Summary
Nous avons exprimé façon ectopique sous-unité NR1 de récepteur NMDA estampillé de la protéine fluorescente verte dans les cellules embryonnaires humaines (HEK293) comme antigène pour détecter des auto-anticorps dirigés contre le récepteur NMDA dans le sang des patients soupçonnés d’être atteinte d’encéphalite auto-immune. Cette méthode simple peut être appropriée pour le dépistage en milieu clinique.
Abstract
La présence d’auto-anticorps récepteur anti-NMDA peut causer divers symptômes neuropsychiatriques chez les patients touchés, appelées encéphalite auto-immune d’anti-NMDA récepteur. Détection de l’auto-anticorps spécifiques contre le récepteur NMDA dans le sang ou le liquide céphalo-rachidien (LCR) est essentielle pour le diagnostic exact de cette condition. Le récepteur NMDA est une protéine de canal ionique complexe qui contient quatre sous-unités, dont deux sous-unité obligatoire du récepteur NMDA 1 (NR1) et un ou deux récepteurs de NMDA sous-unité 2 a (NR2A), 2 b sous-unité de récepteurs NMDA (NR2B), sous-unité de récepteur NMDA 2C (NR2C), ou récepteur NMDA sous-unité 2D (NR2D). L’épitope d’auto-anticorps récepteur anti-NMDA a été signalé à être présents sur le domaine extracellulaire de N-terminale de la sous-unité NR1 du récepteur NMDA. L’objectif de cette étude est de développer un test simple immunofluorescence sur les cellules qui peut être utilisé comme un test de dépistage pour détecter la présence d’autoanticorps dirigés contre une sous-unité NR1 du récepteur NMDA dans le sang pour faciliter la recherche clinique et fondamentale de encéphalite auto-immune du récepteur anti-NMDA.
Introduction
L’encéphalite auto-immune récepteur anti-NMDA est une entité nouvellement reconnue de la maladie qui peut survenir chez des patients de tous âges et affecte principalement les patientes1,2. Il est l’un de l’encéphalite diagnostiqué plus fréquemment chez les patients présentant la première étiologie inconnue d’encéphalite3. Patients atteints d’encéphalite récepteur anti-NMDA habituellement ont des symptômes avant-coureurs d’un mal de tête ou fièvre, suivie par le développement rapide de changement de niveau de conscience et une variété de symptômes neuropsychiatriques aigus, notamment l’agitation, irritabilité , anxiété, insomnie, hallucinations, délire, agressivité, comportements bizarres, des anomalies de mouvement, dérèglement du système nerveux autonome et saisie attaque4,5. La reconnaissance précoce de cette condition et le traitement à l’immunothérapie sont importants pour un meilleur résultat et même pleine reprise de patients affectés de6. Par conséquent, il est suggéré que l’encéphalite auto-immune d’anti-NMDA récepteur soit considérée comme un diagnostic différentiel important de patients qui présentent des caractéristiques psychotiques aigus ou d’apparition récente7,8.
Outre les caractéristiques cliniques, détection d’auto-anticorps contre le récepteur NMDA dans le sang ou le LCR est essentielle pour le diagnostic précis de l’anti-NMDA récepteur encéphalite auto-immune9. La plupart des tests immunologiques pour détecter l’auto-anticorps de récepteurs anti-NMDA sont disponibles dans quelques recherches laboratoires10,11, et il n’y a qu’un seul dosage immunofluorescence de base de cellules disponibles dans le commerce pour le dépistage de la anti-NMDA récepteur autoanticorps12. L’objectif de cette étude est de développer un test par immunofluorescence sur les cellules interne simple qui peut être idéalement utilisé en laboratoire pour dépister la présence d’autoanticorps anti-NMDA récepteur faciliter la recherche clinique du récepteur anti-NMDA encéphalite auto-immune. Le récepteur NMDA est une hétérotétramère ion channel protéine complexe est spécifiquement exprimée dans le cerveau. Il est fait de deux sous-unités de NR1 obligatoires et la combinaison d’un ou deux sous-unités NR2A, NR2B, NR2C ou NR2D13. Une précédente étude rapporte que l’épitope principaux ciblé par les anticorps est au niveau du domaine N-terminal extracellulaire des sous-unités NR15. Par conséquent, dans ce protocole, nous exprimer la protéine recombinante humaine de sous-unité NR1 de récepteur NMDA estampillé de la protéine fluorescente verte (GFP) dans la lignée de cellules épithéliales de rein embryonnaire humain (HEK293) et développer un test d’immunofluorescence sur les cellules pour détecter la classe des IgG des autoanticorps récepteur anti-NMDA dans le sang.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
L’étude a été approuvée par les institutionnels Review Board de Chang Gung Memorial Hospital à Linkuo, Taoyuan, Taïwan (102-2577A3).
