Summary
Denne protokollen beskriver en varme sjokk-indusert protein uttrykk (pDHsp/V5-hans/sf9 celle system), som kan brukes for uttrykke utenlandske proteiner eller evaluere anti-apoptotisk aktiviteten til potensielle utenlandske proteiner og deres avkortet aminosyre syrer i insekt celler.
Abstract
Forbigående gene expression systemet er en av de viktigste teknologiene for å utføre protein funksjonsanalyse i baculovirus i vitro celle kultur-systemet. Dette systemet ble utviklet å uttrykke utenlandske gener under kontroll av baculoviral selskapet i forbigående uttrykk plasmider. Videre kan dette systemet brukes en funksjonell analysen av enten baculovirus selv eller utenlandske proteiner. Mest allment og kommersielt tilgjengelig forbigående gene expression systemet er utviklet basert på umiddelbar-tidlig genet (IE) arrangøren av Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrovirus (OpMNPV). Men ble en lav uttrykk nivå av utenlandske gener i insekt celler observert. Derfor ble en forbigående gene expression system bygget for å forbedre protein uttrykk. Dette systemet ble rekombinant plasmider konstruert inneholder mål serien under kontrollen Drosophila varme sjokk 70 (Dhsp70). Denne protokollen presenterer anvendelse av denne varme sjokk-baserte pDHsp/V5-hans (V5 epitope med 6 histidin) /Spodoptera frugiperda celle (sf9 celle) systemet. Dette systemet er ikke bare tilgjengelig for genuttrykk men også for å vurdere anti-apoptotisk aktiviteten til kandidaten proteiner i insekt celler. Videre, dette systemet kan være enten transfected med en rekombinant plasmider eller co transfekterte to potensielt funksjonsdyktighet antagonistiske rekombinant plasmider i insekt celler. Protokoll viser effektiviteten til systemet og gir en praktisk sak av denne teknikken.
Introduction
To protein uttrykk systemer har blitt brukt for å produsere proteiner: Ifølge protein uttrykk systemer (Escherichia coli gene expression system) og eukaryoter protein uttrykk systemer. En populær eukaryoter protein uttrykk system er det baculovirus uttrykk vektor system (BEVS)1. Baculoviruses ble først brukt i verdensomspennende biologisk kontroll av jordbruk og skog skadedyr. I de siste tiårene, ble baculoviruses utviklet som bioteknologisk verktøy for protein uttrykk vektorer også. Genomer av baculoviruses består av double-strandet sirkulær DNA og omsluttede nucleocapsids2. Hittil mer enn syttiåtte baculovirus har isolerer blitt sekvensert3. Basert på timelige kaskade av baculoviral genet uttrykk i vert insekt celler, kan gene transkripsjon klassifiseres i fire timelige cascades, inkludert umiddelbar-tidlig, forsinket-tidlig slutten og veldig sent gener4.
BEVSs ble utpekt slik at de veldig sent gene arrangørene (dvs., polyhedron eller p10 promoter) ble brukt til å kjøre mål genene, mens den rekombinant baculovirus ble generert av homologe rekombinasjon. Uttrykk for utenlandske proteiner i insekt celler av rekombinant baculovirus er lik for pattedyr proteiner i post-translasjonell modifikasjoner (egnet for glykoprotein produksjon). Baculovirus er dermed brukte5,6,7. Imidlertid er en begrensning tilstedeværelsen av ulike N-glykosylering veier i insekt celler7.
