10 mM EDTA, 1% (p/v) di sodio dodecil solfato (SDS) e 1x inibitore della proteasi.
      3. Preparare 2,5 M glicina.
      4. Preparare il tampone di diluizione utilizzando 20 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% (v/v) Triton X-100, 0,25% (p/v) SDS e 1x inibitore della proteasi.
      5. Preparare il tampone di ChIP 1 utilizzando 20 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% (v/v) X-100 Triton e 0,2% (w/v) SDS.
      6. Preparare il tampone di ChIP 2 utilizzando 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 500 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% (v/v) X-100 Triton e lo 0,2% (w/v) SDS.
      7. Preparare il tampone di ChIP 3 utilizzando 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 250mm LiCl, 2 mM EDTA, 1% (v/v) NP-40 e 1% (p/v) SDS.
      8. Preparare il buffer di TE usando 20 mM Tris pH 8.0 e 2 mM EDTA.
      9. Preparare il tampone di eluizione fresco contenente l'1% (p/v) SDS, 100mm NaHCO3.

2. neural Progenitor isolamento del tessuto cerebrale

  1. Isolamento e coltura opzionale di CPC
    1. Eutanasia animali gravidi di dislocazione cervicale e trasferire gli embrioni in HBSS ghiacciata.
    2. Rimuovere il cranio con le forbici e isolare il cervello, quindi rimuovere le meningi, se applicabile, con piccole pinze e cortecce isolate (interi, DT, o VT) di entrambi gli emisferi rimuovendo tutte le altre parti di cervello nell'ambito binoculare utilizzando pinze piccole e, se necessarie, piccole forbici. Memorizzare le cortecce isolate in 5 mL di tampone HBSS a 4 ° C in una provetta da 15 mL.
    3. Centrifugare il materiale cerebrale isolato per 5 min a 1.000 x g e a 4 ° C.
    4. Lavare le cortecce con 5 mL HBSS ghiacciata e omogeneizzarle con una punta di Pipetta 1ml pipettando su e giù. Se necessario, tagliare la punta della punta della pipetta.
    5. Centrifugare il campione omogeneizzato per 5 min a 1.000 x g e a 4 ° C. Rimuovere l'HBSS.
    6. Aggiungere 3 mL di tripsina e incubare il campione per 5 min a 37 ° C.
    7. Aggiungere 1 mL di FCS, 5ml CCM e 30 µ l di dnasi 1 al campione e omogeneizzare il campione con una pipetta di vetro 5ml pipettando attentamente su e giù.
    8. Centrifugare le cellule isolate per 5 min a 1000 x g e a 4 ° C. Eliminare il surnatante, aggiungere 5 mL CCM e omogeneizzare il campione nuovamente.
    9. Diluire una parte aliquota del campione e contarli con una conteggio camera di Neubauer. È previsto un importo medio di 4.5 x 106 cellule per embrione. Per la coltivazione del CPCs isolato procedere con passo 2.1.10. Per il ChIP, immediatamente procedere con il passaggio 3.
    10. Per coltivazione, piastra del CPCs su poli-L-ornitina (0,1 mg/mL) e laminina (1 mg/mL) ha ricoperto i piatti con una densità tra 8 x 104 e 2,5 x 105 cellule/cm2 nel mezzo di CCM e li Incubare a 37 ° C, 5% CO2e 100% di umidità relativa.
    11. Poiché il CPCs inizia a differenziarsi in neuroni in coltura cellulare (dopo circa 4 giorni), è necessario considerare la data di dissezione come giorno in vitro 0 (giorno 0). Per più termini di coltivazione, modificare la metà del mezzo ogni quarto giorno con mezzo fresco di CCM.
    12. Applicare 1-5 µM SGC0946 o EPZ5676 dissolto in DMSO al giorno 0 (4-5 h dopo l'isolamento delle cellule) e aggiornarlo ogni secondo giorno. Utilizzare DMSO come un trattamento di controllo. Testare l'efficienza del trattamento inibitore tramite metodi standard immunoblot, se necessario.
  2. Isolamento e coltura facoltativo di CGNPs
    1. Eutanasia: P5-7 animali per decapitazione usando le forbici. Togliere la pelle del cuoio capelluto, apre il cranio e rimuovere il cervello usando le pinze e le forbici piccole. Isolare il cervelletto e trasferirlo in HBSS/glucosio ghiacciato. Rimuovere tutte le meningi e vasi sanguigni e trasferire i cervelletti nelle provette da 15 mL riempite con HBSS/glucosio a freddo.
    2. Lavare i cervelletti tre volte con 10ml ghiacciato HBSS/glucosio (raccoglierli mediante centrifugazione a 650 x g per 5 min a 4 ° C) e omogeneizzare cervelletti successivamente pipettando delicatamente su e giù con una pipetta da 1 mL (massimo 2 - 3 volte) per ottenere 0,5-1 mm3 frammenti.
    3. Aggiungere 5 mL di tripsina 0.025% in HBSS/glucosio e incubare il tessuto sotto costante agitazione in bagnomaria a 37 ° C per 15 min Stop la digestione aggiungendo 5 mL di CGM e raccogliere il tessuto mediante centrifugazione a 650 x g per 5 min a 4 ° C.
    4. Rimuovere il supernatante e triturare il tessuto con una punta di pipetta da 1 mL in 1 mL CGM e trasferirlo in una nuova provetta da 15 mL.
      Nota: È importante evitare bolle d'aria.
      1. Aggiungere 5 mL CGM e incubare la miscela per 2 min sul ghiaccio per depositarsi residui di tessuto. Trasferire il surnatante in una nuova provetta da 15 mL. Aggiungere mL 2 CGM il tessuto residuo e ripetere la procedura di triturazione.
    5. Raccogliere i supernatanti (senza residui di tessuto, circa 10 mL in totale) e centrifugare a 650 x g per 5 min a 4 ° C per raccogliere le cellule cerebellari. Risospendere il pellet in 10 mL di CGM.
    6. Dal momento che gli astrociti aderiscono più veloce e più forte di poli-D-lisina rispetto CGNPs, piastra le cellule su 100 µ g/mL poli-D-lisina 6-Pozzo-piastre (fino a 4 mL per pozzetto) e incubare per 20 min a 37 ° C per rimuovere gli astrociti.
    7. Agitare la piastra e raccogliere il surnatante. Poi Centrifugare a 650 x g per 5 min a 4 ° C in una provetta da 15 mL. Risospendere il pellet in 10 mL CGM e contare le celle con un Neubauer camera di conteggio.
      Nota: CGNPs sono rotondo, piccolo e mostrano un alone quando Imaging utilizzando la microscopia di contrasto di fase.
    8. Se richiesto, seme le cellule a 37 ° C pre-riscaldati CGM sulle piastre di poli-L-ornitina-coated (3 x 106 cellule per 6 pozzetti) e li Incubare a 37 ° C, 5% CO2 e 100% di umidità relativa.
      Nota: Se non viene eseguita la semina, continuare on to passaggio 3.1.
      1. Dopo 6-12 h, scambio medio-CGM-SHH. Trattare l'isolato CGNPs 6 h (o quando si cambia a CGM-SHH) dopo l'isolamento con DOT1L-inibitore e DMSO controllare e rinnovarlo ogni secondo giorno (confronta con 2.1.12). Testare l'efficienza del trattamento inibitore tramite metodi standard immunoblot se necessario. Per il ChIP, procedere con la fase 3.3.
        Nota: Lasciando CGM sulle piastre (e con quello FBS) si tradurrà nella differenziazione del CGNPs in neuroni granulari cerebellari (CGNs).