1. préparation du plasmide NR1-GFP Expression
- Mix 10 ng de plasmide NR1-GFP 100 µl de la souche de cellules compétentes d’Escherichia coli DH5α dans un stérile de 1,5 mL centrifuger tube, pipette le mélange doucement jusqu'à et bas 4 à 6 fois et incuber le tube sur la glace pendant 20 min.
- Incuber les tubes à 42 ° C pendant 1 min dans un bain d’eau, retirer le tube du bain-marie, ajouter 1 mL de milieu de bouillon (LB) lysogénie dans le tube et incuber les tubes à 37 ° C dans un incubateur avec agitation pendant 1 h.
- Propage 50 µL du mélange sur une gélose LB contenant l’ampicilline (0,1 mg/mL) et incuber la gélose LB à 37 ° C dans un incubateur pendant la nuit.
- Prélever une colonie unique sur la gélose LB au jour le jour à l’aide d’un embout stérile, et agiter la pointe dans un dans un tube à culture bactérienne contenant 5 mL de milieu LB et l’ampicilline (0,1 mg/mL). Incuber les tubes à 37 ° C dans un incubateur avec agitation du jour au lendemain.
- Aliquote 3 mL de la culture bactérienne pendant la nuit dans un ballon jaugé de 500 mL qui contient 250 mL stérile LB médium et l’ampicilline (0,1 mg/mL). Incuber le ballon à 37 ° C sous agitation. Vérifiez régulièrement la densité optique (do) de la culture bactérienne à la longueur d’onde de 600 nm en utilisant un spectromètre jusqu'à ce que le DO600 atteint 0,6-1,0.
NOTE : Mélanger bien 800 µL de la culture bactérienne pendant la nuit avec 200 glycérol µL pour préparer le stock de glycérol et stocker le stock de glycérol moins de-80 ° C pour une utilisation future. - Préparer le plasmide expression NR1-GFP de la culture bactérienne de 250 mL
- Recueillir les cellules par centrifugation à 6 000 x g pendant 15 min à 4 ° C.
- Resuspendre le culot de bactéries dans 10 mL de tampon remise en suspension contenant la RNase A ; Vortex soigneusement jusqu'à ce qu’aucune touffe n’est vu.
- Ajouter 10 mL de tampon lyse de la suspension bactérienne, délicatement inverser le mélange 4 - 6 fois et incuber le lysat à température ambiante (RT) pendant 5 min.
- Ajouter 10 mL de tampon préalablement réfrigérées précipitation au lysat, retourner doucement le mélange de 4 - 6 fois.
- Versez le lysat dans le Canon d’une cartouche filtrante avec la PAC Attendez 10 min à température ambiante.
- Retirez le capuchon de la buse de sortie de cartouche, insérez un plongeur dans la cartouche et appuyez doucement sur le piston. Recueillir le filtrée lysat dans un tube de 50 mL.
- Ajouter 2,5 mL propriétaire de tampon du fabricant de la filtrée lysat, mixer le mélange en renversant le tube environ 10 fois et incuber le mélange sur la glace pendant 30 min.
- Appliquer le mélange de lysat filtré sur une colonne de filtrage qui a été préalablement équilibrée avec 10 mL de tampon équilibration. Laissez la colonne s’écouler par gravité.
- Laver la colonne avec le tampon de lavage 30 mL deux fois, puis éluer l’ADN de la colonne à l’aide du tampon d’élution de 15 mL.
- Ajouter isopropanol 10,5 mL (0,7 volumes) à la mémoire tampon d’ADN éluée, bien mélanger et centrifuger le mélange à 20 000 x g pendant 30 min à 4 ° C.
