Summary
우리는 ectopically NMDA 수용 체에 대 한 자가 면역 뇌염으로 의심 되는 환자의 혈액에서 검출 하는 항으로 인간 배아 세포 (HEK293)에서 녹색 형광 단백질 태그로 NMDA 수용 체의 NR1 소 단위를 표현. 이 간단한 방법 임상 설정에서 심사 적합 있을 수 있습니다.
Abstract
안티-NMDA 수용 체 autoantibody의 존재 안티 NMDA 수용 체 면역 뇌염 되 나 영향을 받는 환자에서 다양 한 정신병 증상을 일으킬 수 있습니다. 혈액 또는 뇌 척추 액체 (CSF)에 NMDA 수용 체에 대 한 특정 autoantibody의 검출은이 조건의 정확한 진단을 위해 필수적 이다. NMDA 수용 체는 이온 채널 단백질 복잡 한 두 필수 NMDA 수용 체 소 단위 1 (NR1)와 하나 또는 두 개의 NMDA 수용 체를 포함 하 여 4 개의 소 단위를 포함 하는 소 단위 2A (NR2A), NMDA 수용 체 소 단위 2B (NR2B), NMDA 수용 체 소 단위 2 C (NR2C), 또는 NMDA 수용 체 소 단위 2D (NR2D). 안티-NMDA 수용 체 autoantibody epitope NMDA 수용 체의 NR1 소 단위의 extracellular N 맨끝 도메인에 있어야 보고 되었다. 이 연구의 목표는 NMDA 수용 체의 NR1 소 단위에 대 한 신경의 임상 및 기초 연구를 촉진 하기 위하여 혈액에서 검출 하는 검사로 사용할 수 있는 간단한 세포 기반 면역 형광 분석 결과 개발 하는 안티-NMDA 수용 체 면역 뇌염
Introduction
안티 NMDA 수용 체 면역 뇌염 새로 인식 된 질병 엔터티는 모든 연령대의 환자에서 발생할 수 있으며 주로 여성 환자1,2에 영향을 미치는입니다. 그것은 가장 자주 진단된 뇌염 뇌염3의 초기 알 수 없는 병을 가진 환자 들 중 하나입니다. 일반적으로 안티-NMDA 수용 체 뇌염으로 영향을 받는 환자는 두통이 나 발열, 의식 수준의 변화 및 다양 한 동요, 과민성을 포함 한 급성 정신병 증상의 빠른 발전에 의해 다음의 prodromal 증상이 불안, 불면증, 환각, 망상, 침략, 기괴 한 행동, 운동 이상, 자율 dysregulation, 그리고 발작 공격4,5. 이 조건과 immunotherapy 적시 치료의 초기 인식 더 나은 결과 영향을 받는 환자6전체 복구에 대 한 중요 하다. 따라서, 안티-NMDA 수용 체 면역 뇌염 환자 급성 또는 새로운 발병 정신병 특징7,8제시의 중요 한 감 별 진단으로 고려 되어야 한다 건의 된다.
임상 기능 외 autoantibody CSF 또는 혈액에 NMDA 수용 체에 대 한의 안티 NMDA 수용 체 면역 뇌염9의 정확한 진단을 위해 필수적 이다. 안티-NMDA 수용 체 autoantibody 감지 하 면역 테스트의 대부분은 몇 가지 연구 실험실10,의11, 사용할 수 거기 이며 심사에 대 한 단 하나의 상용 세포 기반 면역 형광 분석 결과 안티-NMDA 수용 체 신경12. 이 연구의 목표는 사용할 수 있는 편리 하 게 실험실에서 안티 NMDA 수용 체의 임상 연구를 촉진 하기 위하여 안티 NMDA 수용 체 신경의 존재를 화면에 간단한 사내 세포 기반 면역 형광 분석 결과 개발 하는 뇌염은 면역 NMDA 수용 체는 heterotetramer 이온 채널 단백질 복잡 한 두뇌에서 구체적으로 표현. 그것은 두 개의 필수 NR1 소 단위, 및 NR2A, NR2B, NR2C, 또는 NR2D13의 하나 또는 두 개의 소 단위 조합의 만들어진다. 이전 연구는 항 체에 의해 대상 주요 epitope NR1 소 단위5의 extracellular N 맨끝 도메인에는 보고. 따라서,이 프로토콜에 우리 인간 미 발달 신장 상피 세포 라인 (HEK293), 녹색 형광 단백질 (GFP) 태그로 NMDA 수용 체의 인간 재조합 형 NR1 소 단위 단백질을 표현 하 고 개발 감지 하는 세포 기반 면역 형광 분석 결과 안티-NMDA 수용 체 신경에 혈액의 IgG 클래스.
