Summary
Abbiamo ectopically espresso NR1 subunità del recettore NMDA etichettato come proteina fluorescente verde in cellule embrionali umane (HEK293) come antigene per rilevare autoanticorpi diretti contro il recettore NMDA nel sangue di pazienti con sospettata con l'encefalite autoimmune. Questo semplice metodo può essere adatto per scopi nelle regolazioni cliniche di screening.
Abstract
La presenza degli autoanticorpi del recettore anti-NMDA può causare vari sintomi neuropsichiatrici in pazienti commoventi, definiti l'encefalite autoimmune di anti-NMDA receptor. L'individuazione degli specifici autoanticorpi contro il recettore NMDA nel sangue o liquido cerebrospinale (CSF) è essenziale per la diagnosi esatta di questa condizione. Il recettore NMDA è un complesso di proteine canale dello ione che contiene quattro subunità, tra cui due subunità di ricevitore NMDA 1 (NR1) obbligatoria e recettore NMDA uno o due subunità 2A (NR2A), 2B di subunità del recettore NMDA (NR2B), unità secondaria del ricevitore NMDA 2C (NR2C), o del recettore NMDA subunità 2D (NR2D). L'epitopo di autoanticorpi anti-NMDA del ricevitore è stato segnalato per essere presente nel dominio N-terminale extracellulare della subunità NR1 del recettore NMDA. L'obiettivo di questo studio è quello di sviluppare un test di immunofluorescenza basati su cellule semplice che può essere utilizzato come test di screening per rilevare la presenza di autoanticorpi diretti contro NR1 subunità del recettore NMDA nel sangue per facilitare la ricerca di base e clinica di encefalite autoimmune di anti-NMDA receptor.
Introduction
L'encefalite autoimmune di anti-NMDA del ricevitore è un'entità recentemente riconosciuta di malattia che può accadere in pazienti di tutte le età e colpisce i pazienti prevalentemente femminile1,2. È uno dell'encefalite più frequentemente diagnosticato fra i pazienti con eziologia sconosciuta iniziale di encefalite3. Pazienti affetti da encefalite di anti-NMDA receptor solitamente hanno sintomi prodromici di un mal di testa o febbre, seguita dallo sviluppo veloce del cambiamento di livello di coscienza e una varietà di sintomi neuropsichiatrici acuti, tra cui agitazione, irritabilità , ansia, insonnia, allucinazioni, deliri, aggressività, comportamenti bizzarri, anomalie del movimento, disregolazione autonomica e sequestro attacchi4,5. Il riconoscimento iniziale di questa condizione e il tempestivo trattamento con immunoterapia sono importanti per un risultato migliore e anche pieno recupero in pazienti colpiti6. Quindi, esso è suggerito che l'encefalite autoimmune di anti-NMDA del ricevitore dovrebbe essere considerata come un'importante diagnosi differenziale dei pazienti che presentano con caratteristiche psicotiche acute o nuova insorgenza7,8.
Oltre alle caratteristiche cliniche, rilevamento degli autoanticorpi contro il recettore NMDA nel sangue o CSF è essenziale per la diagnosi esatta di anti-NMDA receptor encefalite autoimmune9. La maggior parte dei test immunologici per rilevare il autoantibody del recettore anti-NMDA sono disponibile in qualche ricerca laboratori10,11, e c'è solo un test di immunofluorescenza di basati su cellule commercialmente disponibili per lo screening del anti-NMDA receptor autoantibodies12. L'obiettivo di questo studio è quello di sviluppare un test di immunofluorescenza di basati su cellule in-House semplice che può essere convenientemente utilizzato in laboratorio allo schermo anti-NMDA receptor autoanticorpi per facilitare la ricerca clinica del recettore NMDA anti encefalite autoimmune. Il recettore NMDA è una heterotetramer ione canale proteina complessa specificamente espressa nel cervello. È fatta di due unità secondarie NR1 obbligatorie e la combinazione di uno o due subunità NR2A, NR2B, NR2C o NR2D13. Un precedente studio riferito che l'epitopo principale mirato da parte degli anticorpi è presso il dominio N-terminale extracellulare della subunità NR15. Quindi, in questo protocollo, esprimiamo la proteina ricombinante umana di NR1-subunità del recettore NMDA etichettato come proteina fluorescente verde (GFP) nella linea cellulare epiteliale embrionali umane del rene (HEK293) e sviluppare un test di immunofluorescenza basati su cellule per rilevare la classe di IgG del anti-NMDA receptor autoanticorpi nel sangue.
