Summary
אנחנו ectopically לידי יחידת משנה NR1 של קולטן NMDA מתויג עם חלבון פלואורסצנטי ירוק בתאים עובריים אנושיים (HEK293) כמו אנטיגן לזהות עצמיים כנגד קולטן NMDA בדם של חולים חשוד עם דלקת אוטואימונית. שיטה פשוטה זו עשויה להיות מתאימים לסינון למטרות בהגדרות קליניים.
Abstract
הנוכחות של נוגדן anti-NMDA הקולטן עצמי יכול לגרום לסימפטומים מנוטלי שונים של חולים מושפעת, כינה דלקת אוטואימונית של קולטן אנטי-NMDA. זיהוי נוגדן עצמי ספציפי נגד קולטן NMDA דם או נוזל מוחי שדרתי (CSF) חיונית לאבחון מדויק של מצב זה. קולטן NMDA הוא יון ערוץ חלבון מורכב המכיל ארבע subunits, כולל שני חובה NMDA קולטן יחידת משנה 1 (NR1), אחד או שניים קולטן NMDA 2A יחידה משנית (NR2A), 2B יחידת משנה של קולטן NMDA (NR2B), יחידת משנה של קולטן NMDA 2C (NR2C), או קולטן NMDA יחידת משנה 2D (NR2D). Epitope של נוגדן anti-NMDA הקולטן עצמי נמסר להיות נוכח בכל תחום N-מסוף חוץ-תאי של יחידת משנה NR1 של קולטן NMDA. מטרתו של מחקר זה היא לפתח וזמינותו פשוטה מבוססת-תא immunofluorescence יכול לשמש כבדיקת סינון כדי לזהות הנוכחות של עצמיים נגד NR1 יחידת משנה של קולטן NMDA בדם כדי להקל על מחקר קליני ובסיסי של דלקת אוטואימונית קולטן אנטי-NMDA.
Introduction
דלקת אוטואימונית של קולטן אנטי-NMDA הינה ישות לאחרונה המחלה יכולה להתרחש אצל חולים בכל הגילאים, והוא משפיע בעיקר המטופלות1,2. . זה אחד אנצפליטיס מאובחנים לעתים קרובות ביותר בקרב מטופלים עם אטיולוגיה לא ידועה הראשונית של דלקת קרום המוח3 החולים מושפעים עם אנטי-NMDA קולטן אנצפליטיס בדרך כלל יש prodromal סימפטומים של כאב או חום, ואחריו התפתחות מהירה של התודעה רמת השינוי ומגוון רחב של סימפטומים מנוטלי חריפה, כולל עצבנות, רגזנות , חרדה, נדודי שינה, הזיות, אשליות, תוקפנות, התנהגויות מוזרות, הפרעות התנועה, dysregulation אוטונומי, ותפיסה תוקף4,5. זיהוי מוקדם של תנאי זה במועד טיפול עם חיסוני חשובים תוצאה טובה יותר, החלמה מלאה אפילו חולים מושפעת6. לפיכך, הוא הציע כי דלקת אוטואימונית של קולטן אנטי-NMDA צריך להיחשב אבחנה מבדלת חשוב מהחולים בדלקת חריפה או התפרצות חדשה תכונות פסיכוטיות7,8.