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Protocol
연구 기관 검토 위원회의 장 공 기념 병원 Linkuo, 타오 위 엔, 대만 (102-2577A3)에 의해 승인 되었다.
1. NR1 GFP 식 플라스 미드의 준비
- 살 균 1.5 mL에 대장균 유능한 세포 변형 DH5α의 100 µ L로 NR1 GFP 플라스 미드의 믹스 10 ng까지 부드럽게 튜브를 피펫으로 혼합물을 원심 및 아래쪽 4-6 시간, 20 분 동안 얼음에 튜브를 품 어 고.
- 물 욕조에 1 분 동안 42 ° C에 튜브를 품 어 물 탕에서 튜브를 제거, 튜브에 1 mL lysogeny 국물 (파운드) 매체를 추가 하 고 1 시간 동안 흔들어와 인큐베이터에서 37 ° C에서 튜브를 품 어.
- 50 µ L 암 피 실린 (0.1 mg/mL)를 포함 하는 파운드 한 천 배지 위에 혼합물의 확산과 하룻밤 인큐베이터에서 37 ° C에서 파운드 천 배지를 품 어.
- 멸 균 팁을 사용 하 여 하룻밤 파운드 한 천 배지에서 단일 식민지를 선택 하 고에서 팁을 소용돌이 파운드 매체와 암 피 실린 (0.1 mg/mL) 5 mL를 포함 하는 세균성 문화 관에서. 37 ° c 하룻밤 떨고와 인큐베이터에서 튜브를 품 어.
- Aliquot 3 mL 250 mL 살 균 파운드 매체와 암 피 실린 (0.1 mg/mL)에 포함 된 500 mL 플라스 크에 하룻밤 세균성 문화. 떨고와 37 ° C에서 플라스 크를 품 어. 600의 파장에서 세균성 문화 광학 밀도 (OD)를 정기적으로 확인 nm는 OD600 0.6-1.0에 도달할 때까지 한 분석기를 사용 하 여.
참고: 글리세롤 재고를 준비 하 여 글리세롤 재고 미래 사용을 위한-80 ° C이 하 저장 200 µ L 글리세롤과 잘 800 µ L의 하룻밤 세균성 문화를 혼합. - NR1 GFP 식 플라스 미드 250 mL 세균성 문화에서 준비
- 4 ° c.에 15 분 동안 6000 x g에서 원심 분리 하 여 세포를 수집
- 10 mL 물의 resuspension 버퍼 RNase A;를 포함 하는 박테리아 펠 릿 resuspend 와 동 없는 덩어리를 볼 때까지 철저 하 게
- 세균 현 탁 액을 10ml 세포의 용 해 버퍼를 추가, 부드럽게 반전 혼합물, 4-6 시간 하 고 lysate 5 분 실 온 (RT)에서 품 어.
- 10 mL 미리 냉장된 강수량 버퍼는 lysate를 추가, 부드럽게 반전 혼합 4-6 시간.
- Lysate의 모자와 필터 카트리지를 통에 부 어 실시간에서 10 분 동안 대기
- 카트리지 출구 노즐에서 뚜껑을 제거, 카트리지에 플런저를 삽입 하 고 플런저를 조심 스럽게 누릅니다. 수집 하는 필터링 된 50 mL 튜브에 lysate.