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Protocol
Lo studio è stato approvato dall'istituzionale Review Board di Chang Gung Memorial Hospital presso Linkuo, Taoyuan, Taiwan (102-2577A3).
1. preparazione del plasmide di espressione NR1-GFP
- Miscelare 10 ng di plasmide NR1-GFP con 100 µ l del ceppo di cellule competenti di Escherichia coli DH5α in una sterile 1,5 mL Centrifuga tubo, dispensare la miscela delicatamente fino e giù 4 - 6 volte e incubare la provetta in ghiaccio per 20 min.
- Incubare la provetta a 42 ° C per 1 min in un bagno di acqua, togliere il tubo dal bagno di acqua, aggiungere 1 mL di terreno di brodo (LB) Lisogenesi nel tubo e incubare la provetta a 37 ° C in un incubatore con agitazione per 1 h.
- Diffusione di 50 µ l della miscela su una piastra di agar LB contenente ampicillina (0.1 mg/mL) e incubare la piastra di agar LB a 37 ° C in un incubatore per una notte.
- Scegliere una singola Colonia dalla piastra di agar LB durante la notte, utilizzando una punta sterile, e agitare la punta in un in un tubo di coltura batterica contenente 5 mL di LB medium e ampicillina (0.1 mg/mL). Incubare la provetta a 37 ° C in un incubatore con agitazione durante la notte.
- Aliquotare 3 mL di coltura batterica durante la notte in una beuta da 500 mL contenente 250 mL di terreno sterile di LB e ampicillina (0.1 mg/mL). Incubare la beuta a 37 ° C con agitazione. Controllare regolarmente la densità ottica (OD) della coltura batterica a lunghezza d'onda di 600 nm utilizzando uno spettrometro fino a quando il OD600 raggiunge 0,6-1,0.
Nota: Mescolare ben 800 µ l della coltura batterica durante la notte con 200 glicerolo µ l per preparare il brodo di glicerolo e conservare lo stock di glicerolo sotto-80 ° C per un uso futuro. - Preparare il plasmide di espressione NR1-GFP dalla cultura batterica 250 mL
- Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 6.000 x g per 15 min a 4 ° C.
- Risospendere il pellet di batteri in 10 mL di tampone di risospensione contenente RNasi A; miscelare accuratamente fino a nessun ciuffo è visto.
- Aggiungere 10 mL di tampone di lisi per la sospensione batterica, delicatamente capovolgere la miscela 4 - 6 volte e incubare a temperatura ambiente (TA) per 5 min lisato.
- Aggiungere 10 mL di tampone di precipitazione pre-refrigerati MU, capovolgere delicatamente la miscela di 4 - 6 volte.
- Versare il lisato nella canna di una cartuccia di filtro con l'apposito coperchio attendere 10 minuti a TA.
- Rimuovere il tappo dall'ugello di uscita della cartuccia, inserire uno stantuffo nella cartuccia e premere delicatamente lo stantuffo. Raccogliere il filtrato lisato in una provetta da 50 mL.
- Aggiungere 2,5 mL proprietarie di tampone dal produttore da filtrare lisato, mescolare la miscela capovolgendo la provetta circa 10 volte e incubare la miscela sul ghiaccio per 30 min.
- Applicare la miscela di lisato filtrata a una colonna di filtro che è stata equilibrata con 10 mL di tampone di equilibrazione. Consentire la colonna di scarico per gravità.
- Lavare la colonna con 30 mL di tampone di lavaggio due volte, quindi eluire il DNA dalla colonna con 15 mL di tampone di eluizione.
- Aggiungere 10,5 mL (0,7 volumi) isopropanolo al buffer di DNA eluite, mescolare bene e centrifugare la miscela a 20.000 x g per 30 min a 4 ° C.
- Decantare il supernatante con cura, lavare una volta la pallina di DNA con 5 mL di etanolo al 70% privo di endotossina e centrifugare a 20.000 x g per 10 min.
- Decantare il supernatante, asciugare il pellet per 5-10 min in una cappa chimica e dissolva la pallina in 300-500 µ l di tampone privo di endotossina.