Derfor ble en ny baculovirus uttrykk system, forbigående gene expression systemet, utviklet. Dette systemet uttrykker utenlandske gener under stasjonen på baculoviral umiddelbar-tidlig arrangører (ie-1 promoter) i insekt celler. Ved å bruke dette systemet, kan målet protein umiddelbart uttrykkes under kontroll av ie-1 promoter mens endre N-glykosylering veien i insekt celler, som resulterer i bedre N knyttet oligosaccharides7. Videre baculoviral umiddelbar-tidlig gener er transkribert av verten cellen RNA polymerase II og krever ikke noen viral faktor for aktivisering4. Derfor kan utenlandske proteiner uttrykkes i insekt celler innen kort tid. Hittil, forbigående er gene expression system en av de viktigste teknologiene for å utføre protein funksjonelle analyser i baculovirus i vitro celle kultur-systemet. Systemet kan brukes til å analysere funksjonen til baculovirus eller utenlandske proteiner. En av de tilgjengelige forbigående gene uttrykk systemene er basert på den umiddelbare-tidlige genet (IE) arrangører av Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrovirus (OpMNPV) (OpIE2 og OpIE1 arrangører).
Men var uttrykket underetasjen av utenlandske gener i insekt celler fortsatt et problem da OpIE promoter-baserte forbigående gene expression systemet var brukt8,9,10. Dermed bygget et annet forbigående gene expression system basert på arrangøren av Drosophila varme sjokk protein 70 (hsp70) genet8,9. Bak hsp70 arbeider mer effektivt enn baculoviral IE promoter når indusert av heten støt i insekt celler10. I dette systemet, ble målet genene uttrykt under stasjonen Drosophila varme sjokk 70 (Dhsp70) formidler. Utenlandske gener kan klones lett i forbigående gene expression plasmider PCR-basert kloning metoder. Videre kan kontroll av tidspunktet for genuttrykk utføres av varme sjokk induksjon.
I denne rapporten, vi følger tilnærming og express tre ulike truncations av baculoviral genet (inhibitor av apoptose 3, iap3 fra Lymantria xylina MNPV) ved hjelp av varme sjokk-basert forbigående protein uttrykk system og videre bruk disse uttrykt proteiner anti-apoptotisk aktivitet analysen. Dette systemet kan verken utenlandske proteiner raskt eller brukes videre evaluering av protein anti-apoptotisk aktivitet i sf9 celler, samtidig som har potensial til å bli brukt på andre protein aktivitet analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelser
- Insekt cellekultur
- Forberede 50 mL av celle kultur medium. For å gjøre så, sammenlegge 500 µL av antibiotika (amfotericin B = 0,25 µg/mL, Penicillin = 100 enhet/mL, Streptomycin = 100 µg/mL) og 5 mL inaktivert fosterets bovin serum i serum-free celle kultur medium (uten FBS eller antibiotika).
Merk: Varme fosterets bovin serum ved 65 ° C i 30 min i et vannbad før bruk. - Opprettholde Spodoptera frugiperda (sommerfugler: Nattfly), sf9 insekt celler. Koble fra ca. 80% av cellene fra 25 cm2 celle kultur kolbe ved å riste flasken og sjekke * lys. Deretter overføre 50% av cellen suspensjon til en ny 25 cm2 celle kultur kolbe, og at cellene å feste i 15 min ved romtemperatur. Erstatt medium med 5 mL frisk celle kultur medium og vokse i en inkubator på 28 ° C. Passasjen celler hver 2 til 3 dager avhengig av cellevekst.
- Forberede 50 mL av celle kultur medium. For å gjøre så, sammenlegge 500 µL av antibiotika (amfotericin B = 0,25 µg/mL, Penicillin = 100 enhet/mL, Streptomycin = 100 µg/mL) og 5 mL inaktivert fosterets bovin serum i serum-free celle kultur medium (uten FBS eller antibiotika).
- Utarbeidelse av plasmider for cellen transfection
- Sett inn mål DNA fragmenter (f.eks Lymantria xylina MNPV (LyxyMNPV) iap3 genet og dens sletting konstruksjoner) i pDHsp/V5-hans av PCR-basert kloning metode11. Når veksten av transformert kolonier av kolonien PCR bruker PCR Master Mix (2 X) og pDhsp-F2/Op-IE2R primer sett. Bekreft plasmider sekvenser av kommersielle sekvensering tjenesten.