- 2.5 mL 독점 버퍼 제조 업체에서 하는 필터링 된 lysate를 추가 하 고 약 10 배, 튜브를 거꾸로 하 여 혼합물을 섞어 30 분 동안 얼음에 혼합물을 품 어.
- 필터 열을 미리 equilibrated 10 mL 평형 버퍼 필터링된 lysate 혼합물을 적용 합니다. 중력에 의해 배수를 열을 수 있습니다.
- 30 mL 워시 버퍼 열 두 번 세척 후 15 mL 차입 버퍼를 사용 하 여 열에서 DNA을 elute.
- 10.5 mL (0.7 볼륨) 소 프로 파 놀 eluted DNA 버퍼에 추가, 잘, 그리고 20000 x g 4 ° c.에 30 분 동안에 혼합물을 원심
- 신중 하 게는 상쾌한 가만히 따르다, 한 번, 5 mL도 무료 70% 에탄올과 DNA 펠 릿을 세척 하 고 10 분 20000 x g에서 원심.
- 상쾌한 가만히 따르다, 화학 후드, 5-10 분 동안 펠 릿 건조 하 고도 무료 버퍼의 300-500 µ L에 펠 릿을 녹.
- 분 광 광도 계를 사용 하 여 UV 260/280 nm에 해결책의 흡수를 측정 하 여 플라스 미드 농도 결정 합니다.
참고: 식 플라스 미드 GFP 동일한 프로토콜을 사용 하 여 준비 합니다.
2. NR1 GFP 식 플라스 미드와 HEK293 세포의 transfection
- 각각 2% 젤라틴 솔루션의 aliquot 200 µ L 48-잘 문화 판의 고 적어도 30 분 동안 37 ° C에서 접시를 품 어.
- 세포 배양 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)에 각 잘 포함 하의 200 µ L에 잘, 그리고 씨앗 5 x 104 HEK293 세포에서 젤라틴 솔루션 발음 37 ° c 하룻밤 5% CO2 와 함께 제공 된 습도 인큐베이터에서 접시를 품 어.
참고: 셀을 hemocytometer를 사용 하 여 계산 했다. - 다음 날, 바꿉니다 소비 문화 중간 10%를 포함 하는 신선한 문화 매체의 200 µ L FBS 잘 당.
- 각 단일, 100를 혼합 하 여 솔루션 A를 준비 20 µ L 문화 매체, 및 0.8 µ L transfection 시 약 20 µ L 문화 매체와 혼합 하 여 솔루션 B NR1 tGFP 플라스 미드의 ng. 각 실험에 대 한 전체 볼륨을 준비 하는 데 필요한 우물의 수를 곱하면.
- 솔루션 및 솔루션 B, 혼합 하 여 솔루션 C를 준비 하 고 20-30 분에 대 한 실시간에 혼합물을 품 어.
- C 솔루션 필요 각 잘 포함 하는 HEK293 세포의 aliquot 40 µ L 플레이트를 부드럽게, 소용돌이 그리고 하룻밤 5% CO2 와 함께 제공 된 습도 인큐베이터에서 37 ° C에서 접시를 품 어.
- NR1 GFP 40 X-200 X 확대와 함께 형광 현미경 호스트 세포에서 재조합 형 단백질의 표정을 확인 (여기/방출: 482/502 nm), 세포 기반 면역 형광 분석을 진행 하 고.
참고: 동일한 프로토콜을 사용 하 여 HEK293 세포로 식 플라스 미드 GFP Transfect.
3. 세포 기반 면역 형광 분석 결과
- 우물에서 보낸된 중간 발음, 다음 세척의 인산 염 200 µ L 각 잘 버퍼링 염 분 (PBS) 3 번.
- 각 잘;에 4 %paraformaldehyde 솔루션의 200 µ L를 추가 15 분에 대 한 실시간에 접시를 품 어.
