두뇌에 있는 유전자의 세포 자치 기능 손실을 유도 하 여 공부 될 수 있다 또는 셀의 스파스 인구에 있는 기능을 얻을. 여기, Cre recombinase 함수 비보의 손실에 floxed 유전자와 대뇌 피 질의 뉴런 개발의 부족 인구에 제공 electroporation utero에서 설명 합니다.
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방법 논문
Cre lox 재결합 Electroporation Utero에 통해 마우스 대뇌 피 질에서 유도
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
유전자의 세포 자율 신경 기능 손실이 발생 하 여 계시 될 수 있다 또는 뉴런의 작고 부족 인구에 있는 유전자의 기능을 얻을. 이렇게 하려면 손실 또는 이득 유전자의 기능의 신경 유전자 교란된 조직에 의해 포위 된다 모자이크를 생성 해야 합니다. 여기, 우리가 결합 Cre lox 재결합 시스템 electroporation utero에 모자이크 뇌 조직 신경에 있는 유전자의 세포 자치 기능을 공부 하는 데 사용할 수 있습니다을 생성 하기 위하여. DNA 구조 (저장소를 통해 사용 가능), 형광 라벨 및 Cre recombinase 코딩 유전자에 utero 를 사용 하 여 마우스 태아의 두뇌에 loxP 사이트와 측면을 포함 하는 대뇌 피 질의 뉴런 개발에 도입 electroporation입니다. 또한, 우리는 utero에 electroporation 메서드에 생존 및 재현성을 증가 하는 다양 한 적응을 설명 합니다. 이 방법은 또한 titer Cre 중재 재결합 뉴런의 스파스 또는 조밀한 인구에 대 한 설정 포함. (필요 하지 않습니다 하지만)을 적용할 수 있습니다 레이블이 뇌 조직의 조직학 준비 immunohistochemistry. 사용 하는 구문을 붙일 뉴런 수행 Cre recombinase에 대 한 유전자 표시 보장 합니다. 조직학 준비 수지상 및 axonal 아 버 및 모 수석 등뼈의 confocal 영상 통해 뉴런의 형태소 분석 허용. 있으므로 손실 또는 함수의 이득 스파스 모자이크 조직에서, 세포 자치 필요성의 연구와 유전자 제품에서 vivo에서의 자족이이 방법을 허용 합니다.
서론
유전 모자이크를 생성 하는 것은 관심사의 유전자의 기능을 이해 하기 위한 고전적인 실험 패러다임 이다. 프로그램 유전자 세포 표현 형에 필요한 지 확인 하려면 가장 간단한 방법은 유기 체 (예 마네)에 걸쳐 유전자의 기능의 손실을 일으키는 것입니다. 그러나, 확인 하려면 유전자 특정 셀 종류에 특히 필요한 경우, 유기 체 전체 유전자의 녹아웃이 아니다 유효한 접근. 대신, 메서드는 필요한 wildtype (즉 유전자 교란) 조직으로 둘러싸여 동안 주어진된 셀에 유전자의 기능의 손실을 발생 합니다는-즉, 모자이크 조직 만들기. 만약 돌연변이 세포 돌연변이 표현 형을 표시 하지만 주변 wildtype 세포 안, 세포 자치 방법으로 유전자 기능. 돌연변이 세포 wildtype 조직에 의해 포위 된다 모자이크 조직의 분석 유전자, 특히 신경 및 명과 조직의 광대 한 상호 네트워크를 형성 하는 뇌의 세포 자치 기능을 이해 하는 데 이상적입니다.
여러 형태의 모자이크 뇌 조직의 강력한 모델 조사 유전자의 세포 자치 기능을 제공 합니다. 연구 신경 이식1, 여성 X 연결 mosaicism2,
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프로토콜
여기에 설명 된 방법 동물 관리 및 사용 위원회 (ACUC), 제임스 매디슨 대학에 의해 승인 되며 모든 관련 규제 기관 지침 준수에 따라.
1. 마우스 설정
- 젊은 집 (> P60) 남성과 여성의 homozygous floxed 마우스 개종 쌍25를 설정 하는 함께.
참고: 좋은 부정적인 제어는 Cre에서 recombinase 식 모자이크26발생 하지 것입니다 wildtype 마우스의 추가 종족 쌍을 설정 하는. - 여성 출산을 남성으로 그녀의 첫번째 담가 수 있습니다. 쓰레기의 생존을 증가 하는 여자와 남자를 유지 합니다. 이유 후 쓰레기, 예를 들어 출생 후 하루 (P) 21, 여성 및 남성을 구분합니다.
