Summary
꼬마 선 충 (C. 선 충) axonal 세포내 수송을 공부 하는 좋은 모델입니다. 여기, 내가 vivo에서 녹음 및 C. 선 충에 axonal intraflagellar 수송의 분석을 위한 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
Axonal 전송 및 intraflagellar 전송 (IFT) 축 삭과 속눈썹 morphogenesis 및 기능에 대 한 필수적입니다. Kinesin superfamily 단백질과 다 분자 모터를 각각 참가자 및 역행 전송 규제 있습니다. 이 모터는 레일으로 microtubule 네트워크를 사용합니다. 꼬마 선 충 (C. 선 충) axonal 전송 및 IFT에서 vivo에서공부 하는 강력한 모델 생물 이다. 나 axonal 교통과 IFT 생활에서 관찰 하는 프로토콜을 설명 하는 여기, C. 선 충. 수송된 화물 화물 단백질 같은 녹색 형광 단백질 (GFP) 형광 단백질을 사용 하 여 태그를 추가 하 여 구상 될 수 있다. C. 선 충 은 투명 하 고 GFP 태그 화물 단백질 세포 특정 발기인에서 특정 셀에 표현 될 수 있습니다. 살아있는 벌레 살인 또는 벌레를 마비 없이 10 %agarose 젤에 microbeads에 의해 해결할 수 있습니다. 이러한 조건 하에서 화물 움직임 관찰 될 수 있다 직접 축 삭 및 생활의 속눈썹에 절 개 없이 C. 선 충 . 이 메서드는 대상 단백질을 수정 하 여 셀 또는 셀에 표현에서 어떤 화물 분자의 관찰에 적용할 수 있습니다. 가장 기본적인 단백질 분자 모터 및 axonal 교통과 IFT에 관련 된 어댑터 단백질 C. 선 충에 보존 됩니다. 다른 모델 유기 체에 비해, 돌연변이 얻은 고 C. 선 충에 더 쉽게 유지. 이 메서드를 결합 하 여 다양 한 선 충 C. 돌연변이와 axonal 교통과 IFT의 분자 메커니즘 명확히 수 있습니다.
Introduction
라이브 셀 이미징 세포내 수송을 분석 하기 위한 필수적인 도구입니다. 신경 세포 생물학에서 라이브 셀 이미징 axonal 전송의 분석 신경 기능과 morphogenesis1를 이해 하기 위한 필수적입니다. 결함 axonal 전송에 여러 가지 신경 장애2기반이 됩니다. Kinesin superfamily 단백질과 다 수행 axonal 전송 anterogradely 그리고 retrogradely, 각각1,2.
속눈썹은 다른 세포질 격실 있는 microtubule 네트워크 및 밀매 기계는 고도로 발달된3. 단백질 종합 기계 하지 속눈썹 팁 속눈썹 단백질 세포질에서 수송 되어야 한다 즉, 속눈썹에 지역화 됩니다. 속눈썹 전용 kinesin 다, 라는 각각 kinesin-2와 세포질 다-2, 속눈썹4, intraflagellar 전송 (IFT)5라는 현상의 구성 요소를 전송. IFT의 장애 ciliopathies6라는 질병의 스펙트럼을 발생 합니다. 따라서, 라이브 셀 이미징에 의해 IFT 메커니즘의 분석 속눈썹 형성과 pathogenesis의 기본 메커니즘을 이해 해야 합니다.
