Summary
Ett förbättrat protokoll presenteras för mätning av transienta genuttryck från reporter konstruktioner i korn aleurone celler efter partikel beskjutning. Kombinationen av automatiserade spannmål slipning med plattan med 96 brunnar enzym analyser ger hög genomströmning för förfarandet.
Abstract
Det aleurone lagret av kornkorn är ett viktigt modellsystem för hormon-reglerat genuttryck i växter. I aleurone celler, gener krävs för grobarhet eller tidig fröplanta utveckling aktiveras av gibberellin (GA), medan gener associerade med stressreaktioner som aktiveras av abscisic syra (ABA). Mekanismerna i GA och ABA signalering kan förhöras genom att införa reporter gen konstruktioner i aleurone celler via partikel beskjutning, med resulterande övergående uttryck mäts med hjälp av enzymet analyser. Ett förbättrat protokoll rapporteras som delvis automatiserar och effektiviserar steget korn homogenisering och enzym analyserna, att låta betydligt mer dataflöde än befintliga metoder. Homogenisering av korn proverna görs med ett automatiserat vävnad Homogenisatorer och GUS (β-glukuronidas) analyser utförs med hjälp av ett system för plattan med 96 brunnar. Representativa resultat med hjälp av protokollet föreslår att fosfolipas D aktivitet kan spela en viktig roll i aktiveringen av HVA1 genuttryck av ABA, genom Transkriptionfaktorn TaABF1.
Introduction
Korn aleurone lagret är en väletablerad modellsystem för studier av hormon-reglerat genuttryck i växter1. Ett antal gener som krävs för grobarhet eller tidig fröplanta utveckling är särskilt aktiveras av gibberellin (GA), medan gener associerade med stressreaktioner som aktiveras av abscisic syra (ABA). De GA och ABA signalering vägar är sammanflätade, som ett uttryck för vissa GA-aktiverade gener hämmas av ABA, och vice versa1.
En värdefull strategi för att förstå rollen som vissa aktörer i GA/ABA signalering har varit införandet av effektor gen konstruktioner via partikel beskjutning, följt av övergående uttryck för reporter konstruktioner som tillåter den resulterande effekten på nedströms genuttryck som skall fastställas. Användning av reporter gener som GUS (β-glukuronidas) eller luciferas tillåter den känsliga och kvantitativa mätningen av genuttryck specifikt inom de celler som har fått den effektor konstruktion. Till exempel fastställs införandet av en effektor konstruktion kodning Transkriptionfaktorn TaABF15,6 att ABA-inducerad gener såsom HVA1 induceras av TaABF1, medan GA-inducerad gener som Amy32b förträngas. Partikel beskjutning som en experimentell strategi har använts av flera laboratorier för att undersöka olika aspekter av GA/ABA signalering. Sådant arbete har lett till identifiering av promotorn element viktigt för aktivering av både GA-inducerad2 och ABA-inducerad gener3och till upptäckten av protein kinaser4 och transkription faktorer5 som reglerar den uttryck av dessa gener.
De befintliga protokoll2,3,4,5,6 för partikel beskjutning med påföljande mätning av övergående genuttryck är ganska arbetskrävande, som varje uppsättning bombarderas knappt korn är homogeniserad för hand i en mortel och stöt och enzym analyserna utförs individuellt. Detta manuskript rapporterar ett förbättrat protokoll som delvis automatiserar och effektiviserar steget homogenisering och GUSEN analyser för att möjliggöra betydligt mer genomströmning, tillåter ett större antal behandlingar testas i samma experiment, eller den införandet av fler replikat för varje behandling för att få mer statistiskt robusta resultat. Representativa resultat visas för uttrycket av HVA1 och Amy32b reporter konstruktioner, regleras av Transkriptionfaktorn TaABF1 samt av GA, ABA och andra reglerande molekyler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beredning av effektor och Reporter gen konstruerar
- Bygg effektor konstruktioner som sysselsätter en konstitutiva promotorn (t.ex. majs ubiquitin, UBI) till drive uttryck från en önskad öppen läsning ram. Till exempel konstruera en plasmid som innehåller UBI::TaABF1 att driva starkt konstitutiva uttryck av TaABF15.
- Bygga reporter konstruktioner som inkluderar arrangören vars verksamhet är att mätas, placeras uppströms en öppen läsning ram, såsom GUS. Till exempel konstruera en plasmid som innehåller HVA1::GUS för att mäta uttryck från HVA1 promotorn2,5.
- Bygga en intern kontroll konstruktion (t.ex. UBI::luciferas).
- Använda en kolumn med kiseldioxid i bindande protokoll (se Tabell för material), förbereda högkvalitativa plasmid för varje krävs gen konstruktioner. Med hjälp av ultraviolett spektroskopi (se Tabell för material), noggrant mäta koncentrationen av varje plasmid förberedelse.
2. förberedelse av kornkorn för beskjutning
- Ställa in ett kalkylblad (se figur 1 för ett exempel) som anger de plasmider som kommer att bombarderas, de lämpliga hormonbehandlingar och annan relevant information för varje behandling som kommer att vara del av experimentet.