מלבד תכונות קליני, זיהוי של נוגדן עצמי נגד קולטן NMDA דם או נוזל מוחי-שדרתי חיונית לאבחון מדויק של אנטי-NMDA קולטן דלקת אוטואימונית9. רוב הבדיקות אימונולוגי כדי לזהות את נוגדן עצמי קולטן NMDA נגד זמינים כמה מחקר מעבדות10,11, ויש אחד בלבד זמינים מסחרית מבוססת-תא immunofluorescence assay להקרנה אנטי-NMDA קולטן עצמיים12. מטרתו של מחקר זה היא לפתח וזמינותו פשוטה ללא צורך במיקור חוץ immunofluorescence מבוססת תא בנוחות ניתן במעבדה למסך את הנוכחות של אנטי-NMDA עצמיים קולטן כדי לקדם את המחקר הקליני של קולטן NMDA-נגד דלקת אוטואימונית. קולטן NMDA הוא heterotetramer יון ערוץ חלבון מורכב הביעו במפורש במוח. הוא עשוי שתי subunits NR1 חובה, ואת השילוב של subunits אחד או שניים של NR2A, NR2B, NR2C או NR2D13. מחקר קודם דיווחו כי epitope הראשי ממוקד על ידי הנוגדנים התחום N-מסוף חוץ-תאי של יחידת משנה NR15. לפיכך, ב פרוטוקול זה, אנו מבטאים את החלבון NR1-יחידת משנה רקומביננטי האנושי של קולטן NMDA מתויג עם חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) בשורת תאים אפיתל כליות עובריים אנושיים (HEK293), ולפתח assay מבוססת-תא immunofluorescence כדי לזהות מחלקת IgG של אנטי-NMDA קולטן עצמיים בדם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
המחקר אושרה על ידי המוסדיים סקירה לוח של צ'אנג קונג ממוריאל החולים לפי Linkuo, שוויץ (102-2577A3).
1. הכנת פלסמיד ביטוי NR1-GFP
- מיקס 10 ng של NR1-GFP פלסמיד עם 100 µL של זן תאים המוסמכת Escherichia coli DH5α ב mL 1.5 סטרילי צנטריפוגה שפופרת, pipet התערובת בעדינות למעלה ולמטה בעיות 4 - 6 פעמים, דגירה הצינור על קרח למשך 20 דקות.
- דגירה הצינור ב 42 ° C עבור 1 דקות באמבט מים, להסיר את הצינור לאמבט מים, להוסיף 1 מ"ל lysogeny מרק (LB) בינוני לתוך הצינור, דגירה הצינור ב 37 מעלות צלזיוס בתוך אינקובטור ברעידות לשעה.
- להפיץ את µL 50 של התערובת על צלחת אגר LB המכיל אמפיצילין (0.1 mg/mL), דגירה של צלחת אגר LB ב 37 מעלות צלזיוס בתוך אינקובטור בן לילה.
- לבחור מושבה בודדת מהצלחת לילה LB אגר באמצעות טיפ סטרילי, ו מערבולת הטיפ ב צינור התרבות חיידקי המכיל 5 מ ל LB בינונית, אמפיצילין (0.1 mg/mL). דגירה הצינור ב 37 מעלות צלזיוס בתוך אינקובטור ברעידות בן לילה.
- Aliquot 3 מ"ל של התרבות חיידקי לילה לתוך בקבוקון 500 מ"ל המכיל 250 מ ל LB סטרילי בינוני אמפיצילין (0.1 mg/mL). דגירה. הבקבוק ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות. לבדוק באופן קבוע את צפיפות סיב אופטי (OD) של התרבות חיידקי-גל של 600 nm באמצעות ספקטרומטר עד OD600 מגיע 0.6-1.0.
הערה: מערבבים היטב 800 µL של התרבות חיידקי לילה עם 200 גליצרול µL להכין את המניה גליצרול, ולאחסן את המניה גליצרול תחת-80 ° C לשימוש עתידי. - להכין NR1-GFP פלסמיד ביטוי מן התרבות חיידקי 250 מ
- לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ב 6,000 g x למשך 15 דקות ב 4 º C.
- Resuspend בגדר חיידקים 10 מ"ל resuspension מאגר המכיל RNase A; מערבולת ביסודיות עד סבך לא נתפסת.
- להוסיף 10 מ ל מאגר פירוק המתלה חיידקי בעדינות להפוך את התערובת 4 - 6 פעמים, דגירה lysate בטמפרטורת החדר (RT) במשך 5 דקות.
- להוסיף 10 מ ל משקעים טרום מקורר מאגר lysate, היפוך בעדינות את התערובת 4 - 6 פעמים.