- Determinare la concentrazione di plasmide misurando l'assorbimento della soluzione a UV 260/280 nm utilizzando uno spettrofotometro.
Nota: Preparare il plasmide di espressione GFP usando lo stesso protocollo.
2. la transfezione di cellule HEK293 con plasmidi di espressione NR1-GFP
- Aliquotare 200 µ l di soluzione di gelatina 2% a ciascuna di una piastra di coltura 48 pozzetti ed incubare la piastra a 37 ° C per almeno 30 min.
- Aspirare la soluzione di gelatina dalle celle di 5 x 104 HEK293 ben e seme in 200 µ l di terreno di coltura cellulare contenente 10% siero bovino fetale (FBS) in ciascun pozzetto. Incubare la piastra a 37 ° C in un incubatore fornito con 5% di CO2 durante la notte.
Nota: Le cellule sono state contate utilizzando un emocitometro. - Il giorno successivo, sostituire il terreno di coltura ha trascorso con 200 µ l di terreno di coltura fresco contenente 10% FBS per pozzetto.
- Per ogni singolo bene, preparare soluzione A mescolando 100 ng di plasmide NR1-tGFP con 20 µ l terreno di coltura e la soluzione B mescolando 0,8 µ l di reagente di transfezione con 20 µ l di coltura. Moltiplicare il numero di pozzetti necessari per preparare il volume totale per ogni esperimento.
- Preparare soluzione C con soluzione A e soluzione B ed incubare la miscela a temperatura ambiente per 20-30 min.
- Aliquotare 40 µ l di soluzione C per ogni bene che contiene le cellule HEK293, agitare delicatamente la piastra e incubare la piastra a 37 ° C in un incubatore fornito con 5% di CO2 durante la notte.
- Verificare che l'espressione della proteina ricombinante NR1-GFP in cellule dell'ospite sotto microscopio a fluorescenza con ingrandimento 40x X-200 (eccitazione/emissione: 482/502 nm) e procedere con il test di immunofluorescenza basati su cellule.
Nota: Transfect il plasmide di espressione GFP nelle cellule HEK293 usando lo stesso protocollo.
3. cell-based immunofluorescenza
- Aspirare il medio speso dai pozzetti, quindi lavare ogni pozzetto con 200 µ l di fosfato tampone salino (PBS), tre volte.
- Aggiungere 200 µ l di soluzione di paraformaldeide 4% ad ogni pozzetto; Incubare la piastra a temperatura ambiente per 15 min.
- Aspirare la soluzione di paraformaldeide dai pozzetti e lavare ogni bene con 200 µ l di PBS tre volte.
- Aggiungere 200 µ l di 10% latte scremato in PBST (0.1% Tween-20 in PBS) soluzione per ciascuno ed incubare la piastra a temperatura ambiente per 1 h con agitazione delicata.
- Aspirare il latte scremato 10% in soluzione PBST dal pozzo, quindi lavare i pozzetti con 200 µ l PBST una volta.
- Incubare i pozzetti con plasma diluito (1: 100 in PBST) come l'anticorpo primario con agitazione delicata a temperatura ambiente per 1 h.
Nota: Il Plasma è ottenuto da sangue di pazienti ritenuti sospetto di avere l'encefalite autoimmune. - Aspirare il plasma diluito dai pozzetti e lavare ogni bene con 200 µ l di PBST tre volte.
- Aggiungere 200 µ l di capra anti-IgG umane, coniugati con Alexa Fluor 594 (1:1, 000 diluizione in PBST) ad ogni pozzetto e incubare la piastra di coltura a RT con agitazione delicata per 1 h.
- La capra anti-IgG umane, coniugati con Alexa Fluor 594 soluzione di aspirare e lavare ogni bene con 200 µ l di PBST tre volte.
- Aggiungere 100 µ l di soluzione di glicerolo (glicerolo al 50% in PBS e 1: 100.000 di 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)) in ciascun pozzetto.
- Osservare e le cellule sotto un microscopio a fluorescenza utilizzando un 10 X oculare e 4x, 10x e 20 X obiettivi di immagine.
Nota: Utilizzare il filtro corretto per ogni colorante: per NR1-GFP (eccitazione/emissione = 482/502 nm), per Alexa Fluor 594 (eccitazione/emissione = 561/594 nm), per DAPI (eccitazione/emissione = 358/461 nm). Condurre il controllo negativo usando le cellule HEK che esprimono GFP nello stesso modo.