- 우물에서 paraformaldehyde 솔루션을 발음 하 고 각각 씻어 PBS의 200 µ L 세 번 잘.
- PBST에 10% 탈지 우유의 200 µ L를 추가 (0.1 %PBS 트윈-20) 솔루션을 각각 잘 고 부드러운 진동으로 1 시간에 대 한 실시간에 접시를 품 어.
- 잘에서 PBST 솔루션 10% 탈지 우유를 발음 다음 200 µ L PBST와 웰 스를 한 번 세척.
- 1 시간에 대 한 실시간에 부드러운 동요와 1 차 항 체로 희석된 플라즈마 (PBST에 1: 100)와 웰 스를 품 어.
참고: 플라즈마 면역 뇌염이 있기 위하여 의심 되는 환자의 혈액에서 얻은 것입니다. - 우물에서 희석된 플라즈마를 발음 하 고 각각을 씻어 PBST의 200 µ L 세 번 잘.
- 염소 안티 인간 IgG 각 음에 알 렉 사 Fluor 594 (1:1, PBST에서 000 희석)와 활용의 200 µ L을 추가 하 고 1 시간 동안 부드러운 흔들어와 RT에서 문화 접시를 품 어.
- IgG 알 렉 사 Fluor 594 솔루션 활용 된 염소 항 인간의 발음 및 각 세척 PBST의 200 µ L 세 번 잘.
- 각 잘을 100 µ L 글리세롤 솔루션 (PBS와 1:100,000의 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)에 50% 글리세롤)를 추가 합니다.
- 관찰 하 고 형광 현미경 접 안 렌즈, 그리고 4 배, 10 배, 20 X 목표 X 10을 사용 하 여 셀을 이미지.
참고: 각 염료에 대 한 올바른 필터를 사용 하 여: NR1 GFP에 대 한 (여기/방출 = 482/502 nm), 알 렉 사 Fluor 594 대 한 (여기/방출 = 561/594 nm), DAPI에 대 한 (여기/방출 358/461 = nm). 같은 방식으로 표현 하는 GFP HEK 세포를 사용 하 여 부정적인 제어를 수행 합니다.
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Representative Results
평균적으로, 우리는 프로토콜의 섹션 1에서에서 설명한 절차에 따라 250 mL 세균성 문화에서 200-300 µ g 내 무료 식 플라스 미드 NR1 GFP와 GFP를 얻을 수 있습니다. 프로토콜의 섹션 2에에서 설명 된 대로 48-잘 접시에 배양 HEK293 세포의 transfection는 양의 식 플라스 미드의 100 ng/잘 사용 되었다. transfection 후 24-30 h, 셀 표현 NR1 GFP 그리고 GFP 재조합 단백질 형광 현미경에서 검출 될 수 있습니다. 그림 1A 는 그림 1D GFP를 표현 하는 셀을 표시 하는 동안 NR1 GFP를 표현 하는 호스트 셀의 이미지를 보여 줍니다. 녹색 신호 분석 결과의 품질 컨트롤러로 사용할 수 있습니다: 셀의 약 30%는 형광 현미경에서 녹색 신호를 했다. 그림 1A 와 1d NR1 GFP를 표현 하는 호스트 셀의 이미지를 표시 합니다. 녹색 신호 분석 결과의 품질 컨트롤러로 사용할 수 있습니다: 셀의 약 30%는 형광 현미경에서 녹색 신호를 했다. NR1 GFP를 표현 하는 세포는 인간의 플라즈마 샘플에서 안티 NMDA 수용 체 신경의 존재를 검사 위해 사용 되었다.
