Summary
وأعربنا عن اكتوبيكالي NR1 وحدة فرعية من مستقبلات NMDA يوصف مستضد للكشف عن الأجسام المضادة ضد مستقبلات NMDA في الدم لدى المرضى الذين يشتبه بالتهاب الدماغ الذاتية مع البروتينات الفلورية الخضراء في الخلايا الجنينية البشرية (HEK293). قد يكون هذا الأسلوب بسيطة مناسبة لأغراض في إعدادات السريرية الفرز.
Abstract
يمكن أن يسبب وجود الأجسام المضادة-نمدا مستقبلات مختلفة من الأعراض النفسية العصبية في المرضى المتضررين، ويسمى نمدا المضادة مستقبلات الدماغ المناعة الذاتية. من الضروري الكشف عن الأجسام محددة ضد مستقبلات NMDA في الدم أو السائل الدماغي النخاعي (CSF) لتشخيص دقيق لهذا الشرط. مستقبلات NMDA هو أيون قناة بروتين معقد يحتوي على أربعة الوحدات الفرعية، بما في ذلك اثنان إلزامية نمدا مستقبلات فرعية 1 (NR1) وواحد أو اثنين من مستقبلات NMDA 2A وحدة فرعية (NR2A)، نمدا مستقبلات 2B وحدة فرعية (NR2B)، وحدة فرعية مستقبلات NMDA ج 2 (NR2C)، أو مستقبلات NMDA وحدة فرعية 2D (NR2D). وذكر حانمه الأجسام المضادة-نمدا مستقبلات يكون حاضرا في المجال الطرفي ن خارج الخلية فرعية NR1 من مستقبلات NMDA. والهدف من هذه الدراسة هو القيام مقايسة الفلورة بسيط يستند إلى الخلية التي يمكن استخدامها كاختبار فحص للكشف عن وجود الأجسام المضادة ضد NR1 وحدة فرعية من مستقبلات NMDA في الدم لتيسير البحوث السريرية والأساسية من مكافحة نمدا مستقبلات الذاتية التهاب الدماغ.
Introduction
نمدا المضادة مستقبلات الدماغ المناعة الذاتية هي كيان مرض حديثا المعترف بها التي يمكن أن تحدث في المرضى الذين يعانون من جميع الإعمار، ويؤثر على المرضى الذين يغلب عليها العنصر النسائي1،2. أنها واحدة من التهاب الدماغ تم تشخيصها على أنها الأكثر شيوعاً بين المرضى الذين يعانون من المسببات الأولية غير معروف لالتهاب الدماغ3. المرضى المصابين بالتهاب الدماغ مستقبلات NMDA مكافحة عادة ما يكون الأعراض الأولى من الصداع أو الحمى، متبوعاً بالتطور السريع لتغير مستوى الوعي ومجموعة متنوعة من الأعراض النفسية العصبية الحادة، بما في ذلك التحريض، التهيج ، القلق والأرق والهلوسة، والأوهام، العدوان، السلوكيات الغريبة، شذوذ الحركة، التقلبات اللاإرادي والاستيلاء على الهجمات4،5. الاعتراف المبكر بهذا الشرط والمعالجة في الوقت المناسب مع العلاج المناعي مهمان لنتائج أفضل والشفاء التام حتى في المرضى المتضررين6. ومن ثم، اقترح أنه ينبغي مكافحة نمدا مستقبلات الدماغ الذاتية كإجراء تشخيص تفاضلية هامة من المرضى تقديم مع سمات ذهانية حادة أو بداية جديدة7،8.
