Abbiamo ectopically espresso NR1 subunità del recettore NMDA etichettato come proteina fluorescente verde in cellule embrionali umane (HEK293) come antigene per rilevare autoanticorpi diretti contro il recettore NMDA nel sangue di pazienti con sospettata con l'encefalite autoimmune. Questo semplice metodo può essere adatto per scopi nelle regolazioni cliniche di screening.
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Articolo metodologico
Un semplice Cell-based immunofluorescenza per rilevare autoanticorpi contro il recettore N-metil-D-aspartato (NMDA) nel sangue
In questo articolo
Sommario
Abstract
La presenza degli autoanticorpi del recettore anti-NMDA può causare vari sintomi neuropsichiatrici in pazienti commoventi, definiti l'encefalite autoimmune di anti-NMDA receptor. L'individuazione degli specifici autoanticorpi contro il recettore NMDA nel sangue o liquido cerebrospinale (CSF) è essenziale per la diagnosi esatta di questa condizione. Il recettore NMDA è un complesso di proteine canale dello ione che contiene quattro subunità, tra cui due subunità di ricevitore NMDA 1 (NR1) obbligatoria e recettore NMDA uno o due subunità 2A (NR2A), 2B di subunità del recettore NMDA (NR2B), unità secondaria del ricevitore NMDA 2C (NR2C), o del recettore NMDA subunità 2D (NR2D). L'epitopo di autoanticorpi anti-NMDA del ricevitore è stato segnalato per essere presente nel dominio N-terminale extracellulare della subunità NR1 del recettore NMDA. L'obiettivo di questo studio è quello di sviluppare un test di immunofluorescenza basati su cellule semplice che può essere utilizzato come test di screening per rilevare la presenza di autoanticorpi diretti contro NR1 subunità del recettore NMDA nel sangue per facilitare la ricerca di base e clinica di encefalite autoimmune di anti-NMDA receptor.
Introduzione
L'encefalite autoimmune di anti-NMDA del ricevitore è un'entità recentemente riconosciuta di malattia che può accadere in pazienti di tutte le età e colpisce i pazienti prevalentemente femminile1,2. È uno dell'encefalite più frequentemente diagnosticato fra i pazienti con eziologia sconosciuta iniziale di encefalite3. Pazienti affetti da encefalite di anti-NMDA receptor solitamente hanno sintomi prodromici di un mal di testa o febbre, seguita dallo sviluppo veloce del cambiamento di livello di coscienza e una varietà di sintomi neuropsichiatrici acuti, tra cui agitazione, irritabilità ,....
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Protocollo
Lo studio è stato approvato dall'istituzionale Review Board di Chang Gung Memorial Hospital presso Linkuo, Taoyuan, Taiwan (102-2577A3).
1. preparazione del plasmide di espressione NR1-GFP
- Miscelare 10 ng di plasmide NR1-GFP con 100 µ l del ceppo di cellule competenti di Escherichia coli DH5α in una sterile 1,5 mL Centrifuga tubo, dispensare la miscela delicatamente fino e giù 4 - 6 volte e incubare la provetta in ghiaccio per 20 min.
- Incubare la provetta a 42 ° C per 1 min in un bagno di acqua, togliere il tubo dal bagno di acqua, aggiungere 1 mL di terreno di brodo (LB) Lisogenesi nel tubo e incubare la provet....
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Risultati
In media, potremmo ottenere 200-300 µ g plasmide endotossina-libera espressione NR1-GFP e GFP da coltura batterica 250ml seguendo le procedure descritte nella sezione 1 del protocollo. Un importo di 100 ng/pozzetto del plasmide di espressione è stato utilizzato per la transfezione delle cellule HEK293 coltivate nella piastra 48 pozzetti come descritto nella sezione 2 del protocollo. 24-30 h dopo trasfezione, le cellule hanno espresso la NR1-GFP, e proteine ricombinanti GFP potrebbero esse.......
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Discussione
Ci sono parecchi saggi immunologici basati su celle a schermo la presenza di autoanticorpi diretti contro il recettore NMDA segnalati nella letteratura, compreso immunofluorescenza diretta basati su cellule test11, fissata il test di immunofluorescenza basati su cellule9 , e14di analisi basati su citometria a flusso. Il test di immunofluorescenza diretta basati su cellule deve essere eseguito subito dopo la preparazione delle celle ectopically esprim.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dalla Fondazione medica Chang Gung (concessione numero CMRPG3C1771, CMRPG3C1772, CMRPG3E0631, CMRPG3E0632 e CMRPG3E0633).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| GRIN1 (GFP-tagged) - Recettore del glutammato umano, ionotropico, N-metil D-aspartato 1 (GRIN1), variante di trascrizione NR1-1 | Origene (Rockville, MD, USA) | RG219368 | clone NR1-cDNA marcato con sequenze tGFP C-terminali |
| pCMV6-AC-GFP | Origene (Rockville, MD, USA) | PS100010 | mammifero vettore con tag tGFP C-terminale |
| Maxi Kit EndoFree Plasmid | Qiagen (Hilden Germany) | 12362 | |
| Reagente di trasfezione Lipofectamine 2000 | Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) | 11668-019 | |
| Opti-MEM I Siero ridotto Medium | Thermo Fisher | 31985-070 | |
| DMEM, glucosio alto, piruvato | Thermo Fisher | 11995-065 | |
| Siero bovino fetale caratterizzato, origine statunitense | GE Healthcare Life Sciences | SH30071.01 | |
| Anticorpo secondario anti-IgG umano di capra (H+L), Alexa Fluor 594 coniugato | Thermo Fisher | A-11014 | |
| Controllo positivo: recettore anti-glutammato (tipo NMDA) | Euroimmun AG, Lü beck, Germania | CA 112D-0101 | |
| di test Euroimmun |
Riferimenti
- Linnoila, J. J., Rosenfeld, M. R., Dalmau, J. Neuronal surface antibody-mediated autoimmune encephalitis. Semin Neurol. 34 (4), 458-466 (2014).
- Lancaster, E. The diagnosis and treatment of autoimmune Encephalitis. J Clin Neurol. 12 (1), 1-13 (2016).
- Pruss, H., ....
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Ristampe e permessi