세포 기반 면역 형광 분석 결과에 프로토콜의 섹션 3에에서 설명 된 대로, 긍정적인 제어 샘플 (상용 소스에서 가져온 테이블의 자료참조) 1시 10분에서 풀링된 플라즈마에 추가 되었다에 따라 희석은 제조 업체의 지침입니다. 5 성인 남성과 5 성인 여성에서 풀링된 플라즈마 준비 되었다. 그림 1B 는 긍정적인 컨트롤 샘플의 알 렉 사 Fluor-594 이미지 셀 식 NR1-GFP, 부 화 후 셀 식 GFP 가진 외피 후 긍정적인 컨트롤 샘플의 알 렉 사 Fluor-594 이미지는 그림 1E . 그림 1C 는 그림 1A 및 그림 1B의 병합 된 이미지: 녹색 신호 및 NR1 GFP의 공동 지역화와 NMDA NR1 소 단위에 대 한 항 체를 나타내는 동일한 셀에 빨간 신호의 상당한 오버랩이 있다 수용 체 (화살표)입니다. 플라즈마 샘플 30% 보다 큰 보여 주는 녹색의 중복 그리고 빨간 신호가 경우 긍정적으로 해석 됩니다. 그림 1 층 그림 1D 그림 1 및 그림 1 c에 대 한 부정적인 제어 역할에서 병합 된 이미지입니다. 약한 붉은 색의 알 렉 사 Fluor-594 이미지 배경 형광입니다. 아무 안티 NMDA 수용 체 autoantibody 재조합 단백질에 대 한 바인딩을 나타내는 녹색 및 빨간색 신호의 작은 오버랩이 있다.
실험 절차의 설립 동안 플라즈마 샘플 테스트 했을 때 알 렉 사 Fluor-594 이미지의 낮은 신호 대 잡음 비율을 관찰 합니다. 우리는 플라즈마 형태 1:10, 1:50, 1: 100의 직렬 희석을 실시 하 여 신호 대 잡음 비율을 최적화 하려고 그리고 1: 200, 그리고 알렉스 형 석-594의 다른 농도 테스트 분류 1:2, 000에 1: 500에서 이차 항 체. 우리는 데이터의 해석에 대 한 최적의 조건 알 렉 사 Fluor-594의 플라즈마와 1:1,000 또는 1:2,000 희석의 그 1: 100 희석을 발견.
그림 1: 안티 NMDA 수용 체 autoantibody 감지 세포 기반 면역 형광 분석 결과의 대표 이미지. 익스프레스 NR1 GFP HEK293 세포의 (A) 이미지. (B)는 알 렉 사 Fluor-594 이미지 긍정적인 컨트롤 샘플 가진 외피 후 A 의 동일한 필드에서 가져온. 빨간 신호 NR1 HEK293 세포에 표현에 안티 NMDA 수용 체 신경의 바인딩을 나타냅니다. (C) A 와 B의 병합 된 이미지. 노란색 표시는 NR1의 공동 지역화 (녹색 신호)와 안티 NMDA 수용 체 신경 (빨간 신호). 화살표는 일부 저명한 셀 보여주는 공동 지역화 NR1 GFP와 안티 NMDA 수용 체 신경의 예를 나타냅니다. (D) 이미지는 HEK293 세포 표현 NR1 GFP. (E)는 알 렉 사 Fluor-594 이미지 긍정적인 컨트롤 샘플 가진 외피 후 D 의 동일한 필드에서 가져온. 약한 붉은 신호는 알 렉 사 Fluor-594 이미지의 배경 잡음을 나타냅니다. (F) D 와 E의 병합 된 이미지. 약간 노란색 신호가 관찰이 이미지 부정적인 제어로 제공 합니다. 부정적인 제어 이미지 NR1 GFP 항 체 수용 체 분석 결과에 안티-NMDA 특정 바인딩을 보여줍니다. 모든 이미지는 10 X 눈 렌즈와 20 X 렌즈 목표 촬영 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