بالإضافة إلى السمات السريرية، الكشف عن الأجسام ضد مستقبلات NMDA في الدم أو السائل الدماغي النخاعي ضروري لتشخيص دقيق لمكافحة نمدا مستقبلات الدماغ الذاتية9. تتوفر معظم اختبارات مناعية للكشف عن الأجسام مستقبلات NMDA المضادة في مختبرات أبحاث قليلة10،11، وهناك المقايسة الفلورة المتاحة تجارياً على أساس خلية واحدة فقط للفحص مكافحة نمدا مستقبلات الأجسام المضادة12. والهدف من هذه الدراسة هو القيام مقايسة بسيطة الفلورة داخلية يستند إلى الخلية التي يمكن استخدامها مريح في المختبر لفحص وجود الأجسام المضادة مستقبلات نمدا المضادة لتيسير البحوث السريرية من مستقبلات NMDA مكافحة التهاب الدماغ المناعة الذاتية. مستقبلات NMDA هيتيروتيترامير أيون قناة بروتين معقدة وأعرب على وجه التحديد في الدماغ. أنه يتكون من وحدتين فرعيتين NR1 الإجباري، والمزيج من مفارز واحد أو اثنين من NR2A، NR2B، NR2C، أو NR2D13. دراسة سابقة أفادت أن حانمه الرئيسية المستهدفة بالأجسام المضادة في المجال الطرفي ن خارج الخلية ل وحدة فرعية NR15. ومن ثم، في هذا البروتوكول، نعرب عن البروتين NR1-وحدة فرعية الماشوب البشري من مستقبلات NMDA معلم مع البروتين الفلورية الخضراء (التجارة والنقل) في السطر الخلايا الظهارية الكلي الجنينية البشرية (HEK293)، ووضع مقايسة الفلورة يستند إلى الخلية للكشف عن الفئة مفتش من الأجسام المضادة مستقبلات NMDA المضادة في الدم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على الدراسة "المؤسسية استعراض المجلس تشانغ الأمنيون التذكاري مستشفى" لينكو، تاويوان، تايوان (102-2577A3).
1-إعداد بلازميد التعبير NR1-بروتينات فلورية خضراء
- إلى أسفل والطرد المركزي الأنبوبة، بيبيت الخليط برفق حتى نغ 10 مزيج من بلازميد NR1-التجارة والنقل مع 100 ميليلتر من سلالة الخلايا المختصة الإشريكيّة القولونية DH5α في معقم 1.5 مل 4-6 مرات، واحتضان الأنبوب على الجليد لمدة 20 دقيقة.
- احتضان الأنبوب في 42 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة في حمام مائي وإزالة الأنبوب من حوض ماء وإضافة 1 مل ليسوجيني مرق (رطل) المتوسطة في الأنبوب واحتضان الأنبوب عند 37 درجة مئوية في حاضنة مع الهز ح 1.
- نشر 50 ميليلتر من الخليط على صفيحة أجار رطل تتضمن الأمبيسلّين (0.1 مغ/مل)، واحتضان لوحة أجار رطل في 37 درجة مئوية في حاضنة بين عشية وضحاها.
- اختيار مستعمرة واحدة من لوحة أجار رطل استخدام تلميح عقيمة بين عشية وضحاها، ودوامه التلميح في في أنبوب ثقافة بكتيرية التي تحتوي على 5 مل من المتوسطة رطل والامبيسلين (0.1 مغ/مل). احتضان الأنبوب عند 37 درجة مئوية في حاضنة بالمصافحة بين عشية وضحاها.
- الكوة 3 مل من ثقافة البكتيرية بين عشية وضحاها إلى قارورة 500 مل تحتوي على 250 مل العقيمة رطل المتوسطة والامبيسلين (0.1 مغ/مل). احتضان قارورة على 37 درجة مئوية مع الهز. التحقق بشكل منتظم الكثافة البصرية (OD) ثقافة البكتيرية في الطول الموجي 600 نانومتر باستخدام مطياف حتى تصل OD600 إلى 0.6-1.0.
ملاحظة: مزيج جيد 800 ميليلتر من ثقافة البكتيرية بين عشية وضحاها مع 200 ميليلتر والغليسيرول إلى إعداد المخزون والغليسيرول وتخزين المخزون والغليسيرول تحت-80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل. - إعداد NR1-بروتينات فلورية خضراء التعبير بلازميد من ثقافة البكتيرية 250 مل
- جمع الخلايا باستخدام الطرد المركزي في 6,000 ز س لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- ريسوسبيند بيليه البكتيريا في 10 مل استثارة مخزن يحتوي على رناسي أ؛ دوامة دقيق حتى ينظر إلى لا أجمة.
- إضافة 10 مل تحلل المخزن المؤقت إلى تعليق البكتيرية ولطف عكس الخليط 4-6 مرات، واحتضان في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 5 دقائق.