- שופכים את lysate לתוך החבית של מחסנית מסנן עם הכיפה על; לחכות 10 דקות ב- RT.
- להסיר את הכובע של הצינור לשקע מחסנית הכנס פומפה לתוך הדיו, לחץ בעדינות על הבוכנה. לאסוף את המסוננות lysate לתוך צינור 50 מ ל.
- להוסיף 2.5 מ ל קניינית מאגר מהיצרן כדי המסוננת lysate, לערבב את התערובת על ידי היפוך הצינורית כ 10 פעמים, דגירה התערובת בקירור למשך 30 דקות.
- החל את התערובת lysate מסוננים עמודה מסנן זה היה מראש equilibrated עם 10 מ"ל equilibration מאגר. לאפשר את העמודה לנקז חוק המשיכה.
- לשטוף את העמודה עם מאגר לשטוף 30 מ ל פעמיים, ולאחר מכן elute DNA מן העמודה באמצעות מאגר • תנאי 15 מ"ל.
- להוסיף אלכוהול איזופרופיל 10.5 מ ל (0.7 כרכים) מאגר ה-DNA eluted, מערבבים היטב, וכן centrifuge את התערובת ב g x 20,000 למשך 30 דקות ב 4 º C.
- Decant את תגובת שיקוע בקפידה בגדר DNA עם אתנול 70% ללא אנדוטוקסין מ ל פעם אחת, וקונטה צנטריפוגה-g x 20,000 עבור 10 דקות.
- Decant את תגובת שיקוע, מתייבשים בגדר למשך 5-10 דקות בשכונה כימי, להמיס בגדר ב- 300-500 µL אנדוטוקסין ללא מאגר.
- לקבוע את הריכוז פלסמיד על ידי מדידת ספיגת הפתרון ב UV 260/280 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטרים.
הערה: להכין את הביטוי פלסמיד GFP שימוש באותו הפרוטוקול.
2. תקנים של תאים HEK293 עם NR1-GFP ביטוי פלסמיד
- Aliquot µL 200, ג'לטין 2% לפתרון אחד טוב של צלחת התרבות 48-ובכן, דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות.
- האחות הפתרון ג'לטין מתאי 5 x 104 HEK293 היטב, הזרע ב 200 µL בינוני התרבות התא המכיל 10% עוברית שור סרום (FBS) כל היטב. דגירה לצלחת-37 מעלות צלזיוס חממה humidified שסופק עם 5% CO2 בן לילה.
הערה: תאים נספרו באמצעות של hemocytometer. - ביום הבא, להחליף את המדיום תרבות בילה µL 200 טרי בינוני תרבות המכיל 10% FBS לכל טוב.
- עבור כל יחידה, להכין פתרון A על ידי ערבוב 100 ננוגרם של פלסמיד NR1-tGFP עם 20 µL תרבות בינוני, פתרון B על ידי ערבוב 0.8 ריאגנט תרביות תאים µL 20 µL תרבות בינונית. הכפל את מספר בארות דרושים כדי להכין את הנפח הכולל עבור כל ניסוי.
- להכין פתרון C על ידי ערבוב פתרון A ו- B פתרון, דגירה התערובת ב RT למשך 20-30 דקות.
- Aliquot µL 40 לפתרון C כל טוב המכילה תאי HEK293, מערבולת את הצלחת בעדינות, דגירה לצלחת-37 מעלות צלזיוס חממה humidified שסופק עם 5% CO2 בן לילה.
- בדוק את הביטוי של NR1-GFP חלבון רקומביננטי בתאי המארח במיקרוסקופ פלואורסצנטי עם 40 X-200 X הגדלה (עירור/פליטה: 482/502 nm), והמשך וזמינותו מבוססת-תא immunofluorescence.
הערה: Transfect את פלסמיד ביטוי GFP לתוך התאים HEK293 תוך שימוש באותו הפרוטוקול.