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Representative Results
In media, potremmo ottenere 200-300 µ g plasmide endotossina-libera espressione NR1-GFP e GFP da coltura batterica 250ml seguendo le procedure descritte nella sezione 1 del protocollo. Un importo di 100 ng/pozzetto del plasmide di espressione è stato utilizzato per la transfezione delle cellule HEK293 coltivate nella piastra 48 pozzetti come descritto nella sezione 2 del protocollo. 24-30 h dopo trasfezione, le cellule hanno espresso la NR1-GFP, e proteine ricombinanti GFP potrebbero essere rilevati sotto microscopio a fluorescenza. Figura 1A Mostra l'immagine delle cellule dell'ospite che esprimono la NR1-GFP, mentre la Figura 1 Mostra le cellule che esprimono GFP. Il segnale verde può essere utilizzato come controller di qualità del dosaggio: circa il 30% delle cellule ha avuto i segnali verdi sotto il microscopio a fluorescenza. Figura 1A e 1D mostrano l'immagine delle cellule dell'ospite che esprimono la NR1-GFP. Il segnale verde può essere utilizzato come controller di qualità del dosaggio: circa il 30% delle cellule ha avuto i segnali verdi sotto il microscopio a fluorescenza. Le cellule che esprimono NR1-GFP sono state utilizzate per lo screening della presenza di autoanticorpi anti-NMDA receptor il campione di plasma umano.
Nell'analisi di immunofluorescenza basati su cellule come descritto nella sezione 3 del protocollo, il controllo positivo del campione (ottenuto da una fonte commerciale, Vedi Tabella materiali) è stato aggiunto al plasma pool a 01:10 diluizione secondo la istruzioni del produttore. Il plasma pool è stato preparato da 5 maschi e 5 femmine adulte. Figura 1B è l'immagine di Alexa Fluor-594 del campione di controllo positivo dopo incubazione con l'espressione di cellule NR1-GFP, mentre Figura 1E è l'immagine di Alexa Fluor-594 del campione di controllo positivo dopo incubazione con l'espressione di cellule GFP. Figura 1 è l'immagine unita di Figura 1A e 1B figura: ci sono significative sovrapposizioni di segnali verdi e rossi segnali nella stessa cella, che indica la co-localizzazione di NR1-GFP e gli anticorpi contro la subunità NR1 di NMDA recettore (frecce). Un campione di plasma che mostra maggiore del 30% si sovrappone di verde e rossi segnali verranno interpretati come positivo in questo caso. Figura 1F è l'immagine unita da Figura 1 e Figura 1E che funge da controllo negativo per Figura 1. Il colore rosso debole è fluorescenza di fondo dell'immagine Alexa Fluor-594. C'è poca sovrapposizione di segnali verdi e rossi, che indica nessun grippaggio degli autoanticorpi anti-NMDA receptor contro la proteina ricombinante.
Durante l'istituzione di procedure sperimentali, abbiamo osservato un rapporto segnale-rumore basso dell'immagine Alexa Fluor-594 quando i campioni di plasma sono stati testati. Abbiamo tentato di ottimizzare il rapporto segnale-rumore effettuando una diluizione seriale del plasma modulo 01:10, 01:50, 1: 100 e 1: 200 e il test di diverse concentrazioni di Alex Fluor-594 etichettato anticorpo secondario da 1: 500 a 1:2, 000. Abbiamo trovato che la diluizione 1: 100 della diluizione del plasma e 1:1,000 o 1:2,000 di Alexa Fluor-594 erano le condizioni ottimali per l'interpretazione dei dati.