3. fissazione delle cellule e la tosatura della cromatina

Nota: Se le cellule sono coltivate non eseguire procedura 3.1 e 3.2, se essi sono procedere al punto 3.3.

  1. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione per 4 min a 1.000 x g e aggiungere 1,3 mL di PBS. Trasferire il campione in una provetta da 1,5 mL. Centrifuga per 4 min a 1.000 x g a 4° C. Lavare il campione due volte con 1,3 mL di PBS.
  2. Passaggio critico: Aggiungere 350 µ l 1% PFA al campione e incubare per 5 min a 22 ° C. Per interrompere la reazione, aggiungere 18,4 µ l glicina e 1 mL di PBS. Centrifugare il campione per 5 min a 1.000 x g a 4 ° C.
    1. Lavare il campione due volte con PBS ghiacciata. Raccogliere le cellule fissate mediante centrifugazione per 5 min a 1.000 x g a 4 ° C. Mantenere i campioni su ghiaccio da ora in poi.
      Nota: Il tempo di fissaggio deve essere precisamente 5 min per ottenere risultati ottimali. Numeri di cellulari diversi possono richiedere adattamenti del tempo.
  3. Passaggio critico: A CGNPs coltivato (o CPC), aggiungere fino a 1 mL 1% PFA direttamente per i pozzetti della piastra cultura cellulare. Dopo 5 min di incubazione a 22 ° C, aggiungere una quantità appropriata di glicina e PBS e raccogliere le cellule con un raschietto di cella.
    1. Trasferire le cellule in provette da 1,5 mL e centrifugare il campione per 5 min a 1.000 x g e a 4 ° C. Lavare il campione due volte con PBS ghiacciata. Raccogliere le cellule fissate mediante centrifugazione per 5 minat 1.000 x g a 4 ° C. Mantenere i campioni su ghiaccio da ora in poi.
  4. Passaggio critico: Aggiungere 700 µ l di tampone di lisi (+ inibitore della proteasi) ed incubare il campione per 15 min a 4 ° C. Vortexare il campione ogni 5 min di taglio la cromatina delle cellule lisate 3 x 10 min in sonicatore (30 s pulse, 30 s pausa) alla massima potenza.
    1. Assicurarsi che il volume non superi 350 µ l per provetta. Vortice i campioni ogni 10 minuti controllare il lisato per i restanti nuclei con un microscopio a contrasto di fase.
      Nota: È importante ottenere risultati ottimali di taglio (confronta con Figura 1B) per un'analisi successiva. In caso di utilizzo di altri metodi per la tosatura della cromatina, ottimizzare la tosatura di cromatina frammenti di dimensioni tra 200-500 bp.
  5. A pellet resti di cella per 10 min, 13.000 x g, 4 ° C. Utilizzare il surnatante per il passaggio di preclearing 5.2. Congelare il campione a-20 ° C per un uso successivo, se necessario.

4. preparazione delle perline e Preclearing

  1. Lavare 45 µ l proteina A magnetico perline/ChIP e magnetico perline/campione di 20 µ l con 1 mL PBS ghiacciata contenente 0,02% Tween tre volte utilizzando un supporto magnetico. Quindi, aggiungere 1 mL di PBS ghiacciata ai talloni.
  2. 1 mL di PBS ghiacciata e 45 µ l perline/ChIP, aggiungere 3 µ g di anticorpo/ChIP (H3K79me2 o coniglio IgG). Incubare i campioni per 2 h a 4 ° C in un rotatore per associare gli anticorpi ai talloni. A seconda dell'anticorpo, utilizzare ~ 3 µ g anticorpo/ChIP.
  3. Lavare l'anticorpo-limite-perline tre volte con 1 mL PBS ghiacciata contenente 0,02% Tween. Aggiungere il volume appropriato perlina (volume di biglie magnetiche utilizzato iniziale) di PBS ghiacciata lavate anticorpo-accoppiato-perline.
  4. Aggiungere 600 µ l di tampone di diluizione e 20 µ l di biglie magnetiche lavati nell'esempio per preclearing (volume totale 1.320 µ l) e incubare per 2 ore a 4 ° C in un rotatore. Rimuovere le perle utilizzando un supporto magnetico. Prendono il 5% (33 µ l) dei lisati come campioni di ingresso e congelarli a-20 ° C.

