Summary
Здесь мы описываем стеноза в нижней полой вены как модель мышиных тромбоза глубоких вен. Эта модель резюмирует ограничения потока крови, один из основных триггеров венозного тромбоза в организме человека.
Abstract
Глубокие вены тромбоза (ТГВ) и ее разрушительных осложнение, эмболии легочной артерии, здоровье проблема с высокой смертностью. Механизмы формирования тромба в венах остаются неясными. Отсутствие мобильности (например, после хирургического вмешательства или дальнемагистральных рейсов) является одним из основных факторов, ведущих к ТГВ. Патофизиологические следствием отсутствия мобильности является застой крови поток в венозных клапанов. Здесь описана модель, которая имитирует такие нарушения потока как тромбоз управляя фактор. В этой модели создается ограничение (стеноз) частичного потока в нижней полой вены (IVC). Закрытие около 90% просвета IVC для 48 h приводит к развитию тромбов структурно аналогичны в организме человека. Сходство: i) большая часть объема тромб красный, то есть, состоит из красных кровяных клеток и фибрина, ii) присутствие белая часть (линии Зан), iii) не оголенный эндотелиальной монослоя, уровня iv) повышенные плазме D-димер и v) возможность предотвратить тромбоз, низкомолекулярного гепарина. Ограничения включают переменный размер тромбов и тот факт, что определенный процент мышах одичал типа (0 - 35%) не может производить тромбов. Помимо визуального наблюдения и измерения тромбов могут быть визуализированы неинвазивных технологий, таких как УЗИ, который позволяет для мониторинга динамики развития тромбов. На короткие моменты времени (1-6 h), прижизненной микроскопии могут применяться непосредственно наблюдать события (например, набор клеток к стенке сосуда) предшествующих тромбообразованию. Использование этого метода несколько команд в мире стало возможным выявить основные механизмы инициации ТГВ и выявления потенциальных целей, которые могут быть полезными для его предотвращения.
Introduction
Тромбоз глубоких вен (DVT) является развитие тромбов в глубоких венах, обычно (но не только) в ногах. В союзы с легочной эмболии (PE; места для вместе как венозной тромбоэмболии, ВТЭ) она развивается в примерно 900 000 американцев ежегодно и представляет собой серьезной проблемой здравоохранения и экономические проблемы1,2. PE, осложнением тромбоза глубоких вен, происходит, когда тромб получает отдельный от своего первоначального местонахождения и достигает легких, которые могут привести к дыхательной недостаточности и смерти. Число погибших от ВТЭ превышает смертность от СПИДа, груди Рак и трафика аварий, комбинированные3.
Основным фактором, вызывая ТГВ помимо известных причин, таких как рак или травмы, является отсутствие мобильности 4,5. Это может привести от хирургии (особенно ортопедическая), паралич, дальнемагистральных рейсов или по другим причинам. Поток крови в венах зависит мышечный насос, и поэтому результаты иммобилизация конечностей в застой крови течь в венозных клапанов, что приводит к тромбозам. Метод, описанный здесь призвана резюмировать такие крови поток искажения6,7. Ограничения частичного потока в нижней полой вены (IVC) имитирует условия созданные в человека венозных клапанов и приводит к образованию тромбов в структуре аналогичны человеческого тромбов6. Большая часть тромб красный и состоит из красных кровяных клеток, фибрина и включение тромбоцитов. Тромбов есть небольшой «белая часть», обогащенный тромбоцитов (рис. 1), которые напоминают «линии Зан», описанной в человека венозных тромбов. Обе части тромба содержат также нейтрофилы8, которые находятся среди первых клеток набираемых на месте будущего тромб6,9. Нейтрофилов в красной части высылать нейтрофилов внеклеточного ловушки (сетки), тогда как нейтрофилов в белой части, как представляется, быть лишен сеток8. Аналогично для человека ТГВ, тромбозы в мышах сопровождается повышенной плазменного уровня D-димер (рис. 2). Низкомолекулярного гепарина (Эноксапарин), используемые для профилактики