Figura 1: immagini rappresentative di basati su cellule immunofluorescenza per rilevare degli autoanticorpi anti-NMDA receptor. (A) immagine di cellule HEK293 che esprimono NR1-GFP. (B) The Alexa Fluor-594 immagine prelevati dallo stesso campo di A dopo incubazione con il campione di controllo positivo. Segnale rosso indica l'associazione degli autoanticorpi anti-NMDA receptor a NR1 espressi nelle cellule HEK293. (C) l'immagine unita di A e B. Colore giallo indica la co-localizzazione della NR1 (segnale verde) e autoanticorpi anti-NMDA receptor (segnale rosso). Le frecce indicano esempi di alcune cellule prominenti risultati co-localizzazione di NR1-GFP e anti-NMDA autoanticorpi del recettore. (D) immagine della HEK293 cellule esprimenti NR1-GFP. (E) The Alexa Fluor-594 immagine prelevati dallo stesso campo di D dopo incubazione con il campione di controllo positivo. Debole segnale rosso indica il rumore di fondo dell'immagine di Alexa Fluor-594. (F) l'immagine unita di D ed E. Questa immagine serve come controllo negativo, c'è piccolo giallo segnale osservato. L'immagine di controllo negativo Mostra il grippaggio specifico anti-NMDA anticorpi recettore NR1-GFP nel dosaggio. Tutte le immagini sono state scattate lente di occhio meno di 10 X e 20 X lente obiettivo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Ci sono parecchi saggi immunologici basati su celle a schermo la presenza di autoanticorpi diretti contro il recettore NMDA segnalati nella letteratura, compreso immunofluorescenza diretta basati su cellule test11, fissata il test di immunofluorescenza basati su cellule9 , e14di analisi basati su citometria a flusso. Il test di immunofluorescenza diretta basati su cellule deve essere eseguito subito dopo la preparazione delle celle ectopically esprimenti la proteina NR1, mentre l'analisi di citometria-basata di flusso richiede personale qualificato e attrezzature speciali. Un test di immunofluorescenza basati su celle fisse è un dosaggio più conveniente che può essere condotta per regolazioni cliniche. Quindi, molti studi usato il test di immunofluorescenza basati su celle fisse indiretta commerciale per autoanticorpi di schermo anti-NMDA receptor in siero ed in CSF esemplari12,15. Il kit usato (veda la tabella dei materiali) contiene cellule HEK293 fisse che ectopically esprimono la subunità NR1 ricombinante del recettore NMDA. L'analisi è stata valutata per avere ottime prestazioni nella rilevazione l'anticorpo di IgG anti-NMDA del ricevitore nel siero e nel CSF esemplari12. Nel nostro protocollo, abbiamo usato lo stesso approccio di quello consigliato dal produttore del kit, tranne per il fatto che usiamo plasmide di espressione NR1-GFP. La proteina NR1-GFP può essere utilizzata per monitorare l'efficienza di trasfezione e distribuzione della proteina NR1 in ogni esperimento. Quindi, può essere utilizzato come una garanzia di qualità del dosaggio.
L'efficienza di trasfezione del plasmide di espressione NR1-GFP nelle cellule HEK293 è circa il 30% nel protocollo presentato qui, che è sufficiente per il test di immunofluorescenza. Tuttavia, abbiamo trovato che l'intensità della fluorescenza verde non è distribuito uniformemente fra le cellule transfettate, suggerendo differenze in termini di efficienza di trasfezione o espressione capacità delle singole celle. I diversi livelli di espressione di ricombinante NR1-GFP in celle diverse causano intensità eterogenea quando l'immagine verde è stato fuso con l'immagine rossa di Alexa Fluor 594. La capra anti-IgG umane, coniugati con Alexa Fluor 594 è stata utilizzata come l'anticorpo secondario per rilevare la presenza di umani autoanticorpi di classe IgG. Abbiamo trovato che la luminosità di Alexa Fluor 594 è relativamente più debole di quello della proteina fluorescente verde. Abbiamo cercato di ottimizzare l'intensità del segnale aumentando la concentrazione dell'anti-IgG umane, coniugati con Alex Fluor 594, tuttavia, lo sfondo aumentato pure. Quindi, la concentrazione ottimale per l'anti-IgG umane, coniugati con Alex Fluor 594 è 1:1,000 in questo laboratorio. Inoltre, alcuni campioni di plasma avevano un fondo significativamente elevato segnale nell'immagine Alexa Fluor 594. Diverse diluizioni del plasma sono stati testati, e si è constatato che una minima diluizione di 1: 100 è necessaria ottenere uno sfondo pulito per la maggior parte dei campioni. Quindi, si consiglia la diluizione 1: 100 di plasma come il passaggio standard in questo protocollo. Confrontato con le altre analisi cell-based che possono rilevare il campione di siero in diluizione 01:10 e 01:20 di sangue campione11,16, questo protocollo corrente non dispone di sufficiente sensibilità per rilevare gli autoanticorpi di titolo basso anti-NMDA receptor, che è una limitazione del protocollo.