5. immunoprecipitazione della cromatina

  1. Dividere l'Estratto precleared in due tubi (circa 643,5 µ l), aggiungere lo stesso volume di tampone di diluizione e l'anticorpo-limite-Perline (45 µ l/campione; H3K79me2 o coniglio IgG). Incubare i campioni a 4 ° C durante la notte in un rotatore.
  2. Lavare le perle con gelida ChIP buffer 1, ChIP buffer 2 e buffer di ChIP 3 per 10 minuti ciascuno, a 4 ° C in un rotatore. In seguito, lavare tre volte con buffer di TE per 5 min a 4 ° C in un rotatore.
  3. Eluire le perline con tampone di eluizione per 1 h a 1.400 giri/min in uno shaker a temperatura ambiente.
  4. Aggiungere 10 µ g RNasi (1 mg/mL) per tipo di ChIP e 5 µ g per gli esempi di input e incubare i campioni per 30 min a 37 ° C (1.400 giri/min).
  5. Aggiungere 100 µ g proteinasi K (20 µ g / µ l) per ChIP campione e 50 µ g per ogni ingresso e incubare per una notte a 65 ° C a 1.400 giri/min.

6. purificazione di campioni di ChIP

  1. Purificare il ChIP e campioni di ingresso con una purificazione di DNA kit (Vedi Tabella materiali) secondo il manuale. Utilizzare più colonne di purificazione quando si prevede che più di 5 µ g di DNA. Eluire il campione con 2 x 15 µ l di tampone di eluizione di DNA forniti nel kit.
  2. Eseguire la quantificazione dei campioni (utilizzare 1 µ l) utilizzando un fluoroforo visualizzazione e un fluorospectrometer (Vedi Tabella materiali).

7. analisi dei campioni di ChIP via qPCR

  1. Per il disegno dell'iniettore per analisi qPCR, recuperare sequenze genomiche di interesse dal browser Integrative Genomics Viewer (IGV)34. Disegnare primers intorno al sito di inizio trascrizionale (TSS) di un gene, poiché H3K79me2 rischia di trovarsi lì. Come controllo, considera non codificanti genomico regioni o regioni circa 10 Kb a Monte del TSS o 10 Kb a valle dell'estremità trascrizionale del sito (TES).
    1. Generare gli iniettori con https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ utilizzando una dimensione di prodotto tra 70 e 200 bp e un'ottima temperatura preimpostata di 60 ° C. Ai fini della prova, è necessario utilizzare primer per le regioni genomiche Aft4, Ddit3, Scd1, Aft3 e Npm1 elencati nella tabella 1.
  2. Test recentemente progettato gli iniettori con il seguente programma di qPCR, mix master e un gradiente di temperatura di ricottura tra 58 ° e 63 ° C e selezionare la temperatura di ricottura con la più alta quantità di prodotto e di qualità.
    1. Applicare l'elettroforesi del gel del DNA per controllare le dimensioni del prodotto previsto. Per analisi qPCR, utilizzare un sistema di rilevazione di Real-Time PCR (Vedi Tabella materiali).
    2. Preparare il mix master utilizzando mix master della polimerasi del DNA di 10 µ l, 0,5 primer µ l in avanti (10 µM), 0,5 µ l primer inverso (10 µM), acqua priva di nucleasi di 4 µ l e 5 µ l DNA (1 ng / µ l).
    3. Utilizzare un programma di 2-step qPCR come segue: 5 min a 95 ° C, 50 x (30 s a 95 ° C, 30 s a 58 ° C - 63 ° C) e il gradiente di denaturazione costantemente a 4 ° C.
  3. Creare una serie di diluizione di campioni di DNA genomici, tranciate, purificati (2 ng / µ l, 1 ng / µ l, 0,5 ng / µ l, 0.25 ng / µ l e 0,125 ng / µ l) e utilizzare 5 µ l per un test di efficienza utilizzando qPCR. Determinare la pendenza della curva standard e calcolare l'efficienza di primer dalla seguente formula:
    Efficienza (%) = (10^(-1/slope)-1) * 100.
    1. Utilizzare primer con efficienze tra 90 e 105% in un caso ideale, o almeno con efficienze tra 85 e 115%.
  4. Per analizzare il ChIP e campioni di ingresso, applicare 0,1-1 ng di DNA ChIP mescolato con rispettivi forward e reverse primer, acqua priva di nucleasi e DNA polimerasi master mix in un volume finale di 20 µ l per ogni reazione di qPCR.
  5. Determinare i valori di ciclo (Ct) soglia di ChIP e campioni di ingresso e normalizzare il campione Ct a Ct i valori di input per calcolare arricchimento (% ingresso) con la seguente formula. Valori dit uso C ottenuti da IgG controllo per determinare il livello di sfondo.
    ingresso % = 100-2^(norma Norm. − input. ChIP)
    norma. input = Ct (ingresso) − registro2(fattore di diluizione)
    norma. ChIP = Ct (ChIP) − registro2(fattore di diluizione)
    Nota: norma. = normalizzato