3. מבוססת-תא Immunofluorescence Assay
- האחות המדיום בילה מן הבארות, ואז תשטוף בכל טוב עם µL 200 של פוספט buffered מלוחים (PBS) שלוש פעמים.
- להוסיף 200 µL של 4% paraformaldehyde פתרון כל טוב; דגירה את הצלחת ב RT למשך 15 דקות.
- האחות הפתרון paraformaldehyde מן הבארות, ולשטוף את כל טוב עם µL 200 ל- PBS שלוש פעמים.
- להוסיף 200 µL של חלב רזה 10% ב- PBST (0.1% Tween-20 ב- PBS) פתרון אחד טוב, דגירה את הצלחת ב RT עבור h 1 ברעידות עדין.
- האחות של חלב רזה 10% הפתרון PBST מן הבאר, ולאחר מכן לשטוף פעם הבארות עם 200 µL PBST.
- דגירה הבארות עם פלזמה מדולל (בטחונות ב PBST) כמו נוגדן ראשוני עם טלטול עדין-RT לשעה.
הערה: פלזמה מתקבל מהדם של חולים החשודים יש דלקת אוטואימונית. - האחות פלזמה מדולל מן הבארות, ולשטוף כל טוב עם 200 µL של PBST שלוש פעמים.
- להוסיף 200 µL של עז בן אנוש אנטי איג מצומדת עם אלקסה עבור חיל הים 594 (1:1, 000 דילול ב- PBST) כדי מכל קידוח, דגירה לצלחת תרבות ב RT עם טלטול עדין לשעה.
- תשאף עז האנושי אנטי איג מצומדת עם אלקסה עבור חיל הים 594 פתרון, ולשטוף כל טוב עם 200 µL של PBST שלוש פעמים.
- להוסיף 100 µL גליצרול פתרון (50% גליצרול PBS, כוללות של 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי)) כל טוב.
- לצפות, תמונה התאים במיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות 10 X עינית, ו- 4 X 10 X, 20 X מטרות.
הערה: השתמש במסנן המתאים עבור כל צבע: עבור NR1-GFP (עירור/פליטה = 482/502 nm), עבור אלקסה עבור חיל הים 594 (עירור/פליטה = 561/594 nm), עבור דאפי (עירור/פליטה = 358/461 ננומטר). לנהל את הפקד שליליים באמצעות התאים HEK לבטא GFP באותה דרך.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בממוצע, אנחנו יכולים להשיג 200-300 µg ביטוי נטולת אנדוטוקסין פלסמיד NR1-GFP GFP מתרבות חיידקי 250 מ ל ביצוע הפרוצדורות המתוארות בסעיף 1 של הפרוטוקול. כמות של 100 ng/טוב של פלסמיד הביטוי שימשה תרביות תאים של תאי HEK293 תרבותי בצלחת 48-ובכן, כמתואר בסעיף 2 של הפרוטוקול. h 24-30 לאחר תרביות תאים, התאים הביע את NR1-GFP, חומרים GFP עשוי לזהות במיקרוסקופ פלואורסצנטי. איור 1A מציג את התמונה של התאים מארח לבטא את NR1-GFP, בעוד דמות 1D מראה התאים לבטא GFP. האות ירוק יכול לשמש כבקר איכות של וזמינותו: כ-30% של התאים היה את האותות ירוק במיקרוסקופ פלואורסצנטי. איור 1A ו- 1 D הצג את התמונה של התאים מארח לבטא את NR1-GFP. האות ירוק יכול לשמש כבקר איכות של וזמינותו: כ-30% של התאים היה את האותות ירוק במיקרוסקופ פלואורסצנטי. התאים לבטא NR1-GFP שימשו הקרנת הנוכחות של אנטי-NMDA עצמיים קולטן במדגם לפלסמה אנושית.