- إضافة 10 مل هطول الأمطار المثلجة قبل المخزن المؤقت إلى ليساتي، برفق عكس الخليط 4-6 مرات.
- صب في البرميل خرطوشة تصفية مع عملية النداءات الموحدة؛ انتظر لمدة 10 دقائق في الرايت
- انزع الغطاء من فوهة مأخذ خرطوشة والمكبس بإدراج الخرطوشة، واضغط برفق المكبس. جمع المصفاة في أنبوب 50 مل.
- إضافة 2.5 مل ملكية المخزن المؤقت من الشركة المصنعة للمصفاة ليستي ومزج الخليط بعكس الأنبوب حوالي 10 مرات، واحتضان المخلوط على الجليد لمدة 30 دقيقة.
- تطبيق الخليط ليستي التي تمت تصفيتها إلى عمود عامل تصفية الذي كان قبل متوازن مع المخزن المؤقت للموازنة 10 مل. يسمح العمود إلى استنزاف بالجاذبية.
- أغسل العمود مع المخزن المؤقت للغسيل 30 مل مرتين، ثم الوت الحمض النووي من العمود باستخدام 15 مل شطف المخزن المؤقت.
- إضافة الايزوبروبانول مل 10.5 (0.7 وحدات التخزين) إلى المخزن المؤقت الحمض النووي التيد ومزيج جيد والطرد المركزي المخلوط في 20,000 ز س لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- صب المادة طافية بعناية، وتغسل بيليه الحمض النووي مع الإيثانول 70% خالية من الذيفان 5 مل مرة واحدة، والطرد المركزي في 20,000 x ز لمدة 10 دقائق.
- صب المادة طافية وجاف بيليه لمدة 5-10 دقيقة في غطاء كيميائية وحل بيليه في 300-500 ميليلتر من المخزن المؤقت خالية من الذيفان.
- تحديد تركيز بلازميد عن طريق قياس امتصاص الحل في "الأشعة فوق البنفسجية" 260/280 نانومتر باستخدام جهاز المطياف الضوئي.
ملاحظة: تعد التعبير بلازميد التجارة والنقل باستخدام البروتوكول نفسه.
2-تعداء الخلايا HEK293 مع NR1-بروتينات فلورية خضراء التعبير بلازميد
- ميليلتر 200 الكوة حل الجيلاتين 2% لكل من لوحة الثقافة 48-جيدا واحتضان لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل.
- نضح الحل الجيلاتين من الخلايا 5 × 104 HEK293 جيدا، والبذور في 200 ميليلتر من مستنبت الخلية التي تحتوي على 10% مصل بقرى الجنين (FBS) في كل بئر. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية في حاضنة هوميديفيد المتوفرة مع 5% CO2 بين عشية وضحاها.
ملاحظة: أحصى الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير. - في اليوم التالي، استبدال المتوسطة ثقافة المستهلك مع 200 ميليلتر من مستنبت الطازجة التي تحتوي على 10% FBS كل بئر.
- لكل واحد الاستعداد جيدا، الحل بواسطة خلط 100 نانوغرام بلازميد NR1-تجفب مع 20 ميليلتر الثقافة المتوسطة، وحل ب بخلط الكاشف تعداء ميليلتر 0.8 مع 20 ميليلتر الثقافة المتوسطة. مضاعفة عدد الآبار اللازمة لإعداد الحجم الإجمالي لكل تجربة.
- إعداد الحل ج بخلط حل أ وحل ب، واحتضان المخلوط في RT لمدة 20-30 دقيقة.
- الكوة ميليلتر 40 حل ج لكل الخلايا HEK293، وتتضمن أيضا دوامة اللوحة بلطف، واحتضان لوحة عند 37 درجة مئوية في حاضنة هوميديفيد المتوفرة مع 5% CO2 بين عشية وضحاها.
- تحقق من التعبير عن البروتين المؤتلف NR1-التجارة والنقل في الخلايا المضيفة تحت مجهر فلوري مع 40 X-200 X التكبير (الإثارة/الانبعاثات: 482/502 شمال البحر الأبيض المتوسط)، والمضي قدما للمقايسة الفلورة يستند إلى الخلية.
ملاحظة: ترانسفيكت التعبير بلازميد التجارة والنقل إلى الخلايا HEK293 باستخدام البروتوكول نفسه.