8. analisi dei campioni di ChIP tramite sequenziamento

  1. Trasferire i campioni di ChIP (input e immunoprecipitati campione di DNA) ad un impianto di sequenziamento.
  2. Per preparare una biblioteca in anticipo, uso una preparazione libreria appropriata kit (Vedi Tabella materiali) e convertire 2 ng dell'input del DNA e tutto il resto del DNA immunoprecipitato in librerie indicizzate per la prossima generazione multiplex sequenziamento sul indicato piattaforma (Vedi Tabella materiali).
  3. Passaggio critico: Seguendo le istruzioni del kit, lega i adattatori di sequenziamento (con una concentrazione di lavoro di 15 µM) per terminare riparati e dalla coda dA frammenti di DNA. Per adattatori di sequenziamento e PCR primer utilizzare i oligos appropriati (Vedi Tabella materiali). Per questa quantità di DNA in entrata, utilizzare cicli di PCR 6-9 per arricchire i frammenti di DNA adattatore legato.
    Nota: Normalmente, non è necessario effettuare una selezione di dimensioni del DNA adattatore legato. È meglio utilizzare come pochi cicli di PCR come possibile, dal momento che molti risultato di cicli di amplificazione di PCR in PCR duplicati e un'alta polarizzazione di GC.
  4. Per una verifica finale biblioteca, prendere 0,5 µ l della reazione totale per analisi visualizzare la distribuzione delle dimensioni su un dispositivo appropriato (Vedi Tabella materiali). Per la quantificazione, è necessario utilizzare un colorante visualizzante in combinazione con un fluorospectrometer o altri metodi (Vedi Tabella materiali).
  5. Poiché H3K79me2 sembra essere una modifica dell'istone, che ampiamente si sviluppa su più grandi regioni genomiche, sequenza campioni accoppiato-fine con una lettura lunghezza di 50 bp e con una profondità di sequenziamento di 75 Mio letture.
  6. Analizzare i dati di ChIP-seq con il Server di Friburgo Galaxy/Uni (galaxy.uni-freiburg.de).
  7. Eseguire il controllo di qualità con ChIPseq ottenuti con FastQC e, se del caso, li mappa direttamente con Bowtie2 versione 2.2.035 con o senza taglio. Come assembly di genoma di riferimento utilizzare mm9 o la più recente versione mm10; e come annotazione di riferimento Ensembl FTP rilasciare 79.
  8. Opzionale: Rimuovi leggere duplicati utilizzando Picard MarkDuplicates (http://broadinstitute.github.io/picard) prima di chiamare di picco.
  9. Chiamare picchi con MACS2 versione 2.1.036 utilizzando l'opzione "di massima" per H3K79me2.
  10. Per ottenere un rapporto di2 log tra ChIP ed esempio di input, il registro2 del numero di letture del legge rapporto di entrambi i campioni utilizzare BamCoverage e BamCompare.
  11. Per tutti gli altri ChIP-seq specifici approfondimenti, applicare deepTools2 versione 2.3.5 o 2.4.137, cioè per generare i file di traccia di copertura (bamCoverage per il ChIP solo, bamCompare per il confronto di ChIP per l'input), per stimare il ChIP prestazioni utilizzare plotFingerprint e per generare una panoramica generale computeMatrix, plotHeatmap. Selezionare K-significa clustering durante il processo di computeMatrix di regioni genomiche secondo la distribuzione di H3K79me2 del cluster.
  12. Utilizzo ChIP-seq dati pubblicati come H3K79me2 di distacco e 14.5 depositati presso NCBI fini di valutazione (numero di accessione: SRP057733).

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Representative Results

Schema generale di isolamento progenitrici neurali, coltivazione, metodi di analisi H3K79me2 ChIP e ChIP: La figura 1 Mostra un diagramma di flusso per eseguire H3K79me2 ChIP di cellule progenitrici corticale in diversi momenti durante lo sviluppo embrionale del cervello o dei progenitori del neurone granulare cerebellare nelle fasi post-natale. Come primo passo, il cervello deve essere isolato e il telencefalo (tra E11.5 ed e 14.5) o del cervelletto (P5-P7) deve essere recuperato. È possibile analizzare le diverse regioni del telencefalo dividendolo nel DT e TV. In seguito il tessuto sarà omogeneizzato e progenitori neurali segregati. Ora, è possibile a coltura le cellule progenitrici e trattarli con inibitori di DOT1L. Un'altra possibilità è di fissare direttamente i progenitori e li sottopongono alla procedura di ChIP. Per il ChIP, la cromatina sarà tosata in frammenti di 200-500 bp e successivamente incubata con anticorpo magnetico-perline-accoppiato contro H3K79me2. Dopo il lavaggio le perline e recuperare il DNA, il DNA precipitato può essere analizzato mediante sequenziamento o di qPCR (Figura 1A). È essenziale per avere una distribuzione di buone dimensioni dei frammenti della cromatina dopo la tosatura, quindi è opportuno controllare la dimensione del frammento con l'elettroforesi del gel del DNA o con altri metodi (esempi in Figura 1B). Quando si sceglie il sequenziamento del genoma, ChIP-seq-letture H3K79me2 uso saranno fornite come fastq-file per ulteriori analisi (Figura 1). La qualità della sequenziazione legge deve essere valutato mediante applicazione di FastQC e, se necessario, i file di fastq possono essere tagliati utilizzando TrimGalore. Mappatura per il Mus musculus genoma mm9 o mm10 possa essere eseguita con Bowtie2 e controllato tramite PlotFingerprint. Si consiglia di rimuovere i duplicati con MarkDuplicates e per normalizzare le letture di BamCoverage e per confrontare il ChIP per i campioni di ingresso con BamCompare. Le letture di ChIP-seq successivamente possono essere visualizzato in quel momento genoma ampia in heatmaps o gene-wise in sessioni del browser Integrative Genomics Viewer (IGV).