тромбоза глубоких вен у больных, также предотвращает тромбозы у мышей. Важным преимуществом данного метода является отсутствие эндотелиальной денудации9, которая является характеристикой человеческого ТГВ10. Эта особенность делает IVC стеноз более клинически значимых модель ТГВ чем, к примеру, индукции тромбоза, хлорид железа, который индуцирует эндотелиальной денудации и в котором тромбов состоят преимущественно из тромбоцитов11, 12,13. Модель полного застоя в МКВ предпочитают несколько команд14,,1516. В отличие от стенозом, в котором поддерживается остаточного потока в сосуде, применение стаза полностью останавливает поток и таким образом ограничивает доступность системно управляемых веществ на сайте тромбоза. Кроме того, кажется, что лежащие в основе тромбоза, индуцированных стенозом и стазис механизмы отличаются: стеноз результатов в развитии местного воспаления (активация эндотелия, выпуска содержимого тела Weibel Паладе, вербовки иммунных клеток и тромбоцитов к стенке сосуда) вызывает «immunothrombosis»6,9,17, тогда как застой, как представляется, вызывают скорее тромбоза, в частности, на основе фактора ткани и других коагуляции и механизмы, связанные с фибринолиза18,19,20. Таким образом стеноз и стазис модели отражают слегка различные аспекты развития венозных тромбов, хотя механизмы их безусловно могут перекрываться. Электролитический модель IVC (EIM) ТГВ21,22 индуцирует тромбов, лишь частично поглощения стенке сосуда. Таким образом это удобно для тестирования воздействия системного администрирования различных препаратов на рост тромбов. Эта модель, однако, предполагает нарушение целостности стены IVC (вставки иглы) и индукции тромбоза, электрического тока, делая патофизиологические актуальность этого механизма по меньшей мере спорной.
Protocol
Все животные процедуры были одобрены животного благосостояния этические надзорный орган и UK Home Office (Великобритания, проект лицензии 40/3745). Мышей на фоне C57BL/6, 8-12 неделя старый, 19-25 г веса тела, обоих полов используются.
1. животных анестезии
- Поместите мышь в камеру всасывание и вызвать обезболивание, смесь изофлюрановая 5% 100% кислородом. Использовать скорость потока 0,5 Л/мин ждать до тех пор, пока мышь полностью останавливается и его частота дыхания становится редким.
- Удаление мыши из камеры и брить живот с электрической машинки. Удаление волос из живота так тщательно, как возможно, чтобы избежать загрязнения брюшной полости.
- Поместите указатель мыши в лежачем положении и место нос мыши в конус, связанные с системой анестезии. Уменьшите процент изофлюрановая 2-3% (точный процент может немного отличаться от животных животных). Убедитесь, что животное спит с его частота дыхания, ниже, чем обычно, но избегая задыхаясь. Если задыхаясь происходит, снизить процент изофлюрановая на 0,5%.
- Проверьте педаль рефлекс для подтверждения надлежащего анестезии и начать операцию, только если оно отрицательное. Примените мазь ветеринар на глазах для предотвращения сухости.
- Применить раствор анти бактерицидные (1% Hibitane) на живот мыши и удаление области с помощью стерильных хлопок бутон способом за исключением потенциального повторного загрязнения хирургической сайта (например, внутри вне в циркуляре моды). Повторите 3 раза.
2. применение IVC стенозом и восстановления мыши
Примечание: Все документы, а также материалы (ватные палочки, марля, солевой раствор и т.д.) нагретые области хирургии должны быть стерильными. Оператор должен скраб до операции и носить стерильные перчатки и платье во время процедуры. Микроскоп ручки должны быть обернуты в стерильных фольги.
- Дать мышей против боли обращению до операции и весь экспериментальный период. Например использование бупренорфина 0,1 мг/кг подкожно 30 мин до операции и затем каждые 12 часов, до тех пор, пока животное умерщвлены. Как тромбоз в этом методе развивается аналогично для стерильных воспаления, Избегайте использования противовоспалительные препараты как премедикации.