במבוססת-תא immunofluorescence assay כמתואר בסעיף 3 של הפרוטוקול, החיובי בקרת מדגם (המתקבל מקור מסחרי, ראה טבלה של חומרים) נוספה ב- 1:10 פלזמה במאגר דילול על פי הוראות היצרן. פלזמה במאגר הוכן מן הזכרים הבוגרים 5 ו 5 נקבות למבוגרים. איור 1B היא התמונה עבור חיל הים אלקסה-594 דגימת בקרה חיובית לאחר דגירה עם הביטוי תאים NR1-GFP, בעוד איור 1E הוא דמות אלקסה עבור חיל הים-594 דגימת בקרה חיובית לאחר דגירה עם הביטוי תאים GFP. איור 1C הוא התמונה הממוזגת של איור 1A , איור 1B: ישנם חופף משמעותית של אותות ירוק ו אדום אותות באותו התא, לוקליזציה משותף של NR1-GFP, הנוגדנים נגד יחידת משנה NR1 של NMDA קולטן (חיצים). מדגם פלזמה המציג גדול מ- 30% חופף של ירוק, אדום אותות יפורשו כערכים חיובי במקרה זה. איור 1F היא התמונה הממוזגת 1D איור , איור 1E המשמשת הפקד שלילי עבור איור 1C. צבע אדום חלש הוא רקע זריחה של התמונה עבור חיל הים אלקסה-594. יש חפיפה מועטה של אותות ירוק ואדום, המציין אין איגוד של נוגדן עצמי קולטן NMDA-נגד נגד חלבון רקומביננטי.
במהלך הקמת ההליכים ניסיוני, הבחנו ביחס אות לרעש של התמונה עבור חיל הים אלקסה-594 כאשר הדגימות פלזמה נבדקו. ניסינו למטב את יחס אות לרעש על-ידי עריכת לדילול פלזמה טופס 1:10, 1:50, בטחונות, טורי, 1:200, ובדיקות ריכוזים שונים של אלכס עבור חיל הים-594 שכותרתו נוגדנים משניים מן שבערך כ- 1:2, 000. מצאנו את דילול בטחונות של דילול פלזמה ו 1:1,000 או 1:2,000 של אלקסה עבור חיל הים-594 היו תנאים אופטימליים הפרשנות של הנתונים.
איור 1: להחליפן בתמונות של וזמינותו מבוססת-תא immunofluorescence לאיתור נוגדן עצמי קולטן NMDA-נגד- (א) תמונה של התאים HEK293 אקספרס NR1-GFP. (B) תמונה אלקסה עבור חיל הים-594 שנלקחו באותו שדה א לאחר דגירה עם הדגימה בקרה חיובית. אדום מציין את הכריכה של עצמיים קולטן אנטי-NMDA NR1 הביע בתאים HEK293. (ג) התמונה הממוזגת של A ו- B. צבע צהוב מציין לוקליזציה שיתוף של NR1 (אות ירוק), את עצמיים קולטן NMDA-נגד (אות אדומה). חיצים מציינים דוגמאות של כמה תאים בולטים מציג שיתוף לוקליזציה של NR1-GFP, אנטי-NMDA קולטן עצמיים. (ד) התמונה של HEK293 תאים NR1 לביטוי-GFP. (E) אלקסה עבור חיל הים-594 תמונות שנלקחו באותו שדה D לאחר דגירה עם הדגימה בקרה חיובית. האות חלש אדום מציין רעש רקע של תמונה עבור חיל הים אלקסה-594. (F) התמונה הממוזגת של D ו- E. תמונה זו משמשת פקד שלילית, כמו אות קטן וצהוב שנצפו. התמונה שליטה שלילי מראה הכריכה ספציפי של האנטי-NMDA נוגדנים לקולטן NR1-GFP וזמינותו. כל התמונות צולמו 10 X עדשת העין ויעד 20 X עדשה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ישנם מספר מבוססת תא אימונולוגי מבחני