CPC DOT1L inibizione e cultura: CPC sono stati isolati e trattati con inibitore di 5 µM DOT1L SGC0946 al giorno 0 e 2. Il solvente DMSO è stato usato come controllo. Al giorno 3, CPC sono state raccolte, le proteine sono state isolate, quantificate e analizzate tramite immunoblot (Figura 2A). La Figura 2A Mostra che i livelli di H3K79me2 sono effettivamente diminuiti dopo tre giorni di coltura CPC e l'inibizione di DOT1L garantendo un regime di trattamento efficace inibitore. La quantità di proteina di H3, GAPDH o tubulina-alfa che serve come controlli di caricamento quindi non è stata alterata. Immunostaining del CPCs fisso con gli anticorpi contro attiva caspase 3 (CASP3 +) per la rilevazione del apoptosis e HuC/D per la visualizzazione di cellule neuronali indicato che il trattamento di CPC con inibitore di DOT1L ha portato alla morte aumentata delle cellule dopo tre giorni di cultura, come mostrato in Figura 2B. Quantificazione delle cellule che sono CASP3 + DAPI + o HuC/D + / DAPI + all'interno della cultura CPC ha evidenziato un aumento significativo delle cellule CASP3 + rivelando la morte programmata delle cellule all'inibizione di DOT1L. Il numero dei neuroni HuC/D-positivi, tuttavia, è rimasto invariato (Figura 2).

H3K79me2 ChIP-qPCR di Aft4, Ddit3, Scd1, Aft3 e Npm1 da CPCs trattate con l'inibitore di DOT1L: per verificare se il trattamento di inibitore di SGC0946 di DOT1L era efficiente e ha portato ad una riduzione di H3K79me2 alle specifiche geni, abbiamo effettuato un'analisi di ChIP seguita da qPCR di CPC trattati per 3 giorni. IgG di coniglio è stato utilizzato come un controllo del truciolo. Poiché è noto che H3K79me2 si trovano i geni dello stress-responsive endoplasmatico Aft4, Ddit3, Scd1 e Aft3 pure al gene di trasporto nucleare Npm133,38, abbiamo usato primer di qPCR che copre il TSS, TES e regioni genomiche all'interno degli organismi gene per determinare le differenze nella distribuzione di H3K79me2 dopo DOT1L inibizione (Figura 3A). Geni con alti livelli di H3K79me2 in primo luogo come Atf4, Ddit3 e Npm1 erano più sensible a reagire al trattamento inibitore così che tre giorni di inibizione di DOT1L hanno portato a una significativa diminuiscono del H3K79me2. Geni con una copertura di H3K79me2 inferiore, come Atf3 e Scd1, hanno mostrato nessun cambiamento significativo nei livelli di H3K79me2.

Analisi Panoramica di H3K79me2 ChIP-seq: Analisi del genoma dei livelli H3K79me2 nel CPCs da e 14.5, eseguiti e analizzati secondo gli schemi presentati e protocolli (Figura 1), ha rivelato un ChIP di qualità molto elevata. Considerando che i conteggi binned, ordinati in base alla loro frequenza dell'input legge nella macchia di impronte digitali (Figura 4A), sono stati equamente distribuiti, i conteggi di H3K79me2 ha mostrato arricchimento alle regioni specifiche (bidoni ordinati con 1), che Visualizza il successo accumulo di frammenti di cromatina modificati presso H3K79. Un heatmap di H3K79me2 lungo geni tra loro TSS e loro TES e + /-10Kb a Monte o a valle Mostra (Figura 4B) che picchi di H3K79me2 intorno il TSS e in diminuzione verso il TES in generale. Ci sono geni, che sono completamente ricoperte di H3K79me2, e geni, che hanno un picco solo all'interno della regione di TSS. Endoplasmatico-stress correlate a geni come Atf4, Ddit3 e il porto di Npm1 nucleophosmin, per esempio, un elevato livello di H3K79me2 presso il TSS, che è solo leggermente diminuito lungo il corpo intero gene (Figura 4). Al contrario, Scd1 ha una bassa occupazione di H3K79me2 presso il TSS e nessun H3K79me2 all'interno del corpo di gene. Atf3 come ultimo esempio ha diversi taglienti e bassi livello H3K79me2 picchi lungo il corpo di gene.