꼬마 선 충 (C. 선 충) axonal 교통과 IFT7,,89공부 하기 좋은 모델입니다. 관찰 하기 위해 IFT, Chlamydomonas 은 모델 생물5,6으로 널리 사용 되었습니다. Chlamydomonas 는 단 세포 유기 체, 노화, 신경 기능과 동작 IFT의 관계 분석 하기 어려울 것 이다. 또한, CRISPR/Cas9 등 필수 유전자 기술 하지 Chlamydomonas에 적용 되었을. 높은 모델 생물, 초파리, 쥐 등 자주 axonal 교통과 IFT 중단 하면 치명적인 고기 axonal 교통과 IFT morphogenesis 및 동물 10의 항상성 위해 필수적 이기 때문에 11. 마우스의 경우 세포 배양과 transfection은 일반적으로 필요 axonal 교통과 IFT, 많은 기술 및 광범위 한 시간12,13필요를 관찰 합니다. 또한, 중요 한 생리 적 맥락을 많이 배양된 세포 및 셀 손실 수 있습니다. C. 선 충 돌연변이 axonal 전송 또는 IFT 혼란 된다 신 경계는 벌레의 생존에 필수적 이기 때문에 없습니다 종종 치명적인7,,914. Axonal 교통과 IFT 관찰할 수 있습니다 직접 vivo에서 절 개 없이 선 충 C. 투명 이며 따라서 GFP 태그 마커를 관찰 하기 쉽게 때문에.
C. 선 충, 마 취16, 또는 microbeads17미세 장치15, agarose 패드를 사용 하 여 고정을 여러 프로토콜을 확인 하 고 있습니다. 마 취의 포함 신경15밀매 이벤트를 억제 수 있습니다. 미세 장치 메서드는 분명 단점은 그 미세 장치를 준비 하 고 항상 쉽지 않다입니다. 대신, immobilization agarose 패드와 microbeads에 의해 C. 선 충에서 시간 경과 화상 진 찰을 수행 하는 편리 하 고 쉬운 방법 이다. 여기, 제가 설명 C. 선 충 을 무력화 하 고 시각화 axonal 전송 IFT에서 vivo에서 에서이 기본 프로토콜 C. 선 충. 다른 방법에 비해, 여기 설명 하는 방법을 특별 한 장비가 필요 하지 않습니다 하 고 훨씬 저렴 하 고 쉽게 수행 하는.
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Protocol
1. 샘플 준비
- 생성 유전자 변형 C. 선 충 유전자 변형 방법론 18를 사용 하 여 관심사의 변형. 또는, 적절 한 긴장을 꼬마 유전학 센터 (CGC)에서 가져옵니다. 시 냅 스 소포 선구자의 axonal 전송을 시각화 하려면 유전자 변형 라인 wyIs251 [Pmig-13::gfp::rab-3] 7. IFT 관찰, 유전자 변형 라인 mnIs17 [osm 6::gfp] 19를 얻을. 이러한 긴장은이 프로토콜에 사용 됩니다.
참고: 중 extrachromosomal 배열, 게놈 통합, 또는 심지어 GFP 노크에 작품. 배경 신호를 줄이기 위해, 사용 하 여 셀 특정 발기인 보다는 팬-신경 발기인.
참고: 벌레의 유지 관리는 다른 프로토콜 20에 설명 되어 있습니다. 변종 선 충 류 성장에 Escherischia 대장균 OP50 급지대의 잔디밭에 유지 되었다 중간 (NGM) 접시 (1.7% (w/v) agarose, 50 mM NaCl, 0.25% (w/v) 펩, 1mm CaCl 2, 5mg/mL 콜레스테롤, 25mm KH 2 포 4, 1mm MgSO 60 mm 직경 플라스틱 접시에 4) 20 ° c. - 성장 벌레의 어떤 라이프 사이클 단계로 NGM 접시에 20 ° C에서 웜.
참고: 모든 단계에서 axonal 교통과 IFT를 관찰할 수 있다 하나. 여러 게시 이러한 단계와 시각화 된 밀매 이벤트 14 , , 21 22 사용 하기 때문에 젊은 성인 늦은 L4 좋은 긍정적인 통제는 , 23.
2. 10%의 준비 Agarose
참고: 한 천, 한 천 분말, agarose 등 유사한 제품을 제공 하는 많은 공급 업체. 전기 이동 법 학년 agarose를 사용 하 여 (강도 젤 > 1200 g/c m 2). 저렴 한 천 분말 결과 젤은 충분히 강한 벌레를 무력화 하기 때문에 작동 하지 않습니다.