Merk: Tabell 1 viser primerne PCR og de tilsvarende konstruksjoner. - Kultur enkelt sekvensert bakteriell koloniene, som inneholder nevnte plasmider konstruksjoner (trinn 1.2) i 200 mL LB medium som inneholder valgt antibiotika (50 µg/mL), henholdsvis.
- Pakk ut plasmider fra den kultiverte E. coli bruke Midi plasmider Kit i henhold til produsentens instruksjoner12.
- Sett inn mål DNA fragmenter (f.eks Lymantria xylina MNPV (LyxyMNPV) iap3 genet og dens sletting konstruksjoner) i pDHsp/V5-hans av PCR-basert kloning metode11. Når veksten av transformert kolonier av kolonien PCR bruker PCR Master Mix (2 X) og pDhsp-F2/Op-IE2R primer sett. Bekreft plasmider sekvenser av kommersielle sekvensering tjenesten.
- Forberede plating medium ved å blande 1,5 mL av celle kultur medium og 8,5 mL serum-free celle kultur medium.
- Forberede Actinomycin D (ActD) celle kultur medium ved å legge til 1,5 µL av ActD lager (1 mg/mL) i 10 mL av celle kultur medium (siste konsentrasjon = 150 ng/mL). Butikken på 4 ° C.
2. protein forbigående uttrykk
- Cellen såing
- Høste sf9 cellene ved å riste kultur kolbe, velte og faller celle suspensjon til 50 mL tube og overføre 10 µL til hemocytometer ved en P10 pipette. Beregne cellen under lys mikroskop.
- Plate 3 × 105 sf9 celler i hver brønn i en 24-vel plate i 15 min ved romtemperatur. Erstatt medium med 0,5 mL plating medium.
- Hva av plasmider
- Fortynne celle transfection reagens: fortynne 8 µL av cellen transfection reagensen i 100 µL serum-free celle kultur medium og blanding av vortexing for 1 s.
- Legge til 2 µg av plasmider DNA (pDHsp70-Ac-P35/V5-hans eller pDHsp70-Ly-IAP3/V5-hans eller pDHsp70-Ly-IAP3-BIR/V5-hans eller pDHsp70-Ly-IAP3-RING/V5-hans) i 100 µL av serum-free celle kultur medium og bland ved vortexing for 1 s (figur 2).
- Kombinere utvannet plasmider DNA og utvannet celle transfection reagens (210 µL), og blande av vortexing for 1 s. Incubate i 30 min ved romtemperatur.
- Legge til 210 µL av DNA transfection reagens blanding dropwise på cellene ved en P1000 pipette. Ruge på 28 ° C for 5 h.
- Erstatte plating mediet med 0,5 mL celle kultur medium med en P1000 pipette. Seal 24-vel platen med tape og ruge cellene på 28 ° C 16 h.
- Varme sjokk transfekterte cellene: la platen i et vannbad for 42 ° C (flyter på vannoverflaten). Varme i 30 min og tilbake 24-vel platen til 28 ° C inkubator.
- Påvisning av protein uttrykk
- Etter 1 h eller 5t heten støt, vask cellene med 0,5 mL 1 x PBS bufferen kort tre ganger.
Merk: Fortynne 10 x PBS-buffer 1 x PBS bufferen ved å legge til 1 mL av 10 x PBS buffer 9 mL sterilisert ddH2O - Lyse cellene med 40 µL av 1 x SDS lasting fargestoff av pipettering opp og ned.
Merk: Fortynne 4 x SDS lasting fargestoff ved å blande 30 µL av 1 x PBS buffer og 10 µL av 4 x SDS eksempel Buffer. - Varme protein prøvene på 98 ° C i 10 min i en varme blokk Nedspinning for 1 min og lagt på is for Western blot analysen.