Figure 1
Figura 1: schema di protocollo di H3K79me2 ChIP da isolato CPC o CGNPs e diagramma di flusso di analisi di sequenziamento. Panoramica di (A) del presente protocollo. Per l'isolamento di CPC, primo e 14.5 cervelli saranno isolati e le cortecce possono essere suddivisi in DT e VT, se necessario. Per CGNPs, cerebelli devono essere recuperati dai topi P5-P7. Il tessuto sarà omogeneizzato, i progenitori segregati, e quindi le cellule possono essere coltivate e trattate con un inibitore appropriato o utilizzate direttamente per il ChIP. Per il ChIP, fissazione della cromatina è seguita da tosatura e immunoprecipitazione con un anticorpo anti-H3K79me2 e coniglio IgG come controllo. Dopo la purificazione di DNA, ChIP campioni possono essere analizzati tramite sequenziamento e preparazione di biblioteca o possono essere analizzati tramite qPCR. (B) esempi della cromatina di qualità adeguate e inadeguate. La distribuzione del frammento di DNA è mostrata in bp. (C) ChIP-seq risultati possono essere sottoposti a una pipeline di analisi sul server Freiburg/Galaxy. Dopo un controllo di qualità (FastQC), letture possono essere guarnite con TrimGalore e quindi mappate tramite Bowtie2 per il genoma di topo (nel mm9 casi presentati). PlotFingerprint valuta la qualità del ChIP. Per definire picchi per H3K79me2, MACSpeaks può essere applicato. Per la normalizzazione dei BamCoverage e per il confronto con il BamCompare di ingresso sono utilizzabili. Per visualizzare i risultati IGV browser e heatmaps sono adatti. File-formati previsti sono in corsivo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: cultura progenitrici corticale e l'inibizione DOT1L. (A) Immunoblots mostrando livelli di H3K79me2 in CPC presso e 14.5 dopo inibizione di DOT1L per 3 giorni (giorno 3, n = 3-11) rispetto al controllo di DMSO. H3, GAPDH e tubulina alfa sono stati utilizzati come controlli di caricamento. (B) Immunocytological colorazione di una cultura CPC ai giorni 2 e 3. Attivazione di caspasi 3 (CASP3 verde)-positivo cellule e neuroni (HuC/d: rosso) erano macchiati. DAPI (blu) è stato usato per prevedere i nuclei cellulari. Barra della scala: 100 µm. (C) quantificazione dei immunostainings presentato in (B). Il rapporto di cellule positive per CASP3 + DAPI + o HuC/D + / DAPI + in percentuale è dato. Per l'analisi statistica, t-test spaiata dello studente sono stati eseguiti. p < 0.01 * *. Questa figura è stata modificata da Roidl et al. 33 , 38 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: H3K79me2 ChIP-qPCR di Aft4, Ddit3, Aft3, Scd1 e Npm1 da CPCs trattati con l'inibitore di DOT1L. (A) CPCs e 14.5-derivati sono stati trattati con inibitore di 5 µM DOT1L 4-5 h dopo l'isolamento e per la seconda volta al day 2 nella cultura. CPC sono stati fissati al giorno 3, che è stata seguita da estrazione della cromatina, esperimento ChIP e qPCR. Risultati sono rappresentati come la % di media (+ /-SEM) ingresso (n = 3). IgG è stato usato come controllo negativo. La media del livello di IgG è raffigurata come linea tratteggiata. Per l'analisi statistica, ANOVA a due vie è stato applicato. p < 005 *; p < 0.01 * *, p < 0,001 * * *; Sito di inizio trascrizionale di TSS, TES trascrizionale fine sito. Questa figura è stata modificata da Roidl et al. 33 , 38 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Panoramica di analisi H3K79me2 ChIP-seq. (A) delle impronte digitali di H3K79me2 ChIP-seq da CPCs e 14.5-derivato rispetto all'input Mostra un arricchimento dei frammenti del DNA, per H3K79me2, garantendo un'alta qualità di ChIP-seq. (B) H3K79me2 ChIP-seq risultati tracciati in una mappa di concentrazione. Fortemente arricchite regioni genomiche sono presentate in blu. Scala 0 (rosso scuro) - 45 (blu scuro). H3K79me2 picchi vicino il TSS e declina in direzione 3 ´ TES. (C) H3K79me2 ChIP-seq letture erano mappate il genoma di mm9 e visualizzate con il Visualizzatore di genoma integrativa (IGV). L'occupazione di H3K79me2 di un gene viene visualizzato come log2 del numero di letture rapporto tra ChIP e ingresso letture al kilobase per milione (Scaling: 9:50). Struttura del gene RefSEQ è rappresentato mentre un riquadro rosso indica il primo essone compreso il TSS. I geni Aft4, Ddit3, Scd1, Aft3 e Npm1 sono mostrati. Per confronto, viene visualizzato un segnale di H3K4me3 della stessa regione genomica. Sito di inizio trascrizionale di TSS, TES trascrizionale fine sito. Questa figura è stata modificata da Roidl38. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gene Regione Trasmettere la Primer 5' - 3' Reverse Primer 5' - 3'
Aft4 È. GGACGATCTCTAACGCCACA GCCCTAAACCCGCCCTTTAT
Aft4 TSS + 1500 CTCCCGAATATGACATGAACCG TCCATTCGAAACAGAGCATCG
Aft4 TES CCGTAATAGGGTAGTCAGGTGC AAAGAATGACACTGAAAACCCACA
Ddit3 È. GTACTGGCTCCGTCTAACCC CAAGAGAGGGCCTGTAAGCA
Ddit3 TSS + 2500 TCAAGCAGCCGGTCTCATAG CTCAGATCCCCCAATGGCTT
Ddit3 TSS + 4500 GAGCTGGAAGCCTGGTATGA TCACCTCTTCGTTTCCTGGG
Ddit3 TES CACCAAGCATGAACAGTGGG GTACCGTCTATGTGCAAGCC
Aft3 È. AACTGAGAGCGCAACTCCTC GCTGCCGTTCTTAGCTGGTA
Aft3 TES CTGTTGGCACAAAGTGGCTC GGGATCTGCCATGGTGGAAA
Scd1 È. TAGTGACCACACACAAAAGCTC CCCAAGTGTAATTTGGATGATTTCC
Npm1 È. TCCCCCTCCAGTCAGTTACC CGTCCTTTCCTTGGCGTGA
Npm1 TES AGGGACATACTTAAGACAAGCCAG AGGATTGAGGCAGACTGTCAAT
TSS: sito trascrizionale iniziale
TES: sito trascrizionale end

Tabella 1: Elenco dei primer utilizzati per ChIP-qPCR.