- 믹스 0.4 g agarose 4에서 mL 증류수 (DW) 유리 튜브 (1.5 c m x 10.5 c m). 뚜껑을 증발을 피하기 위해 유리 튜브에 넣어.
- 90 분 동안 95 ° C 열 블록에 유리 튜브를 넣어. 또한, 다른 유리 튜브 (1.5 c m x 10.5 c m) DW 가득 준비 하 고 95에서 계속 ° C. 넣어 파스퇴르 피펫으로 95 ° C DW ( 그림 1 A). 작은 거품을 많이 agarose 튜브에서 볼 것 이다 그리고 솔루션 탁 되어야 합니다. 솔루션 취소 될 때까지 놔 둬. 다음, agarose 솔루션 균질 될 때까지 아래로 pipetting 혼합.
참고: 전자 레인지 10 %agarose 솔루션 DW agarose에서 만든 때를 준비 하는 사용할 수 없습니다. 전자 레인지에 의해 발생 하는 작은 거품 agarose 녹는 것을 방지 합니다. 그러나, 응고 10 %agarose 젤 수 있습니다 쉽게 될 녹아 전자 레인지를 사용 하 여 다시. 10 %agarose 젤을 포함 하는 유리 튜브 미리 준비 하 고 6 개월 이상 4 ° C에서 저장 수 있습니다. 이렇게 필요할 때 전자 레인지를 사용 하 여 주식을 용 해 하 고이 프로토콜의 3 단계에서 시작.
참고: Agarose 점차적으로 또는 반복된 응고 및 용 해 후 오랜 시간 동안 95 ° C에서 incubated 경우 응고 능력을 잃는다. 이 경우, 준비 새로운 10 %agarose.
3. Agarose 패드의 준비
- 따뜻하게 파스퇴르 피펫으로 단계 2.2에서에서 준비를 사용 하 여 76 x 22 mm 슬라이드 위에 2 방울 10 %agarose.
- 빨리 agarose 강하 하기 전에 두 번째 76 x 22 m m 2 슬라이드 커버 굳은 에서처럼 그림 1 B, 그리고 밀어 아래로 두 번째 슬라이드에 agarose 솔루션을 평평 하 게. 두께 0.5-1 이어야 한다 m m.
- 신속 하 게 파스퇴르 피펫으로 여 플러시 pipetting 95 ° C DW 위아래로 agarose 솔루션은 밖으로 세척 될 때까지. 그렇지 않으면,는 피펫으로 agarose 젤에 의해 막힌 될 것입니다. 95 ° C DW에에서 피 펫 서 둡니다.
- 잠깐 1 분입니다. Agarose 패드 고 흐린 되. 그런 다음 ( 그림 1 C) 손으로 떨어져 슬라이드 슬라이드.
4. 벌레의 장착
참고:도 적은 양의 웜 운동 방지 좋은 관찰. Levamisole는 agarose 패드 24 , 25에 웜 움직임을 방지 하기 위해 전통적으로 사용 되었습니다. 그러나, Levamisole C. 선 충에 있는 신경 수용 체를 억제 하 고 따라서 신경 15 밀매 이벤트에 영향을 미칠 수 있습니다. Hereis 좋은 대체 17 설명 사용 하 여 폴리스 티 렌 microbeads.
- Slidable 미러 transillumination를 장착 스테레오 현미경, 전송 ~ 30 새로운 NGM 적절 한 표시자를 표현 하는 유전자 변형 웜 접시 없이 박테리아 백 금 철사를 사용 하 여 선택.
참고: 백 금 철사 선택 백 금 철사 및 만든 파스퇴르 피 펫 (5 인치), 그리고 백 금 철사의 끝이 평평 했다. 백 금 철사 추천의 준비 및 취급이 벌레의 Wormbook (http://www.wormbook.org)에 설명 되어 있습니다.