- Western blot analysen
Følg prosedyren for Western blot analysen fra Eslami og Lujan13. Kjøre SDS side gels14: en gel utsatt for Coomassie blå flekker (lasting kontroll for å sjekke at mengden av protein prøver lastet i hver godt er lik i mengden) og en utsatt for Western blot analysen, Eslami og Lujan13 . - Oppdage V5-merket fusion proteiner med kanin anti-V5 antistoff (5 mg/mL) (1:5000 fortynning TBST buffer arbeider konsentrasjon 1 µg/mL) og geit anti-kanin IgG-pepperrot peroxidase (HRP) konjugert (0,8 mg/mL) (1:10000 fortynning i TBST buffer for å arbeide konsentrasjon 0,08 µg/mL).
Merk: Juster prosenten for polyakrylamid 17,5% når protein molekylvekt skal < 17 kDa.
- Etter 1 h eller 5t heten støt, vask cellene med 0,5 mL 1 x PBS bufferen kort tre ganger.
3. anti-apoptotisk aktivitet analysen
- Gene-indusert celle apoptose: Gjenta nevnte fra 2.1 til 2.3. Co transfect 1 µg av pDHsp/D-rpr/flagg-hans plasmider DNA (som inneholder apoptose induser gen) med 1 µg av plasmider DNA [pDHsp70/V5-hans vektor (negativ kontroll), pDHsp70-Ac-P35/V5-hans (positiv kontroll), pDHsp70-Ly-IAP3/V5-hans, pDHsp70-Ly-IAP3-BIR/V5-hans eller pDHsp70-Ly-IAP3-RING/V5-hans, henholdsvis.]. På 5 h etter varme sjokk behandling, gjennomføre celle levedyktighet analysen (figur 2).
- Kjemisk-indusert celle apoptose: Gjenta nevnte fra 2.1 til 2.3. I trinnet 2.1.2 plate 1 x 106 sf9 celler i hver brønn i en 6-vel plate. Transfect 4 µg av plasmider DNA [pDHsp70/V5-hans vektor (negativ kontroll), pDHsp70-Ac-P35/V5-hans (positiv kontroll), pDHsp70-Ly-IAP3/V5-hans, pDHsp70-Ly-IAP3-BIR/V5-hans eller pDHsp70-Ly-IAP3-RING/V5-hans, henholdsvis.]. Behandle sf9 celler med 2 mL ActD celle kultur medium for 16 h 5 h etter heten støt, og gjennomføre celle levedyktighet analysen (figur 2).
Merk: Minimum volum å dekke en brønn av 6-vel plate er 1 mL. - Utføre over anti-apoptotisk aktivitet analysen eksperimentene, inkludert 3.1 og 3.2 i triplicates.
4. celle levedyktighet analysen
- Vask behandlet cellene ved å legge 1 mL 1 x PBS bufferen for 1 min 3 ganger. Resuspend cellene av pipettering 1 mL 1 x PBS bufferen som inneholder 0,04% trypan blå og flekker for 3 min ved romtemperatur. Overføre celle suspensjon i en 1,5 mL microtube.
Merk: Fortynne 0,4% trypan blå løsning ved å blande 9 mL 1 x PBS buffer og 1 mL 0,4% trypan blå løsning. - Overføre 10 µL trypan blå-farget celle suspensjon til hemocytometer med en P10 pipette og telle levedyktig intakt celler under lys mikroskop.
- Statistisk analyse
- Beregn de innspilte dataene og presentere som betyr ± SD for alle teller.