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Discussion

Ci sono due modi principali per eseguire immunoprecipitazione della cromatina per rilevare l'occupazione genomica di modificazioni istoniche, fattori di trascrizione, i lettori di codice dell'istone, scrittori o gomme. Uno è il metodo di ChIP nativo usando nucleasi digerita, nativo della cromatina per immunoprecipitazione, e l'altro è il metodo presentato utilizzando la cromatina PFA-fisso, tranciata, in cui i nucleosomes e altre proteine DNA-collegato sono covalentemente al DNA 39. ChIP nativo con il suo tasso di rilevazione dell'anticorpo alta dovrebbe essere applicabile per metilazione dell'istone dalla cromatina e iperomocisteinemici istone sono relativamente stabili in tutto il ChIP. Ma poiché è necessaria una grande quantità di materiale di partenza, non è applicabile per lo studio di sviluppo corticale o cerebellare, dove il numero di celle da cervelli di topo è solitamente limitato. Anche se gli anticorpi sono generalmente sollevati contro materiale non fissa, potremmo dimostrare che l'anticorpo rileva specificamente H3K79me2 dal inibizione specifica del DOT1L conduce ad un segnale di H3K79me2 in diminuzione nell'analisi di ChIP-qPCR e immunoblots (Figura 2A e Figura 3A). ChIP utilizzando materiale reticolato potrebbe risultare inefficace, ma il protocollo presentato garantisce materiale abbastanza specificamente arricchito per qPCR e analisi di sequenziamento.

Per un efficace ChIP, la concentrazione di SDS di buffer di lisi può essere cruciale, poiché SDS denatura le proteine e li rende accessibili per il grippaggio dell'anticorpo. Questa caratteristica è particolarmente importante per H3K79me2, che è una modifica dell'istone situata all'interno del dominio globulare dell'istone 3, all'interno del nucleo del nucleosoma di cromatina più piccola unità22. Così, per H3K79me2, una maggiore concentrazione di SDS (circa 0,3% p/v) durante l'esecuzione del test è necessaria per garantire l'accessibilità antigene ottimale. Con questa concentrazione di SDS, noi potremmo arricchire altamente H3K79me2 sui controlli di IgG (Figura 3) e sopra ingresso (Figura 4). Così, la qualità del ChIP-materiale per il sequenziamento è stata appropriata e l'arricchimento sopra ingresso paragonabile a quella di H3K4me3 (Figura 4). Ci aspettiamo che la stessa concentrazione di SDS sarebbe necessaria per ChIP di marchio di mono o trimethylation di H3K79. In generale, è il buffer di ChIP più rigorose, i frammenti di cromatina meno falsi positivi sono immunoprecipitated, se la qualità dell'anticorpo non subisce il detergente utilizzato. Per il futuro, potrebbe essere possibile applicare il protocollo presentato ad altre modifiche dell'istone all'interno del dominio globulare degli istoni.

Se gli anticorpi sono adatti per ChIP e sono stabili a più alte concentrazioni di detersivo, il protocollo contiene principalmente due fasi critiche. In primo luogo, la fissazione delle cellule e la tosatura successive della cromatina deve essere ottimizzati per ogni tipo di cellula e ogni ultrasonicatore. Cross-linking prolungata porta ad artefatti di fissazione e può ridurre il tasso di rilevazione dell'anticorpo poiché gli antigeni possono essere mascherati. La cromatina tosatura necessarie per condurre una distribuzione delle dimensioni del DNA tra 200 e 500 bp (Figura 1B). Nucleosomi contengono 147 bp di DNA. Frammenti di cromatina che sono troppo lunghi porterà a risultati falsi positivi in qPCRs. Durante la sequenziazione del genoma, una distribuzione di dimensione errata porterà a risultati falsi negativi, poiché sono considerati spesso solo piccoli frammenti. Il secondo passaggio critico è la preparazione di libreria per il sequenziamento del genoma. Un passo di amplificazione del DNA deve essere eseguita usando PCR-cicli di 6-9. Evitare numerosi cicli di PCR è essenziale dal momento che essi possono portare a una polarizzazione di GC alta e molti duplicati PCR. Con il protocollo presentato, abbastanza DNA può essere recuperata per mantenere basso il numero di cicli PCR necessari.

Tessuto cerebrale è costituito da una quantità molto diversa di tipi cellulari quali neuroni, oligodendrociti e cellule di glia4. Durante lo sviluppo di queste cellule derivano da cellule staminali neurali e costruire specifiche aree del cervello in un modo di tempo e dipendente dalla posizione3. Neurogenesi della corteccia cerebrale, per esempio, si svolge tra E11.5 ed E18.5 in topi. Nelle fasi precedenti come E11.5 e 12.5 quasi tutte le cellule hanno progenitrici identità1, ma più tardi cellulare diversità deve essere presa in considerazione. Di conseguenza, un ChIP del tessuto corticale a e 14.5 può rivelare H3K79me2 o qualsiasi altra modifica dell'istone, a quel punto di tempo specifico ma non è possibile visualizzare le caratteristiche specifiche della cromatina cellula-tipo. Questo problema può essere risolto da arricchimento di cellule specifiche con fluorescenza-attivato delle cellule ordinano (FACS) o magnetico-attivato cella ordinamento (Mac-ordinamento)40, che è fattibile dopo omogeneizzazione del cervello. Con Mac-ordinamento cellule progenitrici neurali che trasportano gli indicatori di superficie delle cellule specifiche possono essere etichettate con biglie magnetiche e quindi isolati utilizzando un supporto magnetico40. In seguito le cellule possono essere coltivate o utilizzate direttamente per il ChIP. Il protocollo presentato può essere utilizzato non solo per le cellule progenitrici neurali, ma anche per altre popolazioni cellulari omogenee. Con aggiunta di FACS o Mac, il protocollo può essere applicato per isolatable tutte le celle all'interno di un organismo.