- Покрытие мыши с стерильных Пелерина и сделать отверстие в драпировка подвергать сайт хирургии. С помощью ножниц, надрезают вдоль брюшной срединной, 1,5 см вниз от грудины. С помощью ватные палочки неубранной кишечника к левой стороне мыши и покрыть их с стерильную марлю, смоченную в соленой теплой (37 ° C) чтобы избежать высыхания.
- Идентифицировать МКВ и его боковые ветви (там может быть 0, 1 или 2 из них) в хвостовой направлении от сайта фьюжн мкВ с левой почечной Вены. Перевязать все видимые боковые ветви с инертным Пролен швами 7-0 как близко к IVC максимально.
- Старайтесь не держать боковые ветви с щипцами напрямую, а скорее подтянуть их проведение жировой ткани, окружающие их пинцетом в одной руке и сделать туннель под филиал с щипцами в другой. Не закрывать заднюю ветви.
- Холдинг окружающих тканей с щипцами вытяните IVC вверх и влево, производство напряженность в районе малого между МКВ и аорты точно в угол между МКВ и левой почечной Вены. Принимать во внимание, что это практически невозможно отделить аорты от IVC даже 2-3 мм ниже (в хвостовой направлении).
- Использование различных движений с щипцами советы в вашей правой рукой сделать отверстие между аорты и IVC. Имейте в виду, что сделал больше движения, тем выше вероятность повреждения судна. В идеале стараются свести к минимуму количество движений до 3-5.
- Подготовьте часть 7-0 инертных Пролен шва длиной около 2 см. Поместите его в брюшной полости мыши на левой стороне оператора в непосредственной близости от мкВ.
- Вытяните мкВ вверх и влево снова. Вставьте в отверстие между аорты и IVC ваши советы право щипцы, таким образом, что подсказки появляются на другой стороне мкВ. Возьмите шовные и вытащить его обратно через отверстие (рисA).
- Сделать предварительную узел с шовный материал, но не закрывайте его. Место иглой 30G («заполнитель») согнуты, как крюк в узел и теперь закрыть его (рис. 3B).
- Удалите прокладку (рис. 3C).
- Возвращение кишечника обратно в брюшной полости с хлопок бутон и равномерно их в нем.
- Закрытие брюшины с 6-0 шовный Викрил с помощью непрерывной петли. Закройте петли первого и последнего как узел.
- Закрыть кожи с использованием металлических скоб.
- Вводить мышь с 0,5 мл теплой (37 ° C) глюкозы физиологического раствора подкожно, для восстановления баланса жидкости организма.
- Поместите курсор мыши в индивидуальной клетке в теплой (25 ° C) палата или номер и положить еду и гель воды внутри клетки. Наблюдать до тех пор, пока мышь полностью восстанавливается (как правило, около 1 ч).
Representative Results
Здесь описана модель ТГВ, индуцированный поток искажения в МКВ. Индукции стеноза в МКВ инициирует искажения и застоя кровотока и через некоторое время (в данном случае, 48 ч) приводит к развитию тромбов, структурно похож на человека ТГВ тромбов (рис. 1А). Наличие тромба внутри мкВ легко обнаружить визуально (рис. 1Б). Важных сходство между моделью и человека ТГВ является повышенный плазменного уровня D-димер (рис. 2). D-димер является продуктом деградации фибрина и свое присутствие в крови свидетельствует о том, что активный тромботических процесс продолжается.
Модель представлена шаг за шагом в рисунке 3A-C. Тщательно подвергается мкВ, сделал отверстие между МКВ и аорты и шовные (Пролен 7-0) вытягивается через отверстие под мкВ. Затем мкВ перевязано, шов через прокладку (иглой 30G, Рисунок 3D), после которого удаляется распорку. Эта процедура позволяет около 90% закрытие просвета IVC, оставив остальные 10% патентов. Это обеспечивает поток застой крови в конечном итоге приводит к тромбозам.
Рисунок 4 показывает основной недостаток модели, размер переменной тромбов. Все, что в том же эксперимента были получены эти тромбов выполняются на самцов мышей дикого типа же происхождения, возраста и аналогичные веса тела. Хотя все мышей производится тромбов (тромбоз распространенность 100%), их размер четко варьируется в широком диапазоне.