למסך את הנוכחות של עצמיים כנגד קולטן NMDA שדווחו בספרות, כולל חיים מבוססת-תא immunofluorescence assay11, קבוע מבוססת-תא immunofluorescence assay9 , ואת וזמינותו מבוססי cytometry זרימה14. וזמינותו immunofluorescence מבוססת תא חי יש לבצעו מיד לאחר ההכנה של תאים ectopically לבטא את החלבון NR1, בזמן וזמינותו מבוססי cytometry זרימה דורש צוות מיומן וציוד מיוחד. Assay קבוע מבוססת-תא immunofluorescence הוא assay יותר נוח זה יכול להתבצע עבור הגדרות קליניים. לפיכך, מחקרים רבים השתמשו וזמינותו המסחרית עקיף קבוע מבוססת-תא immunofluorescence אל מסך אנטי-NMDA קולטן נוגדן עצמי סרום ו CSF דגימות12,15. ערכת בשימוש (ראה הטבלה של חומרים) מכיל את התאים HEK293 קבוע ectopically לבטא את יחידת משנה NR1 רקומביננטי של קולטן NMDA. וזמינותו יוערכו יש ביצועים מצוינים באיתור נוגדן anti-NMDA קולטן IgG בסרום, דגימות נוזל מוחי-שדרתי12. בפרוטוקול שלנו, השתמשנו אותה גישה עד כדי כך המומלץ על ידי היצרן קיט, פרט לכך נשתמש פלסמיד ביטוי NR1-GFP. החלבון NR1-GFP יכול לשמש כדי לנטר את יעילות תרביות תאים, והפצה של חלבון NR1 ניסוי. ומכאן, זה יכול לשמש כמו אבטחת איכות של וזמינותו.
יעילות תרביות תאים NR1-GFP ביטוי פלסמיד לתאים HEK293 הוא כ- 30% בפרוטוקול המובאים כאן, שהוא מספיק עבור וזמינותו immunofluorescence. עם זאת, מצאנו כי עוצמת קרינה פלואורסצנטית ירוק לא מחולק בין תאי transfected, רומז הבדלי היעילות של תרביות תאים או ביטוי ליכולת של תאים בודדים. רמות ביטוי משתנות של רקומביננטי NR1-GFP בתאים שונים לגרום heterogenous בעוצמה כאשר הדימוי הירוק היה התמזגה עם הדמות האדומה של אלקסה עבור חיל הים 594. האדם עז אנטי שאיג מצומדת עם אלקסה עבור חיל הים 594 שימש הנוגדן משני כדי לזהות הנוכחות של נוגדן עצמי אנושי IgG הכיתה. מצאנו כי הבהירות של אלקסה עבור חיל הים 594 הוא יחסית חלש יותר מזה של החלבון הניאון הירוקים. ניסינו למטב את עוצמת האות על ידי הגברת הריכוז של האדם אנטי שאיג מצומדת עם אלכס 594 עבור חיל הים, עם זאת, על רקע גדל גם כן. ומכאן, ריכוז אופטימלי עבור האדם אנטי שאיג מצומדת עם אלכס 594 עבור חיל הים הוא 1:1,000 במעבדה. בנוסף, דגימות פלסמה היה רקע גבוה באופן משמעותי אות בתמונה אלקסה 594 עבור חיל הים. דילולים שונים של פלסמה נבדקו, התברר כי לדילול מינימלי בטחונות הכרחי לקבל רקע נקי עבור רוב הדגימות. לפיכך, אנו ממליצים דילול בטחונות של פלסמה כשלב סטנדרטי של פרוטוקול זה. בהשוואה של אחרים מבוססת תא מבחני שיכול לזהות את דגימת נסיוב ב- 1:10 ו- 1:20 לדילול דם מדגם11,16, פרוטוקול זה הנוכחי אין רגישות מספיק כדי לזהות כייל נמוך אנטי-NMDA קולטן עצמיים, זו מגבלה של הפרוטוקול.