Presi insieme, il protocollo presentato permette di indagare la modifica dell'istone H3K79me2 in diversi momenti dello sviluppo corticale e cerebellare in modo efficace e riproducibile. Può essere applicabile ad altre modifiche dell'istone situati all'interno del nucleo dell'istone e può essere applicato ad altri tipi di cellulare omogenea all'interno dell'organismo. Poiché H3K79me2 è un istone conservata modifica23, il protocollo può anche essere adatto per analizzare H3K79me2 non solo nei topi, ma tra le diverse specie.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari

Acknowledgments

Ringraziamo Henriette Bertemes per aver contribuito a stabilire il protocollo di coltivazione CGN all'interno del laboratorio. Questa carta di metodo era sostenuta dall'epigenetica medica CRC992 DFG-finanziato dai finanziamenti alla TV. Gli autori riconoscono il supporto del Team Galassia Freiburg: Pavankumar Videm, Björn Grüning e Prof. ssa Rolf Backofen, bioinformatica, Università di Friburgo, in Germania, finanziato dal centro ricerca collaborativo 992 epigenetica medica (grant DFG SFB 992/1 2012) e Ministero federale tedesco dell'istruzione e della ricerca (BMBF grant 031 A538A RBC (de. NBI)).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-GAPDH Abcam ab8245 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:5000
Anti-H3 Abcam ab1791 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:3000
Anti-H3K79me2 Diagenode pAb-051-050 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: ChIP antibody
Anti-H3K79me2 Abcam ab-051-050 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:1000
Anti-rabbit-IgG Diagenode C15410206 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: ChIP Ctrl antibody
Anti-Tubulin alpha Abcam ab108629 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:3000
Apo-Transferrin (1 mg/ml) Sigma-Aldrich T1147 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
B27 Supplement (50x) Life Technologies 17504044 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
Bioanalyzer Agilent technologies G2940CA Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For analysis of sheared chromatin
Bioruptor NextGen Diagenode B01020001 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: Ultrasonicator
Boric acid pH 8.4 Sigma Aldrich B6768 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC culturing
CFX Connect RT PCR Detection System Bio-Rad 1855201 Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Detection system for qPCR
DMEM-F12 Life Technologies 11320-033 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGM
Dynabeads Protein A Invitrogen 10001D Category: ChIP
Abbreviation/Comment: Magnetic beads, for ChIP
EPZ-5676 Selleckchem S7062 Category: DOT1L inhibition
Abbreviation/Comment: For DOT1L inhibition in cell culture
Ethylenediamine tetraacetic acid SERVA 39760.01 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: EDTA
Fetal Bovine Serum 10% (v/v) Gibco 10082147 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC isolation and CGM
Glucose Sigma-Aldrich G5767 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGNP isolation
Glutathione (1.25 mg/ml) Sigma-Aldrich G4251 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
Glycine Carl Roth 3187 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For cell fixation
GoTaq mastermix Promega A6002 Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: DNA polymerase master mix for qPCR
Hank’s Balanced Salt Solution Life Technologies 14025-100 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: HBSS
L-glutamine (200 mM) Life Technologies 25030081 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
Laminin Sigma-Aldrich L2020 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC culturing
Lithium chloride Sigma-Aldrich L4408 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: LiCl
N2 supplement Life Technologies 17502048 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGM
NanoDrop 3300 Thermo Fisher 3300 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: Fluorospectrometer for DNA quantification
NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina NEB E7645S Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Kit for Library preparation
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina NEB E7335 Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Oligos for Library preparation
Neurobasal medium Gibco 21103049 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
NP-40 Alternative Calbiochem 492016 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP buffer
Paraformaldehyde Carl Roth 335 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: PFA, for cell fixation
Penicillin-Streptomycin-Neomycin 1% (v/v) Life Technologies 15640055 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: PSN, for CCM and CGM
Phosphate buffered saline Life Technologies 10010023 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: PBS, for CPC isolation
PicoGreen Kit Thermo Fisher P11496 Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Visualizing dye for DNA quantification
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P6407 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGNP isolation
Poly-L-ornithine hydrobromide Sigma Aldrich P3655 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC culturing
Potassium chloride Thermo Fisher AM9640G Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: KCl, for CGM
Protease inhibitor Roche 4693159001 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP
Proteinase K Sigma-Aldrich 3115879001 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP
Qiagen MinElute Qiagen 28004 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: Kit for DNA purification
RNAse Sigma-Aldrich R6513 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP
SGC0946 Selleckchem S7079 Category: DOT1L inhibition
Abbreviation/Comment: For DOT1L inhibition in cell culture
Sodium bicarbonate Carl Roth 8551.1 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: for Elution buffer
Sodium chloride Carl Roth 9265 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: NaCl, for ChIP buffer
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich 30970 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP
Sodium dodecylsulfate Carl Roth 183 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: SDS, for ChIP
Sonic hedgehock (SHH) Sigma-Aldrich SRP6004 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGNP isolation
Superoxide dismutase (1mg/ml) Sigma-Aldrich S7571 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Carl Roth 9090 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: TRIS, for ChIP buffer
Triton X-100 Carl Roth X100 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP buffer
Trypsin-EDTA 0,05% (w/v) Sigma Aldrich 59417C Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC isolation
Tween20 Carl Roth 28320 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For bead preparation
Other Lab devices: Neubauer counting chamber, Incubator, Rotator, Shaker, Disection set, Water bath
CCM: Cortical cell medium
CGM: CGNP cell culture medium

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References

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Neuroscienze problema 131 coltura delle cellule cerebellari coltura delle cellule corticali sviluppo di corteccia cerebellare H3K79 metilazione DOT1L ChIP inibizione di DOT1L
Isolamento e coltura dei progenitori neurali seguito da immunoprecipitazione della cromatina di istone 3 lisina 79 Dimethylation Mark
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Bovio, P., Roidl, D., Heidrich, S.,… More

Bovio, P., Roidl, D., Heidrich, S., Vogel, T., Franz, H. Isolation and Cultivation of Neural Progenitors Followed by Chromatin-Immunoprecipitation of Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark. J. Vis. Exp. (131), e56631, doi:10.3791/56631 (2018).

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