Рисунок 1: Представитель тромба после 48 ч ограничения/стенозом. (A) типичный тромба после 48 ч IVC стенозом. Обратите внимание, красный (обогащенный красных кровяных клеток) и белый (обогащенный тромбоцитов) частей. (B) IVC (слева) с или без (справа) тромб. Масштаб баров = 2 mm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Повышенный уровень плазме D-димер после применения стенозом IVC. Мышей были подвергнуты IVC стенозом. Кровь была сделана в назначенное время точках, стабилизированный 1:9 с 3,8% натрия цитрат, плазмы был подготовлен центрифугированием (2300 x g, 5 мин) и D-димер уровни были определяется набор ELISA согласно инструкциям производителя. Круги обозначают Шам действовали мышей, кресты назначить IVC стенозом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Потока ограничения/стеноза в нижней полой вены (IVC) модели тромбоза глубоких вен в мышах. Последовательными этапами модели представлены. (A) делается отверстие между МКВ и аорты и шовные вытягиван через него вокруг мкВ. (B) узел закрывается через прокладку (иглой 30 G). (C) прокладку удаляется: окончательное мнение, что хирург видит перед закрытием мыши. Желтая пунктирная линия разграничивает мкВ. LRV означает левой почечной Вены. Масштаб баров = 0.2 мм. (D) распорку (иглой 30 G). Масштаб баров = 2 mm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 . Изменчивость размер тромба.
Мышей были подвергнуты 48 h IVC стенозом. Представил тромбов получаются в том же эксперименте. Масштаб баров 2 мм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Discussion
Здесь представлен протокол IVC стеноза, который имитирует искажения потока крови, пусковым фактором для ТГВ. Стеноз мкВ индуцирует развитие тромбов в 65-100% мышей C57BL/6 в течение 48 часов и 25-50% мышей в течение 2-6 h6,8,23 (Брилл A, неопубликованные данные, 2016). Главным недостатком метода является изменчивость в тромба размер24 (рис. 4), который наблюдается после краткосрочного (6 h) и долгосрочный (48 h) IVC стенозом. Причин для такой изменчивости (учитывая, что же условия, такие как прокладка, используются анестезии и т.д.) остаются неясными, но один может предположить, что анатомические различия между мышей (например, ширина IVC, количество и расположение боковых и задней филиалы) лежат в основе этого явления. Изменчивость в размер тромба делает тромбоза распространенности (% мышей с тромбов) основные результаты. Тромбоз распространенности можно сравнить с помощью таблицы непредвиденных и точный тест Фишера. Один из экспериментов было исключение, когда снижение тромб размера с же тромбоза распространенности после инъекции ингибирования podoplanin антител наблюдалось 7.
Этот метод особенно полезен, когда изучал венозного тромбоза посвящения. Это позволяет для расследования раннего события в стенке сосуда, такие как набор клеток, в конечном итоге приводит к тромбозам. Про - или анти - thrombotic эффекты препаратов может оцениваться с использованием этой модели с преобладанием тромбоза, будучи основным индикация. Стеноз для 48 h применима раскрыть анти тромботических фенотипа, в то время как 6 h стеноз может использоваться, если ожидается протромботических фенотип. Гистологический анализ тромбов и окружающие IVC стены могут также выполняться.
Остается открытым вопрос, ли побочные филиалы должны быть лигируют или оставил патент. Одна группа показал, что перевязка боковых ветвей не увеличивает размер тромба и местоположение филиала стороне ближе, чем 1,5 мм на сайт лигирование IVC резко ухудшает тромб развития25. Закрытия боковых ветвей может побудить эндотелиального повреждения в них и также увеличить время хирургии26. В наших руках отсутствие боковой ветви закрытия существенно уменьшается распространенность тромбоза (до 10-30% после 48 ч стеноз; Брилл, неопубликованные) и поэтому мы перевязать все видимые боковых ветвей.
