Autoantibody N-메 틸-D-Aspartate (NMDA) 수용 체에 대 한 혈액에서 검출 하는 간단한 세포 기반 면역 형광 분석 결과

요약

우리는 ectopically NMDA 수용 체에 대 한 자가 면역 뇌염으로 의심 되는 환자의 혈액에서 검출 하는 항으로 인간 배아 세포 (HEK293)에서 녹색 형광 단백질 태그로 NMDA 수용 체의 NR1 소 단위를 표현. 이 간단한 방법 임상 설정에서 심사 적합 있을 수 있습니다.

초록

안티-NMDA 수용 체 autoantibody의 존재 안티 NMDA 수용 체 면역 뇌염 되 나 영향을 받는 환자에서 다양 한 정신병 증상을 일으킬 수 있습니다. 혈액 또는 뇌 척추 액체 (CSF)에 NMDA 수용 체에 대 한 특정 autoantibody의 검출은이 조건의 정확한 진단을 위해 필수적 이다. NMDA 수용 체는 이온 채널 단백질 복잡 한 두 필수 NMDA 수용 체 소 단위 1 (NR1)와 하나 또는 두 개의 NMDA 수용 체를 포함 하 여 4 개의 소 단위를 포함 하는 소 단위 2A (NR2A), NMDA 수용 체 소 단위 2B (NR2B), NMDA 수용 체 소 단위 2 C (NR2C), 또는 NMDA 수용 체 소 단위 2D (NR2D). 안티-NMDA 수용 체 autoantibody epitope NMDA 수용 체의 NR1 소 단위의 extracellular N 맨끝 도메인에 있어야 보고 되었다. 이 연구의 목표는 NMDA 수용 체의 NR1 소 단위에 대 한 신경의 임상 및 기초 연구를 촉진 하기 위하여 혈액에서 검출 하는 검사로 사용할 수 있는 간단한 세포 기반 면역 형광 분석 결과 개발 하는 안티-NMDA 수용 체 면역 뇌염

서론

안티 NMDA 수용 체 면역 뇌염 새로 인식 된 질병 엔터티는 모든 연령대의 환자에서 발생할 수 있으며 주로 여성 환자^1,2에 영향을 미치는입니다. 그것은 가장 자주 진단된 뇌염 뇌염³의 초기 알 수 없는 병을 가진 환자 들 중 하나입니다. 일반적으로 안티-NMDA 수용 체 뇌염으로 영향을 받는 환자는 두통이 나 발열, 의식 수준의 변화 및 다양 한 동요, 과민성을 포함 한 급성 정신병 증상의 빠른 발전에 의해 다음의 prodromal 증상이 불안, 불면증, 환각, 망상, 침략, 기괴 한 행동, 운동 이상, 자율 dysregulation, 그리고 발작 공격^4,5. 이 조건과 immunotherapy 적시 치료의 초기 인식 더 나은 결과 영향을 받는 환자⁶전체 복구에 대 한 중요 하다. 따라서, 안티-NMDA 수용 체 면역 뇌염 환자 급성 또는 새로운 발병 정신병 특징^7,8제시의 중요 한 감 별 진....

프로토콜

연구 기관 검토 위원회의 장 공 기념 병원 Linkuo, 타오 위 엔, 대만 (102-2577A3)에 의해 승인 되었다.