라이브 세포 기반 면역 형광 분석 결과11, 고정 세포 기반 면역 형광 분석 결과9 포함 하 여 문학에서 보고 된 NMDA 수용 체에 대 한 신경의 존재를 화면에 여러 세포 기반 면역 분석을 있다 , cytometry 기반 흐름 시험14및. 라이브 세포 기반 면역 형광 분석 결과 흐름 cytometry 기반 분석 결과 훈련 된 인력과 특수 장비를 요구 하면서 ectopically NR1 단백질을 표현 하는 세포의 준비 후 수행 되어야 한다. 고정된 셀 기반 면역 형광 분석 결과 더 편리한 분석 결과 임상 설정에 대 한 수행할 수 있습니다. 따라서, 많은 연구 상업 간접 고정된 세포 기반 면역 형광 분석 결과 화면 안티 NMDA 수용 체 autoantibody 혈 청 및 CSF 표본12,15를 사용. 키트 사용된 (참고 자료의 테이블) ectopically NMDA 수용 체의 재조합 NR1 소 단위를 표현 하는 고정된 HEK293 세포를 포함 되어 있습니다. 분석 결과 안티 NMDA 수용 체 IgG 항 체를 검출 하는 혈 청 및 CSF 표본12에서 우수한 성능을 평가 하고있다. 우리의 프로토콜에서 우리 같은 접근으로 사용 키트 제조 업체에서 권장 하는 우리가 NR1 GFP 식 플라스 미드를 사용. NR1 GFP 단백질 transfection 효율 및 각 실험에서 NR1 단백질의 배포를 모니터링 하는 데 사용할 수 있습니다. 따라서, 그것은 분석 결과의 품질 보증으로 사용할 수 있습니다.
HEK293 세포로 NR1 GFP 식 플라스 미드의 transfection 효율은 면역 형광 분석 결과 대 한 충분 한 여기, 프로토콜에서 대략 30% 이다. 그러나, 우리가 발견 녹색 형광의 강도 transfected 세포 간에 균등 하 게 분산 하지는 개별 세포의 transfection 또는 표현 능력의 효율에서 차이 제안. 재조합 NR1-GFP 다른 셀에 다양 한 식 수준의 이기종 강도 발생할 녹색 이미지는 알 렉 사 Fluor 594의 붉은 이미지와 합병 했다. IgG 알 렉 사 Fluor 594로 활용 된 염소 항 인간의 인간 autoantibody IgG 클래스의 존재를 감지 2 차 항 체로 사용 되었다. 우리는 알 렉 사 Fluor 594의 밝기는 녹색 형광 단백질의 그것 보다 상대적으로 약한 것을 발견. 그러나 IgG 알렉스 Fluor 594와 활용 또한 증가 하는 배경, 반 인간의 농도 증가 하 여 신호 강도 최적화 하 여 보았습니다. 그러므로, IgG 활용 알렉스 Fluor 594와 반대로 인간을 위한 최적 농도이 실험실에서 1:1,000 이다. 또한, 일부 플라즈마 샘플 했다 상당히 높은 배경 알 렉 사 Fluor 594 이미지에 신호. 플라즈마의 다른 희석 테스트 되었습니다, 그리고 그것은 1: 100의 최소한의 희석은 샘플의 대부분을 위해 깨끗 한 백그라운드를 얻기 위해 필요한 발견. 따라서,이 프로토콜의 표준 단계 플라즈마의 1: 100 희석을 좋습니다. 혈액 샘플11,161시 10분과 1시 20분 희석에서 혈 청 샘플을 검색할 수 있는 다른 세포 기반 분석에 비해,이 현재 프로토콜은 충분 한 감도 낮은 titer 안티 NMDA 수용 체 신경 탐지를 이 프로토콜의 한계입니다.