בפרוטוקול הנוכחי הוא assay קבוע מבוססת-תא immunofluorescence. הצלחת התרבות ניתן לאחסן במקרר 4 ° C לאחר קיבוע לשימוש מאוחר יותר עבור עד 1 החודש, לעומת וזמינותו מבוססת תא חי שאין אפשרות לאחסנם במשך זמן רב. עם זאת, החלבון NR1 שפגע בסימני ולאבד שלה קונפורמציה טבעי במהלך ההליך קיבעון, אשר עשוי להשפיע על שיאשר epitope המאגד עצמיים קולטן NMDA-נגד. לפיכך, מספר מחקרים אימצה בשידור חי מבוססת-תא immunofluorescene11,17. פרוטוקול שלנו יכול להיות שונה לחלופין להפוך assay בשידור חי מבוססת-תא immunofluorescence כדי לשמר את קונפורמציה הטבעי של החלבון NR1, אם אנחנו דגירה המדגם פלזמה עם תאי חיה קודם, לתקן את התאים מאוחר יותר. לפיכך, יש גמישות בפרוטוקול כדי לענות על הצורך של הניסוי.
קולטן NMDA הוא חלבון מורכב heterotetramer המורכב NR1, NR2A, NR2B, NR2C ו- NR2D. בפרוטוקול הנוכחי נועד לזהות את המחלקה IgG של נוגדן עצמי נגד NR1 יחידת משנה של קולטן NMDA. כן, ניתן לשנות את הפרוטוקול כדי לזהות isotypes שונים של עצמיים, ככל הנוגדנים משני של IgG נגד מוחלפים על-ידי מחלקת ספציפיים אחרים של נוגדנים משניים. יתר על כן, ניתן לשנות את הפרוטוקול הנוכחי כדי לזהות הנוכחות של עצמיים נגד NR2A, NR2B, NR2C, NR2D, אם פלסמיד ביטוי NR1-GFP מוחלף פלסמיד התואם הביטוי, בהתאמה.
ב פרוטוקול זה, השתמשנו דגימה פלזמה במקום סרום, כי אנו באופן שגרתי לאסוף דגימת דם עם אנטי מקריש למטרות מחקר שונות, אבל הפרוטוקול שבאפשרותך להחיל על סרום או דגימות נוזל מוחי-שדרתי. ניתן לכמת את כייל של עצמיים ב הפלזמה על ידי דילול טורי של המדגם. במעבדה, בדקנו גם הקו תאי פיברובלסט דמוי הכליה הקוף הירוק אפריקה (COS1) של התאים מארח משתמש באותו הפרוטוקול. התוצאות יהיו זהות לאלה באמצעות תאי HEK293, חוץ מזה COS1 התאים יש יעילות תרביות תאים מעט נמוך יותר מאשר התאים HEK293.
לבירור על הימצאות עצמיים קולטן NMDA-נגד, הוא הציע כי ניסויים נוספים כגון אימונוהיסטוכימיה assay שימוש ברקמות המוח מכרסמים, immunocytochemistry באמצעות ראשי מכרסם בתרבית נוירונים ניתן לבצע5 ,9. לפיכך, בפרוטוקול הנוכחי יכול להיחשב רק כ וזמינותו ההקרנה. למרות תוקפו ניסיוני אומתה באמצעות המדגם בקרה חיובית במחקר זה, הרגישות, זה הדבר הזה assay בהגדרות קליני צריך שיוקמו בעתיד ללמוד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי צ'נג קונג רפואי קרן (גרנט מספר CMRPG3C1771, CMRPG3C1772, CMRPG3E0631, CMRPG3E0632 ו- CMRPG3E0633).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GRIN1 (GFP-tagged) - Human glutamate receptor, ionotropic, N-methyl D-aspartate 1 (GRIN1), transcript variant NR1-1 | Origene (Rockville, MD, USA) | RG219368 | NR1-cDNA clone tagged with C-terminal tGFP sequences |
| pCMV6-AC-GFP | Origene (Rockville, MD, USA) | PS100010 | mammalian vector with C-terminal tGFP tag |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen (Hilden Germany) | 12362 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) | 11668-019 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985-070 | |
| DMEM, High Glucose, Pyruvate | Thermo Fisher | 11995-065 | |
| Characterized Fetal Bovine Serum, US Origin | GE Healthcare Life Sciences | SH30071.01 | |
| Goat anti-Human IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | Thermo Fisher | A-11014 | |
| Positive control: anti-glutamate receptor (type NMDA) | Euroimmun AG, Lübeck, Germany | CA 112d-0101 | |
| Euroimmun Assay Kit |
References
- Linnoila, J. J., Rosenfeld, M. R., Dalmau, J. Neuronal surface antibody-mediated autoimmune encephalitis. Semin Neurol. 34 (4), 458-466 (2014).