-
Murine 사육
- 암컷과 수 컷25사이 타임 짝짓기를 설정 합니다. 시각적 신호를 사용 하 여 여성27의 발 정기 주기를 결정 하 고25짝짓기 후 아침 질 플러그에 대 한 확인.
- 플러그인....
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결과
단일 GFP를 구성 합니다. Cre는 E15.5에서 electroporated 이었고 P14에서 시각 (재료의 목록 참조). 구성의 농도 주입의 볼륨에 따라 스파스 또는 밀도 결과22,26얻어질 수 있다. 예를 들어, 2 mg/mL GFP의 1 µ L의 주입. 레이블이 지정 된 셀, 일부는 밝은 (그림 1A), 그리고에서 지역화 레이어 II/III (그림 1B) 수의 스파스 유통 Cre 결과. 조직 때문에 두께가 100 µ m, 수지상 아 버의 대부분 (그림 1C) 유지 됩니다. 모 수석 등뼈 높은 배율 (60 X;에서 관찰 될 수 있다 그림 1D)입니다........
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토론
여기, electroporation utero에 모자이크 뇌 조직의 생성을 floxed 마우스에 Cre recombinase와의 조합을 소개 합니다. 이 방법의 장점은 새로운 마우스 선 다른 셀룰러 하위는 타겟이 될 때마다 생성 될 필요는 없습니다: electroporation utero에서 흥분 성의 뉴런, 신경 억제, 또는 시간에 따라 명과 대상으로 사용할 수 있습니다 그리고 electroporation15,,1617,18,19,20,21,
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공개 사항
저자는 공개 관심의 없습니다 충돌 있다.
감사의 글
저자는 제임스 매디슨 대학 생물학 부와 제임스 매디슨 대학교 빛 현미경 이미징 시설의 관대 한 지원을 감사합니다. 닥터 마크 L. 가브리엘 젊은 출생 후 조직 준비, 에 관한 유용한 조언 및 박사 저스틴 W. 브라운 코리 L. Cleland 수술 재료와 공간의 관대 한 조정에 대 한. 이 연구 4-VA, 전진 하는 연방의 버지니아 (G.S.V.)에 대 한 공동 제휴 및에 의해 버지니아 아카데미의 과학 작은 프로젝트 연구 부여 (G.S.V.) 공동 연구 교부 금에 의해 부분적으로 투자 되었다. 지원이 아낌없이 제공 되었습니다 베티 조 사랑 버틀러 ' 58 기부금으로 학부 연구 장학금 (K.M.B.), 파렐 여름 연구 장학금 (K.M.B.)을, (에 K.M.B.), 제임스 매디슨 대학 두 번째 세기 장학금에 대 한 한 제임스 매디슨 대학 센테니얼 장학금 (C.J.H.), 제임스 매디슨 대학 루시 로빈슨 검색 ' 30 기념 장학금 (Z.L.H.)을 및 과학 및 수학 교수 지원 그랜트 (G.S.V.)에 제임스 매디슨 대학 대학.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| C57BL/6J 마우스 | The Jackson Laboratory | #000664 | "1. 마우스 설정"(1.1단계, "야생형 마우스")GFP |
| . Cre empty vector | AddGene | #20781 | "2. DNA 설정"(2.1단계 "Cre 재조합효소 및 형광 마커를 암호화하는 단일 DNA 구성물"). GFP입니다. Cre empty vector는 Tyler Jacks의 선물이었습니다. |
| pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) | AddGene | #69138 | "2. DNA 설정"(2.1단계 "초신성" 시스템") 및 http://snsupport.webcrow.jp/. pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova)는 이와사토 타쿠지의 선물입니다. |
| pK031.TRE-Cre (Supernova) | AddGene | #69136 | "2. DNA 설정"(2.1단계 "초신성" 시스템") 및 http://snsupport.webcrow.jp/. pK031.TRE-Cre (Supernova)는 이와사토 타쿠지의 선물입니다. |
| pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) | AddGene | #85006 | "2. DNA 설정"(2.1단계 "초신성" 시스템") 및 http://snsupport.webcrow.jp/. pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova)는 이와사토 타쿠지의 선물입니다. |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) | Qiagen | #12362 | "2. DNA 셋업"(단계 2.3 "내독소가 없는 플라스미드 정제 키트") |