- Décanter le liquide surnageant avec soin, laver le culot d’ADN avec 5 mL exempte d’endotoxine d’éthanol à 70 % une fois et centrifuger à 20 000 x g pendant 10 min.
- Décanter le liquide surnageant, sécher le culot pendant 5-10 min sous une hotte chimique et dissoudre le culot dans 300-500 µL de tampon sans endotoxine.
- Déterminer la concentration de plasmide en mesurant l’absorption de la solution à UV 260/280 nm à l’aide d’un spectrophotomètre.
NOTE : Préparer le plasmide d’expression GFP utilisent le même protocole.
2. la transfection des cellules HEK293 avec le plasmide NR1-GFP Expression
- Aliquote 200 µL de solution de gélatine de 2 % à chaque puits d’une plaque de culture 48 puits et incuber les plaques à 37 ° C pendant au moins 30 min.
- Aspirer la solution de gélatine depuis les cellules de 5 x 104 HEK293 bien et semences dans 200 µL de milieu de culture cellulaire contenant 10 % de sérum bovin fœtal (SVF) dans chaque puits. Incuber les plaques à 37 ° C dans un incubateur humidifié fourni avec 5 % de CO2 pendant la nuit.
Remarque : Les cellules ont été comptés en utilisant un hémocytomètre. - Le lendemain, remplacer le milieu de culture usé avec 200 µL de milieu de culture frais contenant 10 % FBS / puits.
- Pour chaque bien, préparer la solution A en mélangeant 100 ng de plasmide NR1-tGFP avec le milieu de culture de 20 µL et solution B en mélangeant 0,8 µL de réactif de transfection avec 20 µL de milieu de culture. Multipliez le nombre de puits nécessaires pour préparer le volume total à chaque expérience.
- Préparer la solution C en mélangeant la solution A et solution B et incuber le mélange à ta pendant 20-30 min.
- Aliquote 40 µL de solution C dans chaque cupule contenant les cellules HEK293, doucement tournoyer la plaque et incuber les plaques à 37 ° C dans un incubateur humidifié fourni avec 5 % de CO2 pendant la nuit.
- Vérifier l’expression de protéine recombinante NR1-GFP dans les cellules de l’hôte sous microscope à fluorescence avec un grossissement de 40 X X-200 (excitation/émission : 482/502 nm) et procéder à l’analyse de l’immunofluorescence sur les cellules.
NOTE : Transfecter le plasmide d’expression GFP dans les cellules HEK293 utilisent le même protocole.
3. cell-based Immunofluorescence Assay
- Aspirez le milieu usé provenant des puits, puis laver chaque puits avec 200 µL de phosphate buffered saline (PBS), trois fois.
- Ajouter 200 µL de solution paraformaldéhyde à 4 % pour chaque puits ; Incuber la plaque à RT pendant 15 min.
- Aspirer la solution de paraformaldéhyde provenant des puits et laver chaque bien avec 200 µL de PBS trois fois.
- Ajouter 200 µL de 10 % de lait écrémé dans le PBST (0,1 % Tween-20 dans du PBS) solution à chaque puits et incuber la plaque à RT pendant 1 h avec agitant doucement.
- Aspirer le lait écrémé 10 % en solution PBST du puits, puis laver les puits avec 200 µL PBST une fois.
- Incuber les puits avec plasma dilué (1/100 dans le PBST) que l’anticorps primaire avec agitant doucement à la droite pendant 1 h.
NOTE : Plasma est obtenu à partir du sang de patients suspectés d’avoir encéphalite auto-immune. - Aspirer le plasma dilué provenant des puits et laver chaque puits avec 200 µL de PBST trois fois.
- Ajouter 200 µL de chèvre anti-IgG humaine couplé avec Alexa Fluor 594 (1:1, 000 dilution dans du PBST) dans chaque puits et incuber la plaque de culture à RT avec agitant doucement pendant 1 h.
- Aspirer la chèvre anti-IgG humaine couplé avec la solution d’Alexa Fluor 594 et laver chaque puits avec 200 µL de PBST trois fois.
- Ajouter 100 µL de solution de glycérol (50 % de glycérol dans du PBS et 1/100 000 de 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI)) dans chaque puits.