В идеале помёте элементы управления должны использоваться как мышей, даже на том же фоне, но из разных источников, могут иметь несколько различных тромбоза распространенности. Если эффект ТГВ себя на любых параметров (например, биохимическое) изучается, Шам эксплуатируемых животных следует использовать. Шам действовали мышей пройти такую же процедуру, но лигатура вокруг мкВ закрыт слабо и оставил там, не производя стенозом.
Наиболее частые ошибки (критический шаг) в этот протокол представляет собой попытку отделить аорты и мкВ не точно в угол между судами, но чуть ниже, что обычно приводит к кровотечение. Когда массивное кровотечение происходит, хорошее восстановление мыши становится маловероятным и рекомендуется остановить эксперимент и усыпить животных. Обычно мышей восстановить хорошо, перемещать внутри клетки и существенно не терять вес. Мы рекомендуем использовать мышь над 20 g для мужчин и женщин и держать животных (особенно мужчины) в отдельных клетках после операции до конца эксперимента, чтобы избежать боевых действий и травмы. Как сообщалось в другой (электролитические) модели ТГВ самцов мышей производят больше тромбов, чем самки27. Анализ наших данных не выявило существенной разницы между мужские и женские мышей (Брилл, неопубликованные) распространенности тромбоза. Таким образом исследователи, рекомендуется выполнять эксперименты с использованием модели стенозом мкВ на мышах обоих полов.
Перечеркивания скобы или швы могут не исключено, особенно в длинные экспериментов (в неделю и более). Таким образом мышь должна проверяться по меньшей мере два раза в день специально для целостности шва и особое внимание следует уделять появление следы крови на клетку подстилку.
Следует отметить, что, как любой другой модели животных, стеноз IVC имеет свои ограничения с точки зрения перевода на людей. К примеру мышиных МОЖП не имеют клапаны, тогда как человека ТГВ развивается внутри венозных клапанов. Кроме того люди имеют вертикальную позвоночника с мышечный насос, будучи важным механизмом ускорения кровотока в венах. В отличие от мыши имеют позвоночника горизонтально с никакой роли мышц насоса в поддержку возвращения к сердцу крови. Эти ограничения должны учитываться при переводе данных мыши для болезней человека.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Британский фонд сердца (PG/13/60/30406) и в университете Бирмингема.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 mice | Charles River | 8 - 10 weeks old, bothe genders | |
| Scissors | WPI | 15922 | |
| Scissors | WPI | 14003 | |
| Dumont 5/45 forceps | FST | 11251-35 | |
| 7-0 Prolene suture | Ethicon | W8725 | |
| 6-0 Vicryl suture | Ethicon | W9981 | |
| Cotton buds | Spar | ||
| Millswabs sterile | Millpledge veterinary | 611950 | |
| Drapes | Kruuse | 141765 | |
| Glucose Saline-Aqupharm3 | Animal Care | XVD589 | |
| Clear H20 HydroGel 98% sterile water | Clearh2o | ||
| Buprenorphine | National Veterinary Supplies | ||
| Isoflurane vaporizer | General Anaesthetic Services | ||
| IsoFlo 100% W/W inhalation vapour, liquid | National Veterinary Supplies | ||
| Sterilizer Steri350 | Inotech | ||
| Microscope Olympus SZX10 | Olympus |
References
- Heit, J. A. The epidemiology of venous thromboembolism in the community. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28 (3), 370-372 (2008).
- Huang, W., Goldberg, R. J., Anderson, F. A., Kiefe, C. I., Spencer, F. A. Secular trends in occurrence of acute venous thromboembolism: the Worcester VTE study (1985-2009). Am J Med. 127 (9), 829-839 (2014).
- House of Commons Health Care Committee. The Prevention of Venous Thromboembolism in Hospitalised patients. The House of Commons. , (2005).
- Kuipers, S., et al. Travel and venous thrombosis: a systematic review. J Intern Med. 262 (6), 615-634 (2007).
- Lopez, J. A., Chen, J.
- Brill, A., et al. von Willebrand factor-mediated platelet adhesion is critical for deep vein thrombosis in mouse models. Blood. 117 (4), 1400-1407 (2011).