참고: 아무 마 취 관리 때문에 벌레만 천 패드, 폴리스 티 렌 microbeads coverslip 17에 의해 생성 된 마찰 힘에 의해 고정 됩니다. 급지대 박테리아 너무 많은 솔루션의 존재는 마찰 힘 약한 하게된다.
참고: (예를 들어, 22 x 22 m m 2, 18 x 18 m m 2) coverslips의 다른 크기를 작동합니다. 그러나, 더 큰 coverslips 침수 물 또는 오일 샘플 관찰 하는 동안 유출 대물 렌즈에서 방지할 수 있습니다.
5. 관찰
참고: 적절 한 이미징 매개 변수 (레이저 전력, 이득, 범주화, 등) 각 현미경 시스템 및 카메라에 대 한 다를 것 이다. 여기, 회전 디스크 confocal 스캐너와 디지털 CCD 카메라 widefield 현미경 사용 됩니다.
- 20 ° c, 무대의 온도 제어를 설정 하거나 조정 실내 온도 20 ° c.
- 샘플 슬라이드를 현미경 무대 위에. 100 x를 사용 하 여 (수 가늠 구멍 = 1.3 또는 더 나은) 렌즈.
- 그림 2 A (wyIs251 및 axonal 전송) 또는 그림 2 B (mnIs17와 IFT) 긍정적인 컨트롤에 표시 된 영역에 대 한 보고 . 다른 분야는 잘 22로 분석 될 수 있다.
- 세트 매개 변수 (CCD 이득 = 200, Binning = 1 또는 2, 488에서 레이저 전원 nm = 1.0-1.3 mW). 시간 경과 기록 4 프레임/s에서 최대 1 분 mutli-TIFF 형식으로 파일 저장에 대 한 수행.
참고: 경우 GFP 신호 사라지고 GFP::RAB 3 또는 OSM 6::GFP 30에 대 한 관찰을 계속 하기가 s, 레이저 힘이 너무 강해. 이 경우, 레이저 파워를 줄일 수 있습니다. 반대로, 기공을 운동 기록 레이저 파워는 너무 약하다. 이 경우, 레이저 파워 증가. - 다른 벌레를 관찰 하 고 5.3 및 5.4 반복. 관측 최대 20 분 동안 지난 수 있습니다 하지만 각 웜 p의 효과 피하기 위해 한 번만 기록해 야hoto 손상.
참고: 중요 한 결함 7 , , 27 28 없이 적어도 20 분 동안 벌레 관찰 되었습니다. 더 이상 관찰 가능 피난처 있을 수 있습니다 ' t 되었습니다 아직 테스트. 신경 죽음의 명확한 표시 neurite 붓기 같은 신경 형태학의 변화 이다. 약한 GFP 신호는 축 삭과 dendrites wyIs251와 mnIs17에서 볼 수 있는, neurite 형태학 축 삭 또는 모 수석 보고 그냥 쉽게 확인할 수 있습니다. 신경 형태는 그림 2에 표시 됩니다. - 동영상 파일 생성.
- 오픈 멀티 TIFF 파일 피지 소프트웨어를 사용 하 여. 파일 이동 > 오픈 단계 5.4에에서 저장 된 멀티 TIFF 파일을 선택 합니다.
참고: 피지는 jttps://fiji.sc에서 다운로드할 수 있습니다. 이미지 J와 플러그인 또한 kymographs를 생성 하기 위해 사용할 수 있습니다. 이렇게 하는 경우 선택한 플러그인. 관련 지침에 따라 - 클릭는 " 사각형 선택 " ( 그림 3, 화살표) 버튼과 선택 사각형을 그려서 관심 영역 으로 컴퓨터 마우스 (노란색 사각형 그림 3 A). 이미지로 이동 > 스택 > 도구 > Substacks 고 영화에 포함 된 슬라이스 번호를 선택 하십시오. 생성 되는 substack.