- Analysere data med Student tosidig t-test av Microsoft Excel. Definere statistisk signifikante data som P-verdien < 0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Full lengde og andre to truncations (BIR og RING domener) av Ly-IAP3 fra LyxyMNPV var overexpressed i sf9 celler, basert på den varme sjokk-baserte pDHsp/V5-hans /Spodoptera frugiperda celle (sf9 celle) system. Den pDHsp/V5-hans inneholdt en Drosophila varme sjokk protein promoter, som driver nedstrøms genuttrykk ved en temperatur på 42 ° C-forhold ved hjelp av mobilnettet transcriptional faktorer og oversettelse systemet (figur 1)8 ,9,11. Hele teknologiske flytskjemaet er vist i figur 2. Etter 1 h eller 5t heten støt, var cellene lysed med protein eksempel buffer og utsatt for Western blot analysen å bekrefte protein uttrykk. Resultatene indikerte at full lengde proteiner, AC-P35, Ly-IAP3, Ly-IAP3-BIR og Ly-IAP3-RING, ble oppdaget i transfekterte celler på 1t eller 5t etter varme sjokk. Videre fant protein reservoarene på 5 h etter varme støt (Figur 3). Således, ifølge data, protein funksjonelle analysen ble utført på maksimal protein uttrykk tidspunktet (5 h etter varme sjokk).
Både gen-indusert celle apoptose og kjemisk-indusert celle apoptose kan tilpasses til dette systemet for å vurdere anti-apoptotisk aktivitet (figur 2). For gen-indusert celle apoptose var to konstruksjoner (apoptose induser og mål genet plasmider konstruksjoner) co transfekterte i sf9 celler og deretter varme sjokkert over å aktivere genuttrykk. Videre ble anti-apoptotisk protein Ac-P35 (positiv kontroll) og en apoptose-induser protein (D-RPR) også uttrykt med dette varme sjokk forbigående uttrykk systemet.
Etter varme sjokk begynte både gener å bli uttrykt og oversatt til proteiner. Sammenlignet med vektor/D-RPR, positiv kontrollen (Ac-P35/D-RPR) viste høy anti-apoptotisk aktivitet, som nådde opp til 80% av levedyktighet rate. Fra celle levedyktighet resultatene av de andre konstruksjoner sammenligne forskerne anti-apoptotisk aktiviteten til hverandre eller positiv kontrollen (figur 4A). For kjemisk-indusert celle apoptose, eneste konstruere ble transfekterte i sf9 celler. Etter 5 h etter heten støt, kjemikalier (ActD) ble lagt, og cellen levedyktighet ble målt etter 16 h (figur 2). Sammenlignet med de positive kontrollen (AC-P35) eller kontrollen negative (vektor), hver konstruere viste ulike effekter på anti-apoptotisk aktivitet (figur 4B).
Figur 1: Diagram og nukleotid sekvenser av ly-iap3 relativ plasmider konstruksjoner basert på pDHsp/V5-hans vektor. Start codon (ATG) vises i fet skrift. Understreking angir begrensning enzym kutte nettsteder (HindIII i rød farge; BamHI med blått); sekvensen i grønn farge indikerer Dhsp70 promoter regionen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: flyt kontoplanen varme sjokk indusert protein uttrykk systemet (pDHsp/V5-hans/sf9 cellen systemet). Gene-indusert celle apoptose og kjemisk-indusert celle apoptose behandlinger var angitt til første trinn (co transfection med apoptose induser genet plasmider) eller senere trinn etter varme støt (kjemisk-indusert apoptose), henholdsvis for anti-apoptose analysen. Modifisert figur og legenden gjengitt med tillatelse fra Springer11. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: overuttrykte AC-P35, Ly-IAP3, Ly-IAP3-BIR og Ly-IAP3-RING bruker varme sjokk indusert protein uttrykk systemet (pDHsp/V5-hans/sf9 cellen systemet). På 1 time eller 5t innlegget heten støt, ble celle lysates høstes og utsatt for Western blot analysen og SDS/side. (A) Western blot analysen med α-V5 antistoff og (B) SDS/side med Coomassie blå som kontrollen lasting. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Levedyktighet søk for D-rpr eller Actinomycin D-indusert apoptose. (A) sf9 celler var transfekterte med pDHsp70/V5-hans vektor (vektor) og co transfekterte pDHsp70/drpr/flagg-hans med pDHsp70/V5-hans vektor pDHsp70/Ac-P35/V5-hans pDHsp70/Ly-IAP3/V5-hans, pDHsp70/Ly-IAP3-BIR/V5-hans, pDHsp70 / Ly-IAP3-RING/V5-hans, henholdsvis. Forskjellene mellom vektor og P35 og mellom vektor og Ly-IAP3 er statistisk signifikant (t-test; P < 0,05). (B) sf9 celler var transfekterte med enten pDHsp70/V5-hans vektor eller pDHsp70/Ac-P35/V5-hans pDHsp70/Ly-IAP3/V5-hans, pDHsp70/Ly-IAP3-BIR/V5-hans, pDHsp70/Ly-IAP3-RING/V5-hans, henholdsvis på 5 h etter varme sjokk, ActD ble lagt og 16 timer senere, cellen levedyktigheten ble målt. Forskjellen mellom vektor og P35 er statistisk signifikant (t-test; P < 0,05). Modifisert figur og legenden gjengitt med tillatelse fra Springer11. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| navn | Sekvenser |
| pDHsp-IAP3-HindIII-F | 5´-GGAAGCTTACCATGGACGACGAACGACGCAG-3´ |
| pDHsp-IAP3-BamHI-R | 5´-GCGGATCCCGGATGTAGGAACACCTTGA-3´ |
| iap3-BIR-BamHI-r | 5´-CGGGATCCCGGCAGATCGCCGCCGCGGA-3´ |
| iap3-RING-HindIII-F | 5´-GGAAGCTTACCGAGCTCATAAAAAGGCCCGT-3´ |
| pDhsp70-F2 | 5´-CTGCAACTACTGAAATCAACCAAG-3´ |
| Op-IE2R | 5´-GACAATACAAACTAAGATTTAGTCAG-3´ |
Tabell 1: primer sett brukes for PCR-basert kloning metode. * Understreket DNA base parene angitt begrensning enzym nettsteder. Modifisert primer listen gjengitt med tillatelse fra Springer11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Begrepet varme sjokk-baserte pDHsp/V5-hans/sf9 celle systemet ble først beskrevet av Clem et al. i 19948. Sammenligning av baculoviral genet selskapet (IE1) samt Drosophila hsp70 viste at hsp70 hadde en høyere effektivitet i mygg celler10. Videre, på grunn av den varme sjokk induksjon, tidspunktet for protein uttrykk kan kontrolleres nøyaktig etter sjokk varmebehandling. Dette systemet ble så brukt for protein funksjonelle analyser av reker og nucleopolyhedrovirus (NPV) IAP proteiner9,11. I denne protokollen, totalt 6 plasmider konstruksjoner ble brukt: tre (pDHsp/V5-hans pDHsp/Ac-p35/V5-hans og pDHsp/D-rpr/flagg-hans) ble levert av Jian-Horng Leu9, og de tre anlegg (pDHsp-iap3/V5-hans, pDHsp-iap3-BIR/V5-hans, og pDHsp-iap3-RING/V5-hans) ble konstruert av Nai et al., 201611. Det synes at dette selskapet i insekt celler arbeider mer effektivt enn baculoviral gene arrangører. Men under manipulering av denne protokollen er det flere punkter som må vurderes. Før plasmider transfection, sjekker innsetting av DNA sekvensen er viktig for genuttrykk; dermed bør det være smeltet sammen med V5 epitope å danne et V5-merket fusion protein på slutten av målet sekvensen. Videre kan ulike fusion tags (dvs., flagg epitope) også være utformet på pDHsp-baserte vektoren for i vitro protein bindende analysen. Denne filtypen prosedyren vil bidra til å undersøke nærmere protein-protein interaksjoner9. Kommersielle V5 polyklonale antistoffer kan derfor brukes for påvisning av proteiner. Hva forholdet i forskjellige insekt celler bør testes før eksperimentet. Lavere transfection priser kan resultere i ikke-detectable av protein uttrykk. derfor en pDHsp vektor inneholder et egnet rapporten gen (dvs., grønne fluoresce gen) kan være transfected i insekt celler å vurdere hva effektivitet.
