Control espacial y Temporal de la activación de células T con un agonista de la Photoactivatable

Resumen

Este protocolo describe un método basado en la proyección de imagen para activar los linfocitos T con photoactivatable péptido-MHC, que precisa control espacio-temporal de la activación de células T.

Resumen

Los linfocitos T participan en la señalización rápida, polarizado, que ocurre dentro de minutos después de la activación del TCR. Esto induce la formación de la sinapsis inmunológica, una ensambladura del estereotipado de la célula que regula la activación de la célula de T y direccionalmente apunta las respuestas efectoras. Para estudiar con eficacia estos procesos, es necesario un enfoque imagen adaptado para capturar respuestas rápidas, polarizadas. Este protocolo describe un sistema, que se basa en un photoactivatable péptido mayor complejo de histocompatibilidad (pMHC) que es no estimulante hasta que se expone a la luz ultravioleta. Decaging objetivo de este reactivo durante experimentos de videomicroscopía permite exacto control espacio-temporal de la activación del TCR y vigilancia alta resolución de posteriores respuestas celulares por reflexión interna total (TIRF) proyección de imagen. Este enfoque también es compatible con estrategias de perturbación genética y farmacológica. Esto permite el montaje de vías moleculares bien definidas que vinculan la señalización del TCR a la formación de las estructuras citoesqueléticas polarizadas que subyacen en la sinapsis inmunológica.

Introducción

Los linfocitos T (células T) juegan un papel central en la inmunidad celular mediante el reconocimiento de péptidos antigénicos en el contexto de la superficie de la célula MHC. Reconocimiento del antígeno, que es mediada por el TCR, conduce a la diferenciación de células ingenuas T y promueve la entrega de respuestas citolíticas y comunicativas por poblaciones efectoras. Participación de TCR también induce cambios dramáticos en la arquitectura celular. Dentro de minutos, las células T gloms sobre el lado de la célula presentadora de antígeno (APC), formando una interfaz polarizada conocida como sinapsis inmunológica (es) de^1,

Protocolo

1. preparación de superficies de vidrio estimulante

1. Cubre-objetos de capa bien ocho cámara con biotinilado poli-l-lisina (Bio-PLL) diluyen 1: 500 en agua destilada, desionizada (ddH₂O). Incubar durante 30 min a temperatura ambiente (RT).
2. Lavado con H₂O.
3. Secado por 2 h a TA.
4. Bloque de Bio-PLL cubrió superficies con solución amortiguadora de bloqueo (HEPES-solución salina con tampón [10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl], con 2% BSA) por 30 min a TA.
   1. Disolver 5 mg de bromhidrato de poli-l-lisina en 1 mL de 10 mM NaPO₄, pH 8.5.
   2. Añadir 125 μmol (0,55 mg) del NHS-biotina (de un stock de ....

Resultados

El enfoque de fotoactivación y proyección de imagen permite observación y fácil cuantificación de respuestas señalización rápidas, polarizadas. Para ilustrar sus capacidades, reproducidos aquí es un experimento examinando la correlación espacio-temporal entre la acumulación inducida por TCR DAG y reorientación del centrosoma. 5C. T C7 celular ráfagas fueron retrovirally transduced con dos reporteros fluorescentes: un biosensor de DAG que contienen los dominios C1 de tándem de la proteína .......

Discusión

En los últimos años, la luz ha surgido como una excelente herramienta para la activación spatiotemporally controlada de procesos celulares. Diversas metodologías se han desarrollado, cada uno con desventajas y ventajas asociadas. El sistema descrito aquí, que se basa en la decaging de ligandos inmovilizados, extracelulares, es ideal para el análisis de las respuestas de señalización rápidas, subcelulares, polarizados. Este enfoque se ha aplicado para examinar la formación es en las células T como se describió anteriormen.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nunc Lab-Tek Cubreobjetos con cámara	Thermofischer Scientific	155361
Hidrobromuro de poli-L-lisina	Sigma-Aldrich	P2636	Necesitará hacer Poly-L-Lisina biotinilada
EZ-Link NHS-Biotin	Thermofischer Scientific	20217	Necesitará hacer Poly-L-Lisina estreptavidina biotinilada
	Thermofischer Scientific 434301
BirA-500: Kit de reacción estándar BirA biotina-proteína ligasa	Avidity	BirA500	Se utilizará para biotinilar proteínas
Biotiniladas Hb I-EK			proteínas, ver referencia 6. Para la biotinilación, utilice el kit BirA
Biotinylated NPE-MCC I-EK	Anaspec		Custom NPE-MCC (H-ANERADLIAYL-K(Nvoc)-QATK-OH) se puede comprar en Anaspec
Biotinylated α El anticuerpo H2-Kk	BD Biosciences	553591
NPE-OVA biotinilado H2-Kb	Anaspec		Custom NPE-OVA (H-SIINFE-K(Nvoc)-L-OH) se puede comprar en Anaspec
Biotinylated KAVY H2-Db	La	proteína sintetizada personalizada Anaspec (KAVYDFATL) se puede comprar en Anaspec
			Para el plegamiento de proteínas, consulte la referencia en el protocolo. Para la biotinilación, utilice el kit BirA
Lámpara UV de mano	UVP	UVGL-25	La lámpara se sostiene a < 1 cm de la muestra.  30 s de luz 365 son suficientes para el decaje detectable, 20 min para el decaje cuantitativo.
Sistema Olympus IX-81 OMAC TIRF.	Olympus		encontrar información adicional sobre el sistema de imágenes en Figura 6
Mosaic digital Diafragma	Andor
Slidebook software	Intelligent Imaging Innovations

Para el plegamiento de Biotinylated ICAM1  Puede