- Substack 창을 클릭 하 여 활성화 하 고 이미지로 이동 > 조정 > 밝기/대비. 밝기 및 대비를 조정 하는 창이 나타난다. 창에서 슬라이드 상단 바 (최소) 오른쪽에 배경 신호 사라진다 고 두 번째 최고 (최대) 바 왼쪽 그래서 그 움직이는 소포 및 입자 볼 수 있는 배경 위에 아주 잘.
- 이미지로 이동 > 스택 > Stamper 시간. 영화 단계 5.4에서에서 4 프레임/s, 기록 시간 간격 이다 0.25 s. 따라서, 입력 " 0.25 " 간격에서.
- 다른 이름으로 저장을 선택 하 여 동영상 파일 생성 > AVI 파일 메뉴 (영화 1, 2).
참고: 적절 한 플러그인을 사용 하 여 저장할 수 있습니다 파일을 다른 형식으로 같은 " mpeg4 " 또는 " mov " 파일.
- 오픈 멀티 TIFF 파일 피지 소프트웨어를 사용 하 여. 파일 이동 > 오픈 단계 5.4에에서 저장 된 멀티 TIFF 파일을 선택 합니다.
- 생성 kymographs.
- 피지 소프트웨어를 사용 하 여 다시 원래의 동영상 파일을 열고 단계 5.6.2 5.6.3 밝기 및 대비를 조정 하려면 반복.
- 클릭 " 세그먼트 라인 " ( 그림 3 B, 화살표). 속눈썹 또는 축 삭 (노란 선, 그림 3 B에) 따라 세그먼트 선을 그리는 마우스를 사용 하 여.
- 이동 분석 > 멀티 Kymograph > 멀티 Kymograph ( 그림 3 C). 선 폭 창이 나타납니다 ( 그림 3 D). 유형 " 3 " 선 폭 창에서 확인을 클릭 합니다 ( 그림 3 D).
- Kymograph 창이 생성 됩니다. TIFF 또는 JPEG 형식으로 이미지를 저장.
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Representative Results
DA9 신경 axonal 전송
WyIs251 선, 참가자 및 GFP::RAB-3의 역행 axonal 수송을 사용 하 여 DA9 모터 신경에 동시에 기록 될 수 있습니다. 참가자 및 역행 DA9 신경 근 등 축 삭에서의 평균 속도 약 1.8, 2.6 μ m/s, 각각22. 움직이는 소포 수 0.03 μ s 당 축 삭의 당 0.018에 대 한 것입니다. 따라서, 100 x 렌즈를 사용 하 여 DA9 축 삭의 10 μ m의 30 s 관찰, 대 한 한 약 9와 5 축 삭 (그림 4 및 영화 1)에서 소포를 이동 찾을 수 있습니다. 기공을 운동 관찰 될 수 있다, 레이저 힘은 너무 약이 가능 하다. 긴 범위 실행, 뿐만 아니라 소포 풀의 단거리 움직임 수 (영화 1)를 기록 했다. 다른 사람 거기7,23에서 해리 하는 동안 일부 소포 이러한 기 풀에서 중지 됩니다. 이러한 매개 변수 모니터링 하 고 돌연변이 고기를 분석 하는 데 사용 될 수 있습니다.
꼬리 신경에 있는 IFT
속눈썹은 C. 선 충 (그림 2B) 모 수석의 끝에 지역화 됩니다. MnIs17 변형 GFP 태그 OSM-6, IFT subunits29중 하나를 표현 한다. OSM-6은 모두 머리에 표현 되며 신경19꼬리. 많은 머리 속눈썹 mnIs17에 의해 표시 됩니다, 하는 동안 두 속눈썹 꼬리 신경에 명확 하 게 관찰 된다. 따라서, 이러한 속눈썹을 관찰 (토론 참조) 머리 속눈썹 보다 쉽습니다. OSM 6::GFP 축 삭, 세포 체, 그리고 모 수석에 있는 같은 신경 세포질에서 확산 이다. 그러나,에서 속눈썹, OSM 6::GFP은 속눈썹에 집중 하 고 입자 이동에 통합. PHA, PHB 속눈썹의 길이 약 6.5 μ m. 참가자 IFT 복 형 8,9입니다. 참가자 IFT의 속도 이며 0.7 및 1.3 μ m/s는 속눈썹의 중간과 원심 세그먼트에 대 한 각각 (그림 5 영화 2).