Stor begrensning av denne varme sjokk uttrykk plattformen er protein uttrykk. I noen tilfeller ble en lav protein uttrykk nivå funnet. Ifølge en pilotstudie var det ingen betydelig doseavhengig effekt som oppstod ved flere plasmider DNA ble transfekterte i sf9 celler (data ikke vist). Dermed kan denne effekten være forårsaket av ubiquitin proteasome veien (UPP) eller andre ukjente mekanismer11. Forskere bør undersøke protein uttrykk i nærvær av proteasome hemmer (i.e.MG-132) å klargjøre og recolve dette problemet11. Andre begrensningen er at bærekraftig produksjon av protein forbundet med rekombinant virus ikke kan oppnås. Dermed er stabilisering og mengden protein uttrykk også bekymringer om dette systemet. En gang løpet av protein produksjon, bør derfor også testes ved Western blot analysen før funksjonelle analysen. Denne protokollen, vi sammenlignet to tidspunkt (1 og 5 h etter varme sjokk) og observert akkumulering av målet protein produksjon fra 1 time til 5 h. En økning i tiden punkter er foreslått for å finne de beste tidspunkt forholdene for protein funksjonelle analysen.
For protein funksjonelle analysen, anti-apoptotisk protein Ac-P35 (positiv kontroll) og en apoptose-induser protein (D-RPR) ble også uttrykt med dette varme sjokk forbigående uttrykk systemet. Disse to proteinene er beskrevet som funksjonell antagonister9,11,15. Derfor kunne vektor/D-RPR og Ac-P35/D-RPR tjene som en negativ kontroll og positiv kontroll, henholdsvis. Bruker denne sammenligningen, kunne anti-apoptotisk aktiviteten til målet proteiner bestemmes.
Presentert protokollen kan gi en plattform for å uttrykke utenlandske proteiner raskere eller mer kan brukes for å evaluere protein anti-apoptotisk aktivitet i insekt celler. Når forskere få foreløpige resultatene av protein-funksjonen, kan dette systemet brukes for videre studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Jian-Horng Leu av Institutt for marinbiologi, National Taiwan Ocean University for å gi 3 plasmider konstruksjoner. Denne forskningen ble støttet av Grant 106-2311-B-197-001 - fra departementet for vitenskap og teknologi (mest).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotic-Antimycotic, 100X | Gibco | 15240-062 | for insect cell culture |
| Certified Foetal Bovine Serum | Bioind | 04-001-1A | |
| Sf-900 II SFM | Thermo Fisher | 10902096 | serum-free cell culture medium |
| Sf9 cells | ATCC | CRL-1711 | |
| 25cm2 cell culture flask | Nunc, Thermo Fisher | 156340 | |
| Inverted light microscopy | WHITED | WHITED WI-400 | |
| RBC HIT Competent Cell | Bioman | RH618-J80 | Escherichia coli (DH5α) |
| L.B. Broth (Miller) | Bioman | LBL407 | |
| Agar, Bacteriological Grade | Bioman | AGR001 | |
| Zeocin | Invitrogen | ant-zn-1 | selection antibiotic |
| PCR Master Mix (2X) | ThermoFisher | K0171 | |
| Geneaid Midi Plasmid Kit (Endotoxin Free) | Geneaid | PIE25 | |
| Actinomycin D | SIGMA | A9415 | |
| Corning 50 mL centrifuge tubes | SIGMA | CLS430829-500EA | 50 mL tubes |
| Hemocytometer | Gizmo Supply Co | B-CNT-SLDE-V2 | |
| 24-Well Multidish | Nunc, Thermo Fisher | 142475 | 24-well plate |
| Cellfectin II Reagent | Thermo Fisher | 10362100 | cell transfectin reagent |
| PBS-Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4 | Thermo Fisher | AM9624 | |
| 4×SDS Loading Dye | Bioman | P1001 | |
| Immobilon-P (PVDF Blotting Membranes) | Merck Milipore | IPVH00010 | PVDF membranes |
| Mini Trans-Blot Cell system | BIO-RED | 1703930 | Blotting device |
| Ponceau S solution | SIGMA | 6226-79-5 | |
| Anti-V5 | SIGMA | V8137 | rabbit anti-V5 antibody |
| Goat anti-rabbit IgG-horseradish peroxidase (HRP) | Jackson | 111-035-003 | |
| Tween 20 | Merck | 817072 | |
| 6-Well Multidish | Nunc, Thermo Fisher | 145380 | |
| 0.4 % trypan blue solution | AMRESCO | K940-100ML | |
| P10 pipetman | Gilson | F144802 | |
| P1000 pipetman | Gilson | F123602 | |
| Tape | Symbio | PPS7 | 24 well tape ( 19 mm×36 M) |
References
- Miller, L. K. Baculoviruses as gene expression vectors. Annual Reviews in Microbiology. 42 (1), 177-199 (1988).