| 트리판 블루 파우더, 바이오시약 등급 | 시그마 | T6146-5G | "2. DNA 셋업"(2.5단계 "트리판 블루") |
| 염화나트륨, ACS, 2.5kg | VWR | BDH9286-2.5KG | "2. DNA 설정"(단계 2.5 "NaCl") |
| 염화칼륨, ACS, 500g | VWR | #97061-566 | "2. DNA 설정"(2.5단계 "KCl") |
| 인산나트륨이염기성, ReagentPlus, 100g | 시그마-알드리치 | S0876-100G | "2. DNA 설정"(단계 2.5 "Na2HPO4") |
| 산칼륨 모노염기성, ReagentPlus, 100g | Sigma-Aldrich | P5379-100G | "2. DNA 셋업"(단계 2.5 "KH2PO4") |
| 염산, ACS 시약, 500 mL | Fisher Scientific | A144-500 | 참조 "2. DNA 설정"(단계 2.5 "HCl") |
| P-97 마이크로피펫 풀러 | 셔터 기기 | P-97 | "3. 피펫 설정"(3.1단계 "유리 모세관 풀러") |
| 3.0mm 너비의 트로프 필라멘트 | 셔터 기기 | FT330B | "3. 피펫 설정"(3.1단계 "유리 모세관 풀러") |
| 얇은 벽 유리 모세관, 4", 1 / 0.75 OD/ID | World Precision Instruments | TW100-4 | "3. 피펫 설정"(3.1.1단계 "유리 모세관") |
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| 홍채 가위, 11.5cm, 스트레이트, 12팩 | World Precision Instruments | #503708-12 | "4. 자궁 전기천공법" (step 4.1 "홍채 가위") |
| Hartman 모기집게, 9 cm, 스트레이트, 12팩 | World Precision Instruments | #503728-12 | "4. 자궁 내 electroporation" (단계 4.1 "Hartman 모기집게") |
| 범용 부직포 스폰지, 2" x 2", 4-ply | Medrepexpress | #2204-c | "4. 자궁 전기천공법"(단계 4.1 "부직포 거즈 스폰지") |
| 링 팁 집게, 10cm, 직선, 2.2mm ID | World Precision Instruments | #503203 | "4. 자궁 electroporation" (단계 4.1 "ring-tipped forceps") |
| Pyrex 페트리 접시 완료, O.D. × H 100mm &시간; 20mm | 시그마-알드리치 | CLS3160102-12EA | "4. 자궁 내 전기천공법"(단계 4.1 "페트리 접시") |
| 평판 기구 트레이, 스테인리스강, 13-5/8" x 9-3/4" x 5/8" | Amazon | B007SHGAHA | "4. 자궁 전기천공법"(단계 4.1 "스테인리스 스틸 트레이") |
| 백금 핀셋, 5mm | BTX | #45-0489 | "4. 자궁 전기천공법"(단계 4.3 및 4.16 "핀셋 형 전극") |
| ECM 830 풋 페달 | BTX | # 45-0211 | "4. 자궁 내 전기천공법"(단계 4.3 및 4.17 "풋 페달") |
| ECM 830 발전기 | BTX | #45-0052 | "4. 자궁 내 전기천공법" (단계 4.3 "발전기") |
| 단일 동물 이소플루란 마취 시스템 소형 유도 상자 | Harvard Apparatus | #72-6468 | 참조 "4. 자궁 내 전기천공법"(단계 4.4 및 4.6 "노즈 콘", 단계 4.4 "유도 챔버") |
| 안과 연고 | Hanna Pharmaceutical Supply Co | #0536108691 | "4. 자궁 내 전기천공법"(단계 4.7 "수의학 안과 연고") |
| 스페이스 젤(AIMS) | VWR | #95059-640 | "4. 자궁 전기천공법"(단계 4.8 "과포화 소금 용액으로 채워진 밀봉된 파우치") |
| 헤어 리무버 젤 크림, 민감성 포뮬러 | Veet | #062200809951 | "4. 자궁 내 전기천공법"(단계 4.9 "제모 크림") |
| 10ul Low Retention Tip Starter (960 tips/pk) | Phoenix Research Products | TSP-10LKIT | 참조 "4. 자궁 내 electroporation" (단계 4.12 "sterile 10 µ L 마이크로피펫 팁") |
| 보정된 마이크로모세관 피펫용 흡인기 튜브 어셈블리 | Sigma-Aldrich | A5177 | "4. 자궁 전기천공법"(단계 4.15 "흡인기 튜브 어셈블리") |
| 꼰 흡수성 봉합사, 4-0, 바늘 NFS-2(FS-2), 27" | Medrepexpress | MV-J397 | "4. 자궁 내 전기천공법"(단계 4.19 "흡수성 봉합사") |