그림 1 : 샘플 준비의 데모. (A) 뜨거운 DW, 파스퇴르 피펫으로 고 열 블록에 10 %agarose. (B와 C) Agarose 패드의 준비: agarose 패드 슬라이드 (B) 사이 형성 된다. 위 슬라이드는 agarose 패드 형태 (C) 후 제거 됩니다. 어떻게 폴리스 티 렌 비드 솔루션을 보여주는 그림 (D) 회로도 agarose 패드에 놓입니다. (E) 회로도 웜 백 금 철사를 사용 하 여 폴리스 티 렌 비드 솔루션에 배치 되는 방법을 보여주는 그림 선택 합니다. (F) A coverslip (22 x 44 m m2) agarose 패드에 놓입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 지역 이미징. (A) 회로도 DA9 및 VA12 신경 및 wyIs251의 대표 이미지 그리기 DA9 뉴런에서 복 부 축 삭, commissure, 및 근 위 축 삭은 없습니다 성숙한 시 냅 스. 하지만 시 냅 스 소포 선구자 세포 체에서 이러한 axonal 영역을 통해 시 냅 스로 이송 됩니다. 관찰 해야 하는 영역 상자에 의해 표시 됩니다. PHA, PHB 신경 및 그들의 속눈썹의 그림 (B) 회로도 관찰 해야 하는 영역 상자에 의해 표시 됩니다. 눈금 막대 = 10 μ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 세대의 영화와 피지 소프트웨어를 사용 하 여 kymographs. (A) "사각형 선택" 버튼 (화살표)를 클릭 하 고 하나는 사각형 (노란색 상자) substacks를 생성 하 여에 집중 하고자 하는 영역을 선택. (B) 세그먼트 라인 단추 (화살표)와 마우스 (노란색 선)를 사용 하 여 속눈썹을 따라 세그먼트 라인 그릴. (C) 선택 "분석", "다중 Kymograph", 및 "다중 Kymograph" 플러그인 하려면 kymographs를 생성 하. (S) 선 폭을 입력 하 고 "확인"을 클릭 합니다 생성 하는 kymographs (그림 5 및 그림 7). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 시 냅 스 소포 선구자의 axonal 전송의 대표 kymograph. GFP::RAB-3 운동 DA9 신경의 근 asynaptic 지역에서 관찰 하 고는 kymograph 피지의 멀티 Kymograph로 생성 되었습니다. 가로 및 세로 막대 길이 시간, 각각 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : IFT의 대표 kymograph. OSM 6::GFP PHA, PHB 속눈썹에서 관찰 하 고이 kymograph 그들 중 하나에 밀매 이벤트에서 생성 됩니다. kymograph 피지의 멀티 Kymograph로 생성 되었습니다. 가로 및 세로 막대 길이 시간, 각각 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
영화 1: 시 냅 스 소포 선구자의 axonal 수송의 대표적인 영화. GFP::RAB-3 운동 DA9 신경의 근 asynaptic 지역에서 관찰 된다. GFP::RAB-3은 시 냅 스 소포 선구자에 통합 그리고 수송. 참가자와 역행 axonal 전송 기록 됩니다. 일부 소포 중지 하지만 다시 시작. 영화 4 프레임/s와 15 프레임/s. Sca에서 놀이에서 기록 했다르 바 = 5 μ m. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 (다운로드 오른쪽 클릭.)
영화 2: IFT의 대표적인 영화. OSM 6::GFP PHA, PHB 속눈썹에서 관찰 됩니다. OSM 6::GFP 복잡 한 IFT에 통합 되 고 속눈썹을 따라 이동 합니다. 영화 4 프레임/s 및 재생 기록 된 15 프레임/s의 눈금 막대 = 5 μ m. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 (다운로드 오른쪽 클릭.)