- Theilmann, D. A., et al. Family Baculoviridae. Virus Taxonomy: Eighth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Fauquet, C. M., Mayo, M. A., Maniloff, J., Desselberger, U., Ball, L. A. , Springer Press. New York. 1129-1185 (2005).
- Nai, Y. S., Huang, Y. F., Chen, T. H., Chiu, K. P., Wang, C. H. Determination of nucleopolyhedrovirus' taxonomic position. Biological Control of Pest and Vector Insects. Shields, V. D. C. , InTech Press. Rijeka. 169-200 (2017).
- Friesen, P. D. Regulation of baculovirus early gene expression. The Baculoviruses. Miller, L. K. , Plenum Press. New York. 141-170 (1997).
- Smith, G. E., Summers, M., Fraser, M. Production of human beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expression vector. Mol. Cell. Biol. 3 (12), 2156-2165 (1983).
- Luckow, V. A., Summers, M. D. Trends in the development of baculovirus expression vectors. Nature Biotechnol. 6 (1), 47-55 (1988).
- Jarvis, D. L., Finn, E. E. Modifying the insect cell N-glycosylation pathway with immediate early baculovirus expression vectors. Nature Biotechnol. 14 (1996), 1288-1292 (1996).
- Clem, R. J., Miller, L. K. Control of programmed cell death by the baculovirus genes p35 and iap. Mol. Cell. Biol. 14, 5212-5222 (1994).
- Leu, J. H., Kuo, Y. C., Kou, G. H., Lo, C. F. Molecular cloning and characterization of an inhibitor of apoptosis protein (IAP) from the tiger shrimp, Penaeus monodon. Dev. Comp. Immunol. 32, 121-133 (2008).
- Zhao, Y. G., Eggleston, P. E. Comparative analysis of promoters for transient gene expression in cultured mosquito cells. Insect Mol. Biol. 8 (1), 31-38 (1999).
- Nai, Y. S., Yang, Y. T., Kim, J. S., Wu, C. Y., Chen, Y. W., Wang, C. H. Baculoviral IAP2 and IAP3 encoded by Lymantria xylina multiple nucleopolyhedrovirus (LyxyMNPV) suppress insect cell apoptosis in a transient expression assay. Appl. Entomol. Zool. 51, 305-316 (2016).
- Geneaid™. Geneaid™ Midi Plasmid Kit & Geneaid™ Midi Plasmid Kit (Endotoxin Free) Instruction Manual Ver. 05.11.17. , Available from: http://www.geneaid.com/sites/default/files/PI13_0.pdf (2017).
- Eslami, A., Lujan, J. Western Blotting: Sample Preparation to Detection. J. Vis. Exp. (44), e2359 (2010).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. , Cambridge, MA. Available from: https://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page (2017).
- Vucic, D., Kaiser, W. J., Harvey, A. J., Miller, L. K. Inhibition of reaper-induced apoptosis by interaction with inhibitor of apoptosis proteins (IAPs). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 10183-10188 (1997).