현재 프로토콜은 고정된 세포 기반 면역 형광 분석 결과입니다. 문화 접시는 라이브 세포 기반 분석 결과 오랜 시간 동안 저장할 수 없는 비해 최대 1 달 동안 나중에 사용에 대 한 고정 후 4 ° C 냉장고에 저장할 수 있습니다. 그러나, NR1 단백질 변성 될 것 이다 하 고 안티 NMDA 수용 체 신경에 피토 프의 구조에 영향을 미칠 수 있습니다 정착 과정의 자연 형태를 잃게됩니다. 따라서, 일부 연구는 라이브 셀 기반 immunofluorescene11,17를 채택 했다. 우리의 프로토콜 만약 우리가 먼저, 라이브 세포와 혈장 샘플을 품 어 나중 셀 수정 NR1 단백질의 자연 형태를 보존 하기 위해 라이브 세포 기반 면역 형광 분석 결과 될 또는 수정할 수 있습니다. 따라서, 실험의 필요에 맞게 프로토콜에 유연성이 있다.
NMDA 수용 체의 NR1, NR2A, NR2B, NR2C, 및 NR2D 구성 된 heterotetramer 복잡 한 단백질 이다. 현재 프로토콜 autoantibody NMDA 수용 체의 NR1 소 단위에 대하여의 IgG 클래스를 검색 하도록 설계 되었습니다. 반대로 인간의 보조 IgG 항 체 이차 항 체의 다른 특정 클래스에 의해 대체 됩니다로 프로토콜 또한 감지 자가의 다른 isotypes를 수정할 수 있습니다. 또한, NR1 GFP 식 플라스 미드 각각 해당 식 플라스 미드로 교체 하는 경우 NR2A, NR2B, NR2C, 및 NR2D에 대 한 신경의 존재를 감지 하는 현재 프로토콜을 수정할 수 있습니다.
이 프로토콜에서 우리 플라즈마 견본 대신 사용 혈 청, 우리가 일상적으로 다양 한 연구 목적을 위해 항 응고 제와 혈액 샘플을 수집 하지만 프로토콜 혈 청 또는 CSF 표본에 적용할 수 있기 때문에. 플라스마에 있는 신경의 titer 샘플의 직렬 희석 하 여 측정할 수 있습니다. 실험실에서 우리는 또한 동일한 프로토콜을 사용 하 여 호스트 셀으로 아프리카 녹색 원숭이 신장 섬유 모양의 세포 선 (COS1) 테스트. 결과 동일 HEK293 세포를 사용 하 여 제외 하 고 COS1 세포는 HEK293 세포 보다 약간 낮은 transfection 효율.
안티-NMDA 수용 체 신경의 존재를 확인, 그것은 제안 immunohistochemistry 등 추가 실험 쥐 뇌 조직을 사용 하 여 분석 결과 및 immunocytochemistry 기본 교양된 쥐 신경 세포 수를 사용 하 여 수행5 ,9. 따라서, 현재 프로토콜은 심사 분석 결과으로 간주 될 수 있습니다. 비록 그것의 실험적인 타당성 연구, 감도 긍정적인 컨트롤 샘플을 사용 하 여 확인 및 특이성 임상 설정에서이 분석 결과의 미래에 설립 될 필요가 연구.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 장 공 의료 재단 (보조금 번호 CMRPG3C1771, CMRPG3C1772, CMRPG3E0631, CMRPG3E0632, 및 CMRPG3E0633)에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GRIN1 (GFP-tagged) - Human glutamate receptor, ionotropic, N-methyl D-aspartate 1 (GRIN1), transcript variant NR1-1 | Origene (Rockville, MD, USA) | RG219368 | NR1-cDNA clone tagged with C-terminal tGFP sequences |
| pCMV6-AC-GFP | Origene (Rockville, MD, USA) | PS100010 | mammalian vector with C-terminal tGFP tag |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen (Hilden Germany) | 12362 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) | 11668-019 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985-070 | |
| DMEM, High Glucose, Pyruvate | Thermo Fisher | 11995-065 | |
| Characterized Fetal Bovine Serum, US Origin | GE Healthcare Life Sciences | SH30071.01 | |
| Goat anti-Human IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | Thermo Fisher | A-11014 | |
| Positive control: anti-glutamate receptor (type NMDA) | Euroimmun AG, Lübeck, Germany | CA 112d-0101 | |
| Euroimmun Assay Kit |
References
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