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Discussion
기존의 방법에 관하여 제한
여기 설명 하는 방법은 관찰 axonal 전송 등 IFT 빠른 이벤트 최적화 됩니다. 따라서, 동원 정지는 더 이상 부 화 보다 우선 됩니다. 우리는 중요 한 섭 동 없이 적어도 20 분 동안 매매 이벤트를 관찰할 수 있다,이 방법은 않을 수 있습니다 항상 축 삭 신장 등 셀 마이그레이션 더 이상 관찰을 요구 하는 느린 이벤트를 관찰 하는 적당 한. 더 이상 관찰에 대 한 하나는 agarose의 비율을 감소 시켜 조건을 최적화 해야 (즉, 증가 하 고 최대 건조 하 고 그 잠재적으로 압력 감소를 피하기 위해 물을 발생 하는 손상). 또는,15 또는 immobilization 웜 agarose 패드와 마 취를 사용 하 여 위에서 설명한 미세 장치 부작용을 신중 하 게 평가 해야 하는 동안 더 적합 한16 수 있습니다.
프로토콜 내에서 중요 한 단계
적절 한 관찰에 대 한 마커는 중요 합니다. 마커 소포 또는 입자에 통합 될 필요가 충분 한 밝기의 수 있습니다. Extrachromosomal 배열 또는 통합된 라인 중 하나를 사용할 수 있습니다. DA9 신경에 시 냅 스 소포 선구자의 axonal 전송의 시각화, wyIs251 긴장 유용한7,23입니다. jsIs821 는 일부 연구26,27mechanosensory 신경의 axonal 교통 관찰 하에 사용 되었습니다. 다른 뉴런을 분석할 때 셀 특정 발기인을 사용 하 여 관심 있는 신경에 시 냅 스 소포 단백질을 표현 한다. 이 발기인 충분히 강한 해야 합니다. 랩-3,에 스 앤 비-1 시 냅 스 소포 선구자22,,2326를 널리 사용 됩니다. 관찰 하기 위해 IFT, IFT 복잡 한 구성 요소를 표시 합니다. 긍정적인 통제 mnIs17 스트레인29좋은 선택 이다. 8 셀 (ASE, ASG, ASI, ASL, 화산재, ASK, ADF, ADL)에서 나오는 속눈썹 속눈썹 2 셀 (PHA, PHB)에서 꼬리 (phasmid)에 번들로 제공 하는 동안 머리 (amphid)에서 함께 번들 됩니다. OSM-6::GFP mnIs17모든 ciliated 신경 세포에 표현 된다, 때문에 그것은 IFT 머리 속눈썹에서 자세히 분석 하기 어려울 수 있습니다. 그러나, 꼬리 지역에서 유일한 PHA, PHB 신경 표시 됩니다 하 고 IFT 각 셀에 쉽게 해결 될 수 있습니다 키를 누릅니다. 형광 단백질에 의해 표시 된 다른 IFT 단백질 IFT21,28관찰을 사용할 수 있습니다. 만약 하나의 소원을 머리 신경 세포 분석, 세포 특정 발기인 유용할 것 이다. 머리 속눈썹을가지고 있지만 다양 한 형태학, 전송 이벤트 기록된29수 있습니다. 이러한 마커 돌연변이로, axonal 교통과 IFT에서 어떤 유전자의 기능 해석 vivo에서될 수 있습니다. 분석할 수 있는 매개 변수는 이전 작업22,23,,2627에서 설명 되었습니다. GFP는 최고의 기본 선택입니다. 그러나 mCherry 및 tdTomato 사용된22에 영향을 수도 있습니다, 그리고, mCherry GFP 보다 훨씬 주차. tdTomato 연동 이합체는 단위체 형광 단백질, 때로는 퓨전 단백질30의 역학에 영향을 미치는 보다 큰. 따라서, 결과 분석 해야 하 고 tdTomato을 사용 하는 경우 신중 하 게 해석. mScarlet, 최근 개발 밝은 단위체 빨간 형광 단백질 대체 선택31이다.