- Observer et les cellules sous un microscope à fluorescence à l’aide d’un 10 X oculaire et 4 X, 10 X et 20 X objectifs d’image.
Remarque : Utilisez le bon filtre pour chaque colorant : pour NR1-GFP (excitation/émission = 482/502 nm), pour Alexa Fluor 594 (excitation/émission = 561/594 nm), pour le DAPI (excitation/émission = 358/461 nm). Effectuer le contrôle négatif en utilisant les cellules HEK exprimant GFP de la même manière.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En moyenne, nous pourrions obtenir 200-300 µg expression exempte d’endotoxine plasmide NR1-GFP et GFP de culture bactérienne 250 mL suivant la procédure décrite à l’article 1 du protocole. Un montant de 100 ng/puits du plasmide expression a été utilisé pour la transfection des cellules HEK293 cultivées dans la plaque 48 puits comme décrit dans l’article 2 du protocole. 30-24 h après la transfection, les cellules expriment le NR1-GFP et protéines recombinantes GFP a peuvent être détectées sous microscope à fluorescence. Figure 1 a montre l’image des cellules hôte qui expriment le NR1-GFP, tandis que la Figure 1 montre les cellules exprimant la GFP. Le signal vert peut être utilisé comme un contrôleur de la qualité du test : environ 30 % des cellules étaient les signaux verts sous le microscope à fluorescence. Figure 1 a et 1 D montrent l’image des cellules hôte qui expriment le NR1-GFP. Le signal vert peut être utilisé comme un contrôleur de la qualité du test : environ 30 % des cellules étaient les signaux verts sous le microscope à fluorescence. Les cellules exprimant NR1-GFP ont été utilisés pour le dépistage de la présence d’anti-NMDA récepteur autoanticorps dans l’échantillon de plasma humain.
Dans le test d’immunofluorescence à base de cellules tel que décrit dans l’article 3 du protocole, le positif de contrôle échantillon (obtenu à partir d’une source commerciale, voir la Table des matières) a été ajouté au pool de plasmas en 01:10 dilution selon les instructions du fabricant. Le pool de plasma a été préparé à partir de 5 mâles et 5 femelles adultes. Figure 1 b est l’image de Alexa Fluor-594 du témoin positif après incubation avec l’expression de cellules NR1-GFP, tandis que la Figure 1E est l’image de Alexa Fluor-594 du témoin positif après incubation avec l’expression de cellules GFP. La figure 1 est l’image fusionnée de la Figure 1 a et 1 b de la Figure: il y a un chevauchement significatif des signaux verts et signaux rouges dans la même cellule, indiquant la co-localisation de NR1-GFP et les anticorps contre la sous-unité NR1 de NMDA récepteur (flèches). Un échantillon de plasma qui affiche plu de 30 % des recouvrements de vert et de signaux rouges seront interprétés comme positif dans ce cas. Figure 1F est l’image fusionnée de la Figure 1 et Figure 1E qui sert comme contrôle négatif pour le chiffre 1. La couleur rouge faible est la fluorescence de fond de l’image Alexa Fluor-594. Il y a peu de chevauchement des signaux rouges et verts, n’indiquant aucune liaison de l’auto-anticorps anti-NMDA de récepteurs contre la protéine recombinante.
Au cours de la mise en place des procédures expérimentales, nous avons observé un faible rapport signal-bruit de l’image Alexa Fluor-594, lorsque les échantillons de plasma ont été testés. Nous avons tenté d’optimiser le rapport signal sur bruit en procédant à une dilution en série de la plasma forme 01:10, 01:50, 1/100 et 1 : 200 et l’essai de différentes concentrations de Alex Fluor-594 marqué anticorps secondaire de 1/500 à 2 000:1. Nous avons trouvé cette dilution au 1/100 de la dilution 1 : 1 000 et le plasma ou le 1:2,000 de l’Alexa Fluor-594 étaient les conditions optimales pour l’interprétation des données.