| " LiquiVet 급류" 티슈 접착제 | Medrepexpress | VG3 | "4. 자궁 내 전기천공법"(단계 4.20 "조직 접착제") |
| 피하 주사기, 폴리프로필렌, 루어 잠금 팁, 용량 1.0mL | Sigma-Aldrich | Z551546-100EA | "4. 자궁 내 electroporation" (단계 4.21 "1 mL 주사기") |
| BD Precisionglide 주사기 바늘 게이지 26, L 1/2 in. | Sigma-Aldrich | Z192392-100EA | 참조 "4. 자궁 내 전기천공법"(단계 4.21 "26G, ½ ” 바늘") |
| Nestlets 중첩 재료 | Ancare | NES3600 | "4. 자궁 내 전기천공법"(단계 4.24 "중첩 재료") |
| 해바라기씨, 검은 기름, 멸균 | Bio-Serv | S5137 | "4. 자궁 내 전기천공법"(단계 4.24 "해바라기씨") |
| 파라포름알데히드, 97% | Alfa Aesar | A11313 | "5. 조직학"(단계 5.1.1 "PFA") |
| 이코노미 핀셋 #3, 11cm, 0.2 x 0.4mm 팁 | World Precision Instruments | #501976 | "5. 조직학" (단계 5.5 "핀셋") |
| 한천 분말 | Alfa Aesar | #10752 | 참조 "5. 조직학"(단계 5.8.1 "한천") |
| 단일 가장자리 면도날, #9 블레이드 | Stanley Tools | #11-515 | "5. 조직학"(단계 5.9 "단일 가장자리 면도날") |
| 시편 디스크 S D 50 mm | Leica | #14046327404 | 참조 "5. 조직학"(단계 5.9 "진동 마이크로톰 표본 디스크") |
| 버퍼 트레이 S 어셈블리 | Leica | #1404630132 | "5. 조직학"(단계 5.10 "버퍼 트레이") |
| VT1000 S Vibratome | Leica | #14047235612 | "5. 조직학"(단계 5.10 "진동 마이크로 톰") |
| 양날 면도 | Personna | BP9020 | "5. 조직학"(단계 5.10 "블레이드") |
| 나이프 홀더 S | Leica | #14046230131 | "5. 조직학"(5.10단계 "나이프 홀더") |
| Studio Elements Golden Taklon 짧은 손잡이 라운드 브러시 세트 | 아마존 | B0089KU6XE | 참조 "5. 조직학"(단계 5.12.1 "미세한 팁 페인트 브러시")Superfrost |
| Plus 슬라이드 | 전자 현미경 서비스 | #71869-11 | "5. 조직학"(5.12.1 단계 "현미경 슬라이드") |
| ProLong Diamond Antifade Mountant, 10 ml | Thermofisher | P36970 | 참조 "5. 조직학" (단계 5.12.3-5.12.4 "mountant") |
| 커버 유리, 24 x 50 mm, No. 1 | Phoenix Research Products | MS1415-10 | 참조 "5. 조직학"(단계 5.12.4 "커버슬립") |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | "5. 조직학"(단계 5.13.1 "DAPI") |
| 고정 스테이지 정립 현미경 | Olympus | BX51WI | "5. 조직학"(단계 5.15 "광학 현미경") |
| 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경 | Nikon | TE2000/C2si | "5. 조직학"(단계 5.15 "컨포칼 현미경") |
| 4x 대물렌즈, NA = 0.20 | Nikon | CFI Plan Apo Lambda 4X | "5. 조직학"(단계 5.15 "저전력 목표") |
| 20x 대물렌즈, NA = 0.75 | Nikon | CFI Plan Apo Lambda 20X | "5. 조직학" (단계 5.15 "중간 전력 목표") |
| 60x 목표, NA = 1.40 | Nikon | CFI Plan Apo VC 60X Oil | 참조 "5. 조직학"(단계 5.15 "고출력 목표") |
참고문헌
- Southwell, D. G., Froemke, R. C., Alvarez-Buylla, A., Stryker, M. P., Gandhi, S. P. Cortical plasticity induced by inhibitory neuron transplantation. Science. 327 (5969), 1145-1148 (2010).
- Hanson, J. E., Madison, D. V. Presynaptic FMR1 genot....
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