회전 디스크 confocal 현미경 검사 법은 널리 axonal 교통과 IFT7,21을 관찰 하는 데 사용 됩니다, 장비 비싼 이며 일부 연구 환경에 액세스 하기 어려울 수 있습니다. 그러나, 이러한 현상은 수 있습니다 또한 기록 되며 선 충 C. C. 선 충 은 작은 하 고 투명 한 동물 관찰 하기 쉽게 때문에 높은 NA 렌즈를 장착 하는 경우 표준 형광 현미경을 사용 하 여 분석.
미래의 응용 프로그램
비슷한 동원 정지 방법을 여기에 설명 된에 의해 IFT vivo32에서 단일 분자 해상도에서 관찰 되었다. 또한, 여러 종류의 슈퍼 해상도 현미경이 개발 되었습니다. 하나 직접 슈퍼 해상도 현미경 분석을 여기에 설명 된 방법을 적용할 수 있습니다. 내 경험에서 Airyscan33 의 고속 모드 IFT 분석을 아주 잘 작동 합니다. 이론적으로, 회전 디스크 슈퍼 해상도 현미경 (SDSRM) 잘34로 좋은 선택이 될 것 이다. 결론적으로, 돌연변이 라이브러리 및 이러한 새로운 기술, 설명 하는 방법을 결합 하 여 여기 해야 합니다 axonal 전송 및 IFT에서 vivo에서의 분자 메커니즘을 명확히 하는 데 유용.
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Disclosures
저자는 공개 상관이 있다.
Acknowledgments
깊이 저자 박사 아 사코 스 기 모토 (도호쿠 대학) 그녀의 도움이 토론 감사합니다. wyIs251 박사 강 쉔 (스탠포드 대학)에서 관대 한 선물 했다. mnIs17 는 NIH 연구 인프라 프로그램 (P40 OD010440)의 사무실에 의해 자금 CGC에 의해 제공 했다. 이 작품은 JSP KAKENHI 그랜트 #17 H 05010 및 #16 H 06536와 다이 이치 산 쿄 재단, 뇌 과학 재단과 나이토 재단에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Slideglass (76 x 26 mm) | Matsunami | S1111 | |
| Coverglass (22 x 40 mm) | Matsunami | C024401 | |
| Agarose | Wako | 318-01195 | |
| Polystylene microbeads 0.1 micron | Polysciences | #00876 | |
| Heat block | TAITEC | 0063288-000 | CTU-mini |
| Microscope | Olympus | IX-71 | widefield microscope |
| Spinning disk Scanner | Yokogawa | CSU-X1 | spinning disc confocal scanner |
| Digital CCD camera | Hamamatsu Photonics | C10600-10B | ORCA-R2 degital CCD camera |
| Objective lens (x100, NA1.4) | Olympus | UPLSAPO 100XO | |
| Pasteur pipette (5 inch) | IWAKI | IK-PAS-5P | |
| Glass tube (1.5 cm diameter x 10.5 cm) | IWAKI | 9820TST15-105NP | |
| TV9211: wyIs251 | Laboratory of Kang Shen | N/A | |
| OTL11: mnIs17 | Ref. 27, 29 | N/A | SP2101 was backcrossed with wild type for 6 times |
| Stereo microscope | Carl Zeiss | 435064-9000-000 | STEMI 508 |
| Mirror transillumination unit | Carl Zeiss | 435425-9010-000 | |
| platinum wire (0.2 mm) | Nilaco Corporation | m78483501 | |
| 60 mm plastic dish | Falcon | #351007 | |
| Fiji | N/A | N/A | https://fiji.sc/ |
| nematode growth medium (NGM) | 1.7% (w/v) agarose, 50mM NaCl, 0.25% (w/v) Peptone, 1 mM CaCl2, 5 mg/mL Cholesterol, 25 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4 |
References
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