Figure 1 : images représentatives du test d’immunofluorescence sur les cellules pour détecter des auto-anticorps récepteur anti-NMDA. (A) Image des cellules HEK293 qui expriment NR1-GFP. (B) The Alexa Fluor-594 image prise sur le même terrain de A après incubation avec l’échantillon de contrôle positif. Signal rouge indique la liaison de l’autoanticorps anti-NMDA récepteur le NR1 exprimé dans les cellules HEK293. (C) l’image fusionnée de A et B. Couleur jaune indique la co-localisation de la NR1 (signal vert) et les auto-anticorps de récepteurs anti-NMDA (signal rouge). Les flèches indiquent des exemples de certaines cellules éminents montrant la co-localisation de NR1-GFP et anti-NMDA autoanticorps récepteur. (D) Image de la HEK293 cellules exprimant NR1-GFP. (E) The Alexa Fluor-594 image prise sur le même terrain de D après incubation avec l’échantillon de contrôle positif. Faible signal rouge indique le bruit de fond d’image Alexa Fluor-594. (F) l’image fusionnée de D et E. Cette image sert comme témoin négatif, étant donné le peu jaune signal observé. L’image de contrôle négatif montre la liaison spécifique de l’anti-NMDA anticorps anti-récepteur à la GFP-NR1 dans le dosage. Toutes les images ont été prises cristallin de moins de 10 X et 20 X, objectif objectif. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Il existe plusieurs tests immunologiques à base de cellules pour dépister la présence d’auto-anticorps dirigés contre le récepteur NMDA rapportées dans la littérature, y compris direct sur les cellules immunofluorescence essai11, fixé le test d’immunofluorescence sur les cellules9 , et axée sur la cytométrie de flux test14. Le test d’immunofluorescence direct de base de cellules doit être effectué peu de temps après la préparation des cellules de façon ectopique exprimant la protéine NR1, tandis que le dosage d’axée sur la cytométrie de flux requiert un personnel formé et équipements spéciaux. Un test d’immunofluorescence fixe de base de cellules est un dosage plus commode qui peut être effectué pour les paramètres cliniques. Par conséquent, de nombreuses études utilisée l’essai commercial fixe sur les cellules par immunofluorescence indirecte d’écran anti-NMDA récepteur auto-anticorps dans le sérum et CSF spécimens12,15. Le kit utilisé (voir le tableau des matériaux) contient les cellules HEK293 fixes façon ectopique exprimant la sous-unité NR1 recombinante du récepteur NMDA. L’essai a été évaluée pour ont d’excellentes performances dans la détection de l’anticorps IgG anti-NMDA dans le sérum et le CSF spécimens12. Dans notre protocole, nous avons utilisé la même approche que celle recommandée par le fabricant du kit, excepté que nous utilisons plasmide expression NR1-GFP. La protéine GFP-NR1 peut être utilisée pour surveiller l’efficacité de transfection et la distribution des protéines NR1 dans chaque expérience. Par conséquent, il peut être utilisé comme une assurance de la qualité du test.
L’efficacité de la transfection du plasmide expression NR1-GFP dans les cellules HEK293 est environ 30 % dans le protocole présenté ici, qui est suffisant pour le test d’immunofluorescence. Cependant, nous avons constaté que l’intensité de la fluorescence verte n’est pas également répartie entre les cellules transfectées, ce qui suggère des différences dans l’efficacité de transfection ou expression capacité de cellules individuelles. Les différents niveaux d’expression de recombinant NR1-GFP dans différentes cellules provoquent intensité hétérogène lorsque l’image verte a été fusionné avec l’image rouge d’Alexa Fluor 594. La chèvre anti-IgG humaine couplé avec Alexa Fluor 594 servait de l’anticorps secondaire pour détecter la présence d’auto-anticorps humaine IgG anti. Nous avons constaté que la luminosité de Alexa Fluor 594 est relativement plus faible que celle de la protéine fluorescente verte. Nous avons essayé d’optimiser l’intensité du signal en augmentant la concentration de l’anti-IgG humaine couplé avec Alex Fluor 594, cependant, l’arrière-plan ont également augmenté. Par conséquent, la concentration optimale pour l’anti-IgG humaine couplé avec Alex Fluor 594 est 1 : 1 000 dans ce laboratoire. En outre, quelques échantillons de plasma avaient un fond très signal dans l’image Alexa Fluor 594. Différentes dilutions de plasma ont été testées, et il a été constaté qu’une dilution minimale de 1/100 est nécessaire pour obtenir un fond propre pour la plupart des échantillons. Par conséquent, nous vous recommandons de dilution au 1/100 de plasma comme étape standard dans le présent protocole. En comparaison avec les autres analyses cellulaires qui permettent de détecter l’échantillon de sérum à 01:10 et 01:20 dilution d’échantillon de sang11,16, ce protocole actuel n’a pas suffisamment sensibilité pour détecter les autoanticorps faible titre anti-NMDA récepteur, qui est une restriction du protocole.