3-يستند إلى الخلية الفلورة الإنزيم
- نضح المتوسطة المستهلك من الآبار، ثم أغسل كل بئر مع 200 ميليلتر من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) ثلاث مرات.
- إضافة 200 ميليلتر من محلول بارافورمالدهيد 4% لكل بئر؛ احتضان اللوحة على RT لمدة 15 دقيقة.
- نضح الحل بارافورمالدهيد من الآبار، وتغسل كل جيدا مع 200 ميليلتر من برنامج تلفزيوني ثلاث مرات.
- إضافة 200 ميليلتر من اللبن المقشود 10% في ببست (0.1% 20 توين في برنامج تلفزيوني) الحل لكل خير، واحتضان اللوحة على RT ح 1 مع الهز لطيف.
- نضح اللبن المقشود 10% في الحل ببست من البئر، ثم غسل الآبار مع 200 ميليلتر ببست مرة واحدة.
- احتضان الآبار مع البلازما المخفف (1: 100 في ببست) كجسم الأولية مع الهز لطيف على RT ح 1.
ملاحظة: يتم الحصول على البلازما من الدم من المرضى الذين يشتبه في أن يكون التهاب الدماغ المناعة الذاتية. - نضح البلازما المخفف من الآبار، وتغسل كل جيدا مع 200 ميليلتر من ببست ثلاث مرات.
- إضافة 200 ميليلتر من الماعز الإنسان المضادة مفتش مترافق مع أليكسا 594 فلور (1:1، 000 تمييع في ببست) لكل بئر، واحتضان لوحة الثقافة في الرايت مع الهز لطيف ح 1.
- نضح الإنسان المضادة الماعز مفتش مترافق مع الحل أليكسا فلور 594، وتغسل كل جيدا مع 200 ميليلتر من ببست ثلاث مرات.
- إضافة 100 ميليلتر والغليسيرول الحل (والغليسيرول 50% في برنامج تلفزيوني و 1: 100.000 من 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI)) لكل بئر.
- مراقبة والصورة الخلايا تحت مجهر فلوري استخدام 10 × العدسة، و 4 X و 10 X 20 X أهداف.
ملاحظة: استخدام عامل التصفية الصحيح لكل صبغ: للتجارة والنقل NR1 (الإثارة/الانبعاثات = 482/502 شمال البحر الأبيض المتوسط)، عن أليكسا فلور 594 (الإثارة/الانبعاثات = 561/594 nm)، ل DAPI (الإثارة/الانبعاثات = 358/461 nm). سلوك عنصر التحكم السلبي باستخدام الخلايا HEK معربا عن التجارة والنقل بنفس الطريقة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وفي المتوسط، يمكن أن نحصل على 200-300 ميكروغرام خالية من الذيفان التعبير بلازميد NR1-التجارة والنقل والتجارة والنقل من ثقافة البكتيرية 250 مل اتباع الإجراءات المذكورة في المادة 1 من البروتوكول. استخدمت مبلغ 100 نانوغرام/بئر بلازميد التعبير تعداء الخلايا HEK293 المستزرعة في لوحة 48-جيدا كما هو موضح في المقطع 2 من البروتوكول. 24-30 ح بعد تعداء، الخلايا أعرب NR1-بروتينات فلورية خضراء، ويمكن أن يتم الكشف عن البروتينات بروتينات فلورية خضراء المؤتلف تحت مجهر فلوري. ويبين الشكل 1A صورة الخلايا المضيفة التي تعبر عن NR1-بروتينات فلورية خضراء، بينما يبين الشكل 1 الخلايا معربا عن التجارة والنقل. إشارة خضراء يمكن استخدامها كوحدة تحكم جودة للمقايسة: حوالي 30% من الخلايا كانت الإشارات الخضراء تحت مجهر فلوري. الشكل 1A ود 1 إظهار صورة الخلايا المضيفة التي تعبر عن NR1-بروتينات فلورية خضراء. إشارة خضراء يمكن استخدامها كوحدة تحكم جودة للمقايسة: حوالي 30% من الخلايا كانت الإشارات الخضراء تحت مجهر فلوري. واستخدمت الخلايا معربا عن NR1-التجارة والنقل لتحري وجود الأجسام المضادة مستقبلات NMDA المضادة في عينات البلازما البشرية.