1. NR1 GFP 식 플라스 미드의 준비

1. 살 균 1.5 mL에 대장균 유능한 세포 변형 DH5α의 100 µ L로 NR1 GFP 플라스 미드의 믹스 10 ng까지 부드럽게 튜브를 피펫으로 혼합물을 원심 및 아래쪽 4-6 시간, 20 분 동안 얼음에 튜브를 품 어 고.
2. 물 욕조에 1 분 동안 42 ° C에 튜브를 품 어 물 탕에서 튜브를 제거, 튜브에 1 mL lysogeny 국물 (파운드) 매체를 추가 하 고 1 시간 동안 흔들어와 인큐베이터에서 37 ° C에서 튜브를 품 어.
3. 50 µ L 암 피 실린 (0.1 mg/mL)를 포함 하는 파운드 한 천 배지 위에 혼합물의 확산과 하룻밤 인큐베이터에서 37 ° C에서 파운드 천 배지를 품 어.
4. 멸 균 팁을 사용 하 여 하룻밤 파운드 한 천 배지에서 단일 식민지를 선택 하 고에서 팁을 소용돌이 파운드 매체와 암 피 실린 (0.1 mg/mL) 5 mL를 포함 하는 세균성 문화 관에서. 37 ° c 하룻밤 떨고와 인큐베이터에서 튜브를 품 어.
5. Aliquot 3 mL 250 mL....

결과

평균적으로, 우리는 프로토콜의 섹션 1에서에서 설명한 절차에 따라 250 mL 세균성 문화에서 200-300 µ g 내 무료 식 플라스 미드 NR1 GFP와 GFP를 얻을 수 있습니다. 프로토콜의 섹션 2에에서 설명 된 대로 48-잘 접시에 배양 HEK293 세포의 transfection는 양의 식 플라스 미드의 100 ng/잘 사용 되었다. transfection 후 24-30 h, 셀 표현 NR1 GFP 그리고 GFP 재조합 단백질 형광 현미경에서 검출 될 수 있습니다. 그림 1A 는 그림 1D GFP를 표현 하는 셀을 표시 하는 동안 NR1 GFP를 표현 하는 호스트 셀의 이미지를 보여 줍니다. 녹색 신호 분석 결과의 품질 컨트롤러로 사용할 수 있습니다: 셀의 약 30%는 형광 현미경에서 녹색 신호를 했다. 그림 1A

토론

라이브 세포 기반 면역 형광 분석 결과¹¹, 고정 세포 기반 면역 형광 분석 결과^{9 포함 하 여 문학에서 보고 된 NMDA 수용 체에 대 한 신경의 존재를 화면에 여러 세포 기반 면역 분석을 있다} , cytometry 기반 흐름 시험¹⁴및. 라이브 세포 기반 면역 형광 분석 결과 흐름 cytometry 기반 분석 결과 훈련 된 인력과 특수 장비를 요구 하면서 ectopically NR1 단백질을 표현 하는 세포의 준비 후 수행 되어야 한다. 고정된 셀 기반 면역 형광 분석 결과 더 편리한 분석 결과 임상 설정에 대 한 수행할 수 있습니다. 따라서, 많은 연구 상업 간접 고정된 세포 기반 면역 형광 분석 결과 화면 안티 NMDA 수용 체 autoantibody 혈 청 및 CSF 표본^12,15를 사용........

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
GRIN1 (GFP-tagged) - 인간 글루타메이트 수용체, ionotropic, N-methyl D-aspartate 1 (GRIN1), transcript variant NR1-1	Origene (Rockville, MD, USA)	RG219368	C-terminal tGFP sequences
pCMV6-AC-GFP	Origene (Rockville, MD, USA)	PS100010	C-terminal tGFP tag
EndoFree Plasmid Maxi Kit	Qiagen (Hilden Germany)	12362
Lipofectamine 2000 Transfection 시약	Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)	11668-019
Opti-MEM I 환원 혈청 매체	Thermo Fisher	31985-070
DMEM, 고포도당, 피루브산	Thermo Fisher	11995-065
특성화된 소 태아 혈청, 미국 원산지	GE Healthcare Life Sciences	SH30071.01
염소 항-인간 IgG (H+L) 2차 항체, Alexa Fluor 594 conjugate	Thermo Fisher	A-11014
양성 대조군: 항-글루타메이트 수용체 (type NMDA)	Euroimmun AG, Lü beck, 독일	CA 112D-0101
Euroimmun 분석 키트