Le protocole actuel est un test d’immunofluorescence fixe de base de cellules. La plaque de culture peut être entreposée au réfrigérateur de 4 ° C après fixation pour une utilisation ultérieure pendant environ 1 mois, en comparaison avec le dosage direct de basés sur les cellules qui ne peuvent être stocké pendant une longue période. Toutefois, la protéine NR1 va être dénaturé et perd sa conformation naturelle au cours de la procédure de fixation, ce qui peut influer sur la conformation de l’épitope qui se lie à l’anticorps de récepteur anti-NMDA. Par conséquent, certaines études adopté direct sur les cellules immunofluorescene11,17. Notre protocole peut être également modifié pour devenir un dosage direct sur les cellules immunofluorescence pour préserver la conformation naturelle de la protéine NR1, si nous Incuber l’échantillon de plasma avec les cellules vivantes tout d’abord et fixer les cellules plus tard. Ainsi, il y a flexibilité dans le protocole pour répondre au besoin de l’expérience.
Le récepteur NMDA est une protéine complexe hétérotétramère entre NR1 NR2A, NR2B, NR2C et NR2D. Le protocole actuel a été conçu pour détecter la classe IgG des auto-anticorps contre sous-unité NR1 du récepteur NMDA. Le protocole peut également être modifié pour détecter différents isotypes d’auto-anticorps, tant que les anticorps IgG anti-humain sont remplacés par l’autre catégorie spécifique des anticorps secondaires. En outre, le protocole actuel peut être modifié pour détecter la présence d’autoanticorps dirigés contre NR2A, NR2B, NR2C et NR2D, si le plasmide d’expression NR1-GFP est remplacé par le plasmide expression correspondante, respectivement.
Dans ce protocole, nous avons utilisé un échantillon de plasma au lieu du sérum, car nous prélèvent régulièrement des échantillon de sang avec anticoagulant à diverses fins d’étude, mais le protocole peut s’appliquer à sérum ou des échantillons de LCR. Le titre de l’anticorps dans le plasma peut être quantifié en dilutions de l’échantillon. En laboratoire, nous avons aussi testé la lignée de cellules fibroblastes de rein de singe vert africain (COS1) comme les cellules de l’hôte en utilisant le même protocole. Les résultats sont les mêmes que ceux qui utilisent les cellules HEK293, sauf que les cellules COS1 ont une efficacité de transfection légèrement plus faible que les cellules HEK293.
Pour vérifier la présence de l’anticorps de récepteur anti-NMDA, il est suggéré que des expériences additionnelles telles que l’immunohistochimie de dosage à l’aide de tissus cérébraux rongeurs et immunocytochimie utilisant des rongeurs cultivés primaires neurones être effectuée5 ,,9. Par conséquent, le protocole actuel seulement peut être considéré que comme un test de dépistage. Bien que sa validité expérimentale a été vérifiée à l’aide de l’échantillon de contrôle positif dans cette étude, la sensibilité et la spécificité de ce test en milieu clinique doivent être réalisés à l’avenir l’étude.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la Fondation médicale de Chang Gung (numéro de licence CMRPG3C1771, CMRPG3C1772, CMRPG3E0631, CMRPG3E0632 et CMRPG3E0633).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GRIN1 (GFP-tagged) - Human glutamate receptor, ionotropic, N-methyl D-aspartate 1 (GRIN1), transcript variant NR1-1 | Origene (Rockville, MD, USA) | RG219368 | NR1-cDNA clone tagged with C-terminal tGFP sequences |
| pCMV6-AC-GFP | Origene (Rockville, MD, USA) | PS100010 | mammalian vector with C-terminal tGFP tag |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen (Hilden Germany) | 12362 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) | 11668-019 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985-070 | |
| DMEM, High Glucose, Pyruvate | Thermo Fisher | 11995-065 | |
| Characterized Fetal Bovine Serum, US Origin | GE Healthcare Life Sciences | SH30071.01 | |
| Goat anti-Human IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | Thermo Fisher | A-11014 | |
| Positive control: anti-glutamate receptor (type NMDA) | Euroimmun AG, Lübeck, Germany | CA 112d-0101 | |
| Euroimmun Assay Kit |
References
- Linnoila, J. J., Rosenfeld, M. R., Dalmau, J. Neuronal surface antibody-mediated autoimmune encephalitis. Semin Neurol. 34 (4), 458-466 (2014).