في المقايسة الفلورة المستندة إلى الخلايا كما هو موضح في القسم 3 من البروتوكول، مراقبة الإيجابية العينة (التي تم الحصول عليها من مصدر تجاري، انظر الجدول للمواد) أضيفت إلى البلازما المجمعة في 01:10 إضعاف وفقا إرشادات الشركة المصنعة. أعد البلازما المجمعة من 5 من الذكور والإناث البالغين 5. الشكل 1B هو صورة فلور أليكسا-594 عينة مراقبة إيجابية بعد الحضانة مع التعبير الخلايا NR1-التجارة والنقل، بينما الشكل 1E هو صورة فلور أليكسا-594 عينة مراقبة إيجابية بعد الحضانة مع التعبير الخلايا بروتينات فلورية خضراء. الشكل 1 هو الصورة المدمجة الشكل 1A و 1B الشكل: هناك تداخل كبير إشارات خضراء وإشارات حمراء في نفس الخلية، التي تشير إلى توطين NR1-التجارة والنقل المشترك والأجسام المضادة ضد وحدة فرعية NR1 من نمدا مستقبلات (الأسهم). أوجه التداخل عينة بلازما يعرض أكثر من 30% من الأخضر وإشارات حمراء سوف تفسر على أنها إيجابية في هذه الحالة. هو الشكل 1F الصورة المدمجة من الشكل 1 و الشكل 1E بمثابة عنصر التحكم السلبي الرقم 1. اللون الأحمر ضعيفة من الأسفار خلفية الصورة فلور أليكسا-594. وهناك تداخل القليل من الإشارات الخضراء والحمراء، مما يشير إلى لا ربط للأجسام مستقبلات NMDA المضادة ضد بروتين المؤتلف.
لاحظنا خلال إنشاء إجراءات تجريبية، نسبة الإشارة إلى الضوضاء منخفضة صورة فلور أليكسا-594 عند اختبار عينات البلازما. حاولنا تحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء بإجراء مسلسل إضعاف البلازما شكل 01:10، 01:50، 1: 100، و 1: 200، واختبار تركيزات مختلفة من أليكس فلور-594 المسمى جسم الثانوي من 1: 500 إلى 1:2، 000. ووجدنا أن إضعاف إضعاف البلازما و 1:1,000 أو 1:2,000 فلور أليكسا-594 1: 100 هي الشروط المثلى لتفسير البيانات.
رقم 1: الصور التمثيلية للمقايسة الفلورة يستند إلى الخلية للكشف عن الأجسام المضادة-نمدا مستقبلات. (أ) صورة من الخلايا HEK293 التي تعبر عن NR1-التجارة والنقل. (ب) صورة فلور أليكسا-594 مأخوذة من الحقل نفسه أ بعد الحضانة مع عينة مراقبة إيجابية. إشارة حمراء تشير إلى الربط من الأجسام المضادة مستقبلات NMDA المضادة ل NR1 أعرب عنها في الخلايا HEK293. (ج) الصورة المدمجة من A و B. اللون الأصفر يشير إلى توطين المشارك NR1 (إشارة خضراء) والأجسام المضادة مستقبلات NMDA المضادة (إشارة حمراء). تشير الأسهم إلى أمثلة لبعض الخلايا بارز عرض الترجمة المشارك NR1-التجارة والنقل ومكافحة نمدا مستقبلات الأجسام المضادة. (د) صورة من HEK293 الخلايا وإذ تعرب عن NR1-التجارة والنقل. (ﻫ) 594 فلور أليكسا الصورة مأخوذة من نفس مجال د بعد الحضانة مع عينة مراقبة إيجابية. ويشير إلى إشارة حمراء ضعيفة ضجيج الخلفية للصورة فلور أليكسا-594. (و) الصورة المدمجة د وه. هذه الصورة بمثابة عنصر تحكم سلبية، كما أن هناك إشارة صفراء قليلاً ولاحظ. تظهر الصورة مراقبة سلبية ملزمة محددة لمكافحة--نمدا مستقبلات أجسام مضادة لبروتينات فلورية خضراء-NR1 في المقايسة. وقد اتخذت جميع الصور 10 تحت عدسة العين X والهدف عدسة X 20. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وهناك عدة فحوصات مناعية يستند إلى الخلية لفحص وجود الأجسام المضادة ضد مستقبلات NMDA التي ذكرت في الأدب، بما في ذلك الفلورة يستند إلى الخلية الحية المقايسة11، ثابت يستند إلى الخلية الفلورة الإنزيم9 ، والتدفق الخلوي على أساس الاعتداء14. ينبغي إجراء المقايسة الفلورة المستندة إلى خلية حية بعد وقت قصير من إعداد الخلايا اكتوبيكالي التعبير عن البروتين NR1، بينما يتطلب التحليل القائم على قياس تدفق الأفراد المدربين والمعدات الخاصة. مقايسة الفلورة ثابت يستند إلى الخلية هو مقايسة أكثر ملاءمة التي يمكن أن تجري لإعدادات السريرية. ومن ثم، يستخدم العديد من الدراسات المقايسة التجارية غير المباشرة الثابتة المستندة إلى الخلية الفلورة على الشاشة نمدا المضادة مستقبلات الأجسام في مصل الدم والسائل النخاعي العينات12،15. طقم المستخدمة (انظر الجدول للمواد) تحتوي على الخلايا HEK293 ثابت اكتوبيكالي تعبر عن وحدة فرعية NR1 المؤتلف من مستقبلات NMDA. تم تقييم الفحص أن الأداء الممتاز في الكشف عن جسم مفتش مستقبلات NMDA المضادة في مصل الدم و عينات السائل الدماغي النخاعي12. لدينا بروتوكول، استخدمنا نفس النهج الذي أوصت به الشركة المصنعة كيت، إلا أنه يمكننا استخدام بلازميد التعبير NR1-التجارة والنقل. يمكن استخدام البروتين NR1-التجارة والنقل لرصد كفاءة تعداء والتوزيع للبروتين NR1 في كل تجربة. ومن ثم، يمكن استخدامه كضمان جودة للمقايسة.
تعداء كفاءة التجارة والنقل NR1 التعبير بلازميد في خلايا HEK293 هو حوالي 30 في المائة في البروتوكول المعروضة هنا، وكاف للمقايسة الفلورة. ومع ذلك، وجدنا أن كثافة الفلورية الخضراء لا توزع بالتساوي بين الخلايا ترانسفيكتيد، مما يشير إلى الاختلافات في الكفاءة قدرة تعداء أو التعبير من الخلايا الفردية. تباين مستويات التعبير المؤتلف NR1-التجارة والنقل في خلايا مختلفة تسبب كثافة ايربان عندما تم دمج الصورة الخضراء مع صورة الأحمر 594 فلور أليكسا. الإنسان المضادة الماعز مفتش مترافق مع أليكسا فلور 594 كجسم الثانوية للكشف عن وجود الأجسام البشرية الفئة مفتش. وجدنا أن سطوع 594 فلور أليكسا أضعف نسبيا من البروتينات الفلورية الخضراء. حاولنا تحسين كثافة إشارة عن طريق زيادة تركيز الإنسان المضادة مفتش مترافق مع أليكس فلور 594، مع ذلك، الخلفية زيادة كذلك. ومن ثم فهو تركيز الأمثل للإنسان المضادة مفتش مترافق مع 594 فلور أليكس 1:1,000 في هذا المختبر. وكان بعض عينات البلازما أيضا، على خلفية ارتفاع كبير إشارة في الصورة 594 فلور أليكسا. تم اختبار تخفيف مختلفة من البلازما، ووجد أن إضعاف الحد أدنى من 1: 100 من الضروري الحصول على خلفية نظيفة بالنسبة للعينات. وبالتالي، نوصي بتمييع 1: 100 من البلازما كخطوة القياسية في هذا البروتوكول. ومقارنة الأخرى المستندة إلى الخلية فحوصات التي يمكن الكشف عن عينة المصل في تمييع الدم عينة11،1601:10 و 01:20، هذا البروتوكول الحالي ليس لديه حساسية كافية للكشف عن الأجسام المضادة مستقبلات NMDA مكافحة عيار منخفض، وهو القيد من البروتوكول.