- Payne, H., Ponomaryov, T., Watson, S. P., Brill, A. Mice with a deficiency in CLEC-2 are protected against deep vein thrombosis. Blood. 129 (14), 2013-2020 (2017).
- Brill, A., et al. Neutrophil extracellular traps promote deep vein thrombosis in mice. J Thromb Haemost. 10 (1), 136-144 (2012).
- von Bruhl, M. L., et al. Monocytes, neutrophils, and platelets cooperate to initiate and propagate venous thrombosis in mice in vivo. J Exp Med. 209 (4), 819-835 (2012).
- Sevitt, S. The structure and growth of valve-pocket thrombi in femoral veins. J Clin Pathol. 27 (7), 517-528 (1974).
- Witsch, T., et al. A novel hollow and perforated flexible wire allows the safe and effective local application of thrombolytic therapy in a mouse model of deep vein thrombosis. J Thromb Thrombolysis. 37 (4), 450-454 (2014).
- Shaya, S. A., et al. Comparison of the effect of dabigatran and dalteparin on thrombus stability in a murine model of venous thromboembolism. J Thromb Haemost. 14 (1), 143-152 (2016).
- Ni, H., et al. Persistence of platelet thrombus formation in arterioles of mice lacking both von Willebrand factor and fibrinogen. J Clin Invest. 106 (3), 385-392 (2000).
- Wrobleski, S. K., Farris, D. M., Diaz, J. A., Myers, D. D., Wakefield, T. W. Mouse complete stasis model of inferior vena cava thrombosis. J Vis Exp. (52), (2011).
- Diaz, J. A., Farris, D. M., Wrobleski, S. K., Myers, D. D., Wakefield, T. W. Inferior vena cava branch variations in C57BL/6 mice have an impact on thrombus size in an IVC ligation (stasis) model. J Thromb Haemost. 13 (4), 660-664 (2015).
- Siefert, S. A., et al. Enhanced venous thrombus resolution in plasminogen activator inhibitor type-2 deficient mice. J Thromb Haemost. 12 (10), 1706-1716 (2014).
- Schulz, C., Engelmann, B., Massberg, S. Crossroads of coagulation and innate immunity: the case of deep vein thrombosis. J Thromb Haemost. 11, Suppl 1 233-241 (2013).
- Day, S. M., et al. Macrovascular thrombosis is driven by tissue factor derived primarily from the blood vessel wall. Blood. 105 (1), 192-198 (2005).
- Diaz, J. A., et al. Impaired fibrinolytic system in ApoE gene-deleted mice with hyperlipidemia augments deep vein thrombosis. J Vasc Surg. 55 (3), 815-822 (2012).
- Zhou, J., May, L., Liao, P., Gross, P. L., Weitz, J. I. Inferior vena cava ligation rapidly induces tissue factor expression and venous thrombosis in rats. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29 (6), 863-869 (2009).
- Diaz, J. A., et al. Electrolytic inferior vena cava model (EIM) of venous thrombosis. J Vis Exp. (53), e2737 (2011).
- Diaz, J. A., et al. The electrolytic inferior vena cava model (EIM) to study thrombogenesis and thrombus resolution with continuous blood flow in the mouse. Thromb Haemost. 109 (6), 1158-1169 (2013).
- Brill, A., et al. Extrahepatic high-density lipoprotein receptor SR-BI and apoA-I protect against deep vein thrombosis in mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32 (8), 1841-1847 (2012).
- Diaz, J. A., et al. Critical review of mouse models of venous thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32 (3), 556-562 (2012).
- Brandt, M., et al. Deep vein thrombus formation induced by flow reduction in mice is determined by venous side branches. Clin Hemorheol Microcirc. 56 (2), 145-152 (2014).
- Geddings, J., et al. Strengths and weaknesses of a new mouse model of thrombosis induced by inferior vena cava stenosis: communication from the SSC of the ISTH. J Thromb Haemost. 12 (4), 571-573 (2014).
- Alvarado, C. M., et al. Male mice have increased thrombotic potential: sex differences in a mouse model of venous thrombosis. Thromb Res. 127 (5), 478-486 (2011).