- Lancaster, E. The diagnosis and treatment of autoimmune Encephalitis. J Clin Neurol. 12 (1), 1-13 (2016).
- Pruss, H., et al. Retrospective analysis of NMDA receptor antibodies in encephalitis of unknown origin. Neurology. 75 (19), 1735-1739 (2010).
- Leypoldt, F., Armangue, T., Dalmau, J. Autoimmune encephalopathies. Ann N Y Acad Sci. 1338, 94-114 (2015).
- Dalmau, J., et al. Anti-NMDA-receptor encephalitis: case series and analysis of the effects of antibodies. Lancet Neurol. 7 (12), 1091-1098 (2008).
- Titulaer, M. J., et al. Treatment and prognostic factors for long-term outcome in patients with anti-NMDA receptor encephalitis: an observational cohort study. Lancet Neurol. 12 (2), 157-165 (2013).
- Chapman, M. R., Vause, H. E. Anti-NMDA receptor encephalitis: diagnosis, psychiatric presentation, and treatment. Am J Psychiatry. 168 (3), 245-251 (2011).
- Gable, M., Glaser, C. Anti-n-methyl-d-aspartate receptor encephalitis appearing as a new-onset psychosis: disease course in children and adolescents within the california encephalitis project. Pediatr Neurol. 72, 25-30 (2017).
- Dalmau, J., Lancaster, E., Martinez-Hernandez, E., Rosenfeld, M. R., Balice-Gordon, R. Clinical experience and laboratory investigations in patients with anti-NMDAR encephalitis. Lancet Neurol. 10 (1), 63-74 (2011).
- Dalmau, J., et al. Paraneoplastic anti-N-methyl-D-aspartate receptor encephalitis associated with ovarian teratoma. Ann Neurol. 61 (1), 25-36 (2007).
- Irani, S. R., et al. N-methyl-D-aspartate antibody encephalitis: temporal progression of clinical and paraclinical observations in a predominantly non-paraneoplastic disorder of both sexes. Brain. 133 (Pt 6), 1655-1667 (2010).
- Suh-Lailam, B. B., Haven, T. R., Copple, S. S., Knapp, D., Jaskowski, T. D., Tebo, A. E. Anti-NMDA-receptor antibody encephalitis: performance evaluation and laboratory experience with the anti-NMDA-receptor IgG assay. Clin Chim Acta. 421, 1-6 (2013).
- Mayer, M. L. Structural biology of glutamate receptor ion channel complexes. Curr Opin Struct Biol. 41, 119-127 (2016).
- Ramberger, M., et al. Comparison of diagnostic accuracy of microscopy and flow cytometry in evaluating n-methyl-d-aspartate receptor antibodies in serum using a live cell-based assay. PLoS One. 10 (3), e0122037 (2015).
- Wandinger, K. P., Saschenbrecker, S., Stoecker, W., Dalmau, J. Anti-NMDA-receptor encephalitis: a severe, multistage, treatable disorder presenting with psychosis. J Neuroimmunol. 231 (1-2), 86-91 (2011).
- Dahm, L., et al. Seroprevalence of autoantibodies against brain antigens in health and disease. Ann Neurol. 76 (1), 82-94 (2014).
- Jézéquel, J., et al. Cell- and single molecule-based methods to detect anti-n-methyl-d-aspartate receptor autoantibodies in patients with first-episode psychosis from the OPTiMiSE project. Biol Psychiatry. , (2017).