البروتوكول الحالي مقايسة الفلورة ثابت يستند إلى الخلية. لوحة الثقافة يمكن تخزينها في الثلاجة 4 درجات مئوية بعد التثبيت لاستخدامها لاحقاً لتصل إلى شهر واحد، بالمقارنة مع التحليل يستند إلى الخلية الحية يمكن تخزينها لفترة طويلة. ومع ذلك، البروتين NR1 سوف يكون التشويه والتحريف وتفقد به تكيف الطبيعية أثناء إجراء التثبيت، التي قد تؤثر على تكيف حانمه الذي يربط بين الأجسام المضادة مستقبلات NMDA مكافحة. ومن ثم، اعتمدت بعض الدراسات إيممونوفلوريسسيني يستند إلى الخلية الحية11،17. يمكن تعديل لدينا بروتوكول بدلاً من أن تصبح مقايسة الفلورة يستند إلى الخلية حية للحفاظ على تكيف طبيعي للبروتين NR1، إذا نحن احتضان عينة البلازما مع الخلايا الحية أولاً، وإصلاح الخلايا في وقت لاحق. وهكذا، هناك مرونة في البروتوكول لتلبية حاجة التجربة.
مستقبلات NMDA بروتين هيتيروتيترامير معقدة تتألف من NR1، NR2A، NR2B، NR2C، و NR2D. تم تصميم البروتوكول الحالي للكشف عن درجة مفتش الأجسام ضد NR1 وحدة فرعية من مستقبلات NMDA. يمكن أيضا تعديل البروتوكول للكشف عن إيسوتيبيس مختلفة من الأجسام المضادة، طالما أن الأجسام المضادة مفتش الثانوي الإنسان المضادة تحل محلها فئة معينة أخرى من الأجسام المضادة الثانوية. وعلاوة على ذلك، يمكن تعديل البروتوكول الحالي للكشف عن وجود الأجسام المضادة ضد NR2A، NR2B، NR2C، و NR2D، إذا تم استبدال بلازميد التعبير NR1-التجارة والنقل مع بلازميد التعبير المطابق، على التوالي.
في هذا البروتوكول، استخدمنا عينة بلازما بدلاً من المصل، لأن نقوم بجمع عينة المضادة تخثر الدم بشكل روتيني لأغراض الدراسة المختلفة، ولكن يمكن تطبيق البروتوكول على مصل الدم أو عينات السائل الدماغي النخاعي. يمكن قياسها كمياً عيار الأجسام المضادة في البلازما بتمييع التسلسلي للعينة. في المختبر، ونحن أيضا اختبار خط الخلية تنتجها الخلايا الليفية مثل القرد الأخضر الأفريقي الكلي (COS1) كالخلايا المضيفة باستخدام البروتوكول نفسه. النتائج هي نفسها كتلك التي تستخدم الخلايا HEK293، فيما عدا أن الخلايا COS1 لها كفاءة تعداء أقل قليلاً من الخلايا HEK293.
للتأكد من وجود الأجسام المضادة مستقبلات NMDA المضادة، ويقترح أن تجارب إضافية مثل إيمونوهيستوتشيميستري الاعتداء باستخدام أنسجة الدماغ القوارض وأداء إيمونوسيتوتشيميستري استخدام القوارض مثقف الابتدائي تكون الخلايا العصبية5 ،9. ومن ثم، يمكن فقط يعتبر البروتوكول الحالي مقايسة فرز. على الرغم من أن تم التحقق من صلاحيتها التجريبية باستخدام نموذج التحكم الإيجابي في هذه الدراسة، الحساسية وخصوصية لهذا الفحص في إعدادات السريرية الحاجة التي ستنشأ في المستقبل دراسة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل "المؤسسة الطبية الأمنيون تشانغ" (رقم المنحة CMRPG3C1771، CMRPG3C1772، CMRPG3E0631، CMRPG3E0632، و CMRPG3E0633).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GRIN1 (GFP-tagged) - Human glutamate receptor, ionotropic, N-methyl D-aspartate 1 (GRIN1), transcript variant NR1-1 | Origene (Rockville, MD, USA) | RG219368 | NR1-cDNA clone tagged with C-terminal tGFP sequences |
| pCMV6-AC-GFP | Origene (Rockville, MD, USA) | PS100010 | mammalian vector with C-terminal tGFP tag |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen (Hilden Germany) | 12362 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) | 11668-019 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985-070 | |
| DMEM, High Glucose, Pyruvate | Thermo Fisher | 11995-065 | |
| Characterized Fetal Bovine Serum, US Origin | GE Healthcare Life Sciences | SH30071.01 | |
| Goat anti-Human IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | Thermo Fisher | A-11014 | |
| Positive control: anti-glutamate receptor (type NMDA) | Euroimmun AG, Lübeck, Germany | CA 112d-0101 | |
| Euroimmun Assay Kit |
References
- Linnoila, J. J., Rosenfeld, M. R., Dalmau, J. Neuronal surface antibody-mediated autoimmune encephalitis. Semin Neurol. 34 (4), 458-466 (2014).