- Lancaster, E. The diagnosis and treatment of autoimmune Encephalitis. J Clin Neurol. 12 (1), 1-13 (2016).
- Pruss, H., et al. Retrospective analysis of NMDA receptor antibodies in encephalitis of unknown origin. Neurology. 75 (19), 1735-1739 (2010).
- Leypoldt, F., Armangue, T., Dalmau, J. Autoimmune encephalopathies. Ann N Y Acad Sci. 1338, 94-114 (2015).
- Dalmau, J., et al. Anti-NMDA-receptor encephalitis: case series and analysis of the effects of antibodies. Lancet Neurol. 7 (12), 1091-1098 (2008).
- Titulaer, M. J., et al. Treatment and prognostic factors for long-term outcome in patients with anti-NMDA receptor encephalitis: an observational cohort study. Lancet Neurol. 12 (2), 157-165 (2013).
- Chapman, M. R., Vause, H. E. Anti-NMDA receptor encephalitis: diagnosis, psychiatric presentation, and treatment. Am J Psychiatry. 168 (3), 245-251 (2011).
- Gable, M., Glaser, C. Anti-n-methyl-d-aspartate receptor encephalitis appearing as a new-onset psychosis: disease course in children and adolescents within the california encephalitis project. Pediatr Neurol. 72, 25-30 (2017).
- Dalmau, J., Lancaster, E., Martinez-Hernandez, E., Rosenfeld, M. R., Balice-Gordon, R. Clinical experience and laboratory investigations in patients with anti-NMDAR encephalitis. Lancet Neurol. 10 (1), 63-74 (2011).
- Dalmau, J., et al. Paraneoplastic anti-N-methyl-D-aspartate receptor encephalitis associated with ovarian teratoma. Ann Neurol. 61 (1), 25-36 (2007).
- Irani, S. R., et al. N-methyl-D-aspartate antibody encephalitis: temporal progression of clinical and paraclinical observations in a predominantly non-paraneoplastic disorder of both sexes. Brain. 133 (Pt 6), 1655-1667 (2010).
- Suh-Lailam, B. B., Haven, T. R., Copple, S. S., Knapp, D., Jaskowski, T. D., Tebo, A. E. Anti-NMDA-receptor antibody encephalitis: performance evaluation and laboratory experience with the anti-NMDA-receptor IgG assay. Clin Chim Acta. 421, 1-6 (2013).
- Mayer, M. L. Structural biology of glutamate receptor ion channel complexes. Curr Opin Struct Biol. 41, 119-127 (2016).
- Ramberger, M., et al. Comparison of diagnostic accuracy of microscopy and flow cytometry in evaluating n-methyl-d-aspartate receptor antibodies in serum using a live cell-based assay. PLoS One. 10 (3), e0122037 (2015).
- Wandinger, K. P., Saschenbrecker, S., Stoecker, W., Dalmau, J. Anti-NMDA-receptor encephalitis: a severe, multistage, treatable disorder presenting with psychosis. J Neuroimmunol. 231 (1-2), 86-91 (2011).
- Dahm, L., et al. Seroprevalence of autoantibodies against brain antigens in health and disease. Ann Neurol. 76 (1), 82-94 (2014).
- Jézéquel, J., et al. Cell- and single molecule-based methods to detect anti-n-methyl-d-aspartate receptor autoantibodies in patients with first-episode psychosis from the OPTiMiSE project. Biol Psychiatry. , (2017).