Il protocollo attuale è un test di immunofluorescenza basati su celle fisse. La piastra di coltura possa essere memorizzata in frigorifero a 4 ° C dopo la fissazione per un utilizzo successivo per fino a 1 mese, in confronto il dosaggio live basati su cellule che non può essere conservato per lungo tempo. Tuttavia, la proteina NR1 sarà essere denaturato e perdere la sua naturale conformazione durante la procedura di fissazione, che può influenzare la conformazione dell'epitopo che lega di autoanticorpi anti-NMDA receptor. Quindi, alcuni studi approvati dal vivo basati su cellule immunofluorescene11,17. Il nostro protocollo può essere modificato in alternativa per diventare un test di immunofluorescenza diretta basati su cellule per preservare la naturale conformazione della proteina NR1, se abbiamo Incubare il campione di plasma con cellule vive in primo luogo e fissare le cellule più tardi. Così, non c'è flessibilità nel protocollo per soddisfare l'esigenza dell'esperimento.
Il recettore NMDA è una proteina complessa heterotetramer composto da NR1, NR2A, NR2B, NR2C e NR2D. Il protocollo attuale è stato progettato per rilevare la classe IgG degli autoanticorpi contro NR1 subunità del recettore NMDA. Il protocollo può anche essere modificato per rilevare diversi isotipi di autoanticorpi, come gli anticorpi secondari di IgG anti-umani vengono sostituiti dalla classe specifica di anticorpi secondari. Inoltre, l'attuale protocollo può essere modificato per rilevare la presenza di autoanticorpi diretti contro NR2A, NR2B, NR2C e NR2D, se il plasmide di espressione NR1-GFP è sostituito con il plasmide di espressione corrispondente, rispettivamente.
In questo protocollo, abbiamo usato un campione di plasma invece di siero, perché raccogliamo ordinariamente il campione di sangue con anticoagulante per vari motivi di studio, ma il protocollo può essere applicato a campioni di siero o CSF. Il titolo degli autoanticorpi nel plasma può essere quantificato da diluizioni seriali del campione. In laboratorio, abbiamo provato anche la linea di fibroblasto-come delle cellule di rene di scimmia verde africana (COS1) come cellule dell'ospite, usando lo stesso protocollo. I risultati sono gli stessi che usando le cellule HEK293, tranne per il fatto che le cellule COS1 hanno un'efficienza di trasfezione leggermente inferiore rispetto alle cellule HEK293.
Per accertare la presenza degli autoanticorpi anti-NMDA receptor, è suggerito che ulteriori esperimenti come immunohistochemistry dosaggio utilizzando tessuti di cervello del roditore e immunocitochimica utilizzando primario roditore coltivate neuroni essere eseguita5 ,9. Quindi, l'attuale protocollo può essere considerato solo come un test di screening. Anche se la sua validità sperimentale è stata verificata utilizzando il campione di controllo positivo in questo studio, la sensibilità e la specificità di questo test nelle regolazioni cliniche devono essere stabiliti in futuro studio.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dalla Fondazione medica Chang Gung (concessione numero CMRPG3C1771, CMRPG3C1772, CMRPG3E0631, CMRPG3E0632 e CMRPG3E0633).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GRIN1 (GFP-tagged) - Human glutamate receptor, ionotropic, N-methyl D-aspartate 1 (GRIN1), transcript variant NR1-1 | Origene (Rockville, MD, USA) | RG219368 | NR1-cDNA clone tagged with C-terminal tGFP sequences |
| pCMV6-AC-GFP | Origene (Rockville, MD, USA) | PS100010 | mammalian vector with C-terminal tGFP tag |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen (Hilden Germany) | 12362 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) | 11668-019 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985-070 | |
| DMEM, High Glucose, Pyruvate | Thermo Fisher | 11995-065 | |
| Characterized Fetal Bovine Serum, US Origin | GE Healthcare Life Sciences | SH30071.01 | |
| Goat anti-Human IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | Thermo Fisher | A-11014 | |
| Positive control: anti-glutamate receptor (type NMDA) | Euroimmun AG, Lübeck, Germany | CA 112d-0101 | |
| Euroimmun Assay Kit |
References
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