- Lancaster, E. The diagnosis and treatment of autoimmune Encephalitis. J Clin Neurol. 12 (1), 1-13 (2016).
- Pruss, H., et al. Retrospective analysis of NMDA receptor antibodies in encephalitis of unknown origin. Neurology. 75 (19), 1735-1739 (2010).
- Leypoldt, F., Armangue, T., Dalmau, J. Autoimmune encephalopathies. Ann N Y Acad Sci. 1338, 94-114 (2015).
- Dalmau, J., et al. Anti-NMDA-receptor encephalitis: case series and analysis of the effects of antibodies. Lancet Neurol. 7 (12), 1091-1098 (2008).
- Titulaer, M. J., et al. Treatment and prognostic factors for long-term outcome in patients with anti-NMDA receptor encephalitis: an observational cohort study. Lancet Neurol. 12 (2), 157-165 (2013).
- Chapman, M. R., Vause, H. E. Anti-NMDA receptor encephalitis: diagnosis, psychiatric presentation, and treatment. Am J Psychiatry. 168 (3), 245-251 (2011).
- Gable, M., Glaser, C. Anti-n-methyl-d-aspartate receptor encephalitis appearing as a new-onset psychosis: disease course in children and adolescents within the california encephalitis project. Pediatr Neurol. 72, 25-30 (2017).
- Dalmau, J., Lancaster, E., Martinez-Hernandez, E., Rosenfeld, M. R., Balice-Gordon, R. Clinical experience and laboratory investigations in patients with anti-NMDAR encephalitis. Lancet Neurol. 10 (1), 63-74 (2011).
- Dalmau, J., et al. Paraneoplastic anti-N-methyl-D-aspartate receptor encephalitis associated with ovarian teratoma. Ann Neurol. 61 (1), 25-36 (2007).
- Irani, S. R., et al. N-methyl-D-aspartate antibody encephalitis: temporal progression of clinical and paraclinical observations in a predominantly non-paraneoplastic disorder of both sexes. Brain. 133 (Pt 6), 1655-1667 (2010).
- Suh-Lailam, B. B., Haven, T. R., Copple, S. S., Knapp, D., Jaskowski, T. D., Tebo, A. E. Anti-NMDA-receptor antibody encephalitis: performance evaluation and laboratory experience with the anti-NMDA-receptor IgG assay. Clin Chim Acta. 421, 1-6 (2013).
- Mayer, M. L. Structural biology of glutamate receptor ion channel complexes. Curr Opin Struct Biol. 41, 119-127 (2016).
- Ramberger, M., et al. Comparison of diagnostic accuracy of microscopy and flow cytometry in evaluating n-methyl-d-aspartate receptor antibodies in serum using a live cell-based assay. PLoS One. 10 (3), e0122037 (2015).
- Wandinger, K. P., Saschenbrecker, S., Stoecker, W., Dalmau, J. Anti-NMDA-receptor encephalitis: a severe, multistage, treatable disorder presenting with psychosis. J Neuroimmunol. 231 (1-2), 86-91 (2011).
- Dahm, L., et al. Seroprevalence of autoantibodies against brain antigens in health and disease. Ann Neurol. 76 (1), 82-94 (2014).
- Jézéquel, J., et al. Cell- and single molecule-based methods to detect anti-n-methyl-d-aspartate receptor autoantibodies in patients with first-episode psychosis from the OPTiMiSE project. Biol Psychiatry. , (2017).