- Med hjälp av en skärbräda och en steril rakblad, avskurna embryon från korn av Himalaya korn (40 för varje behandling som ingår i experimentet). Utesluta korn som är missfärgade eller väsentligen mindre än genomsnittet.
- Placera alla embryoless kornen i en 50 mL tub. Tillsätt 40 mL vatten och rock i 10 minuter.
- Häll ut vattnet noga (för att undvika att förlora korn) och tillsätt 40 mL 10% blekmedel. Rock i 20 minuter.
- Häll ut blekmedel och tillsätt 40 mL sterilt vatten. Rock i 5 minuter. Upprepa detta sterilt vatten tvätta fyra gånger.
- Tillsätt 40 mL Imbibing lösning (20 mM natrium succinat, 20 mM kalciumklorid, pH 5.0) och 40 μl av kloramfenikol stamlösning (10 mg/mL).
- Överföra de flesta av Imbibing lösningen (med kloramfenikol) från röret till en vermikulit platta (se Tabell för material). Överför sedan kornen på ytan av det våta filterpappret i vermikulit plattan. Sprid ut kornen jämnt. Häll i tillräckligt imbibing lösningen för att hålla kornen delvis (men inte helt) nedsänkt. Placera locket ovanpå vermikulit plattan.
- Inkubera embryoless kornen vid 24 ° C i ca 48 h med lysrör. Lägg till ytterligare Imbibing lösning efter behov.
- Öppna upp en 90 mm plast petriskål och häll 20 mL av Imbibing lösningen i skålen själv och 20 mL i inverterad locket. Tillsätt 20 μL av kloramfenikol (10 mg/mL) till varje. Sterilisera två par fin punkt tången genom att doppa dem i alkohol.
- Placera några av embryoless kornen i locket på petriskål. Med hjälp av tången, ta försiktigt bort (transparent) utsäde pälsen från varje korn. Medan du tar bort utsäde pälsen från den släta sidan av spannmål, skada inte de underliggande cellerna (aleurone). Överföra skalade kornet till petriskål som innehåller Imbibing lösning.
- Efter peeling utsäde pälsen från alla kornen, återföra dem till vermikulit plattan. Inkubera skalade embryoless kornen vid 24 ° C i 16-20 timmar.
- Precis innan du använder kornen för beskjutning, ta bort yta fukt genom att skaka dem mellan filtrerpapper i en petriskål.
3. beredning av Plasmid DNA för beskjutning
- Märka en 1,5 mL tub för varje behandling som kommer att ingå i beskjutningen experimentet. Till varje rör lägga 2,5 µg av UBI::luciferas internkontroll plasmid, 2,5 µg en GUS reporter plasmid och önskad mängd (vanligen 0,025 µg 2,5 µg) en effektor plasmid. Tillsätt vatten för att få den totala volymen till 5 µL.
- Förbereda 1,6 µm guld microcarriers (se Tabell för material) följande publicerade protokoll6.
- För varje behandling, tillsätt 50 µL av svävande microcarriers i 1,5 mL röret innehållande plasmid DNA. Täck microcarriers med plasmid DNA enligt tillverkarens protokollen6.
- I det sista steget, när de plasmid-belagd microcarriers är upphängda i 48 µL 100% etanol, Pipettera 8 μL av svävande microcarriers på varje enskild fem macrocarriers och låt dem torka.
4. partikel beskjutning av Embryoless kornkorn
- Ställa in partikel beskjutning apparaten (se Tabell för material)6.
- Placera en 1550 psi sprängblecket i behålla locket och montera det på instrumentet.
- Placera en macrocarrier som innehåller önskade plasmiden kombination (tillsammans med en stoppa skärm) i församlingens microcarrier lanseringen. Infoga församlingen i den övre kortplatsen beskjutning avdelning. Ange avståndet mellan bristning skivan behåller cap och macrocarrier täcker locket på standard avstånd (6 mm), och placera stoppa skärmen stöd på (standard) mittläget, så att en macrocarrier resa sträcka på 11 mm (figur 2A).
- Ordna 8 embryoless korn i en tight radiellt mönster (med tunnare ändarna pekar inåt) på filterpapper cirkel som är tejpade ner platt i locket av en 90 mm petriskål (se figur 2B).
- Placera skålen med kornen i beskjutningen kammaren, på ett avstånd av 6 cm från skärmen stopp.
- Evakuera beskjutning kammaren till 95 kPa och sedan bombardera provet.
- Efter att ha släppt vakuumet, överföra bombarderade kornen till en märkt 60 mm petriskål innehållande 4 mL Imbibing lösning innehållande 1 mg/ml av kloramfenikol.
- Upprepa tills alla beskjutningarna har slutförts. Inkubera (på en skakande plattform vid 100 rpm) vid 24 ° C i 24 timmar.
5. utvinning av lösligt Protein från bombarderade kornen
- Med pincett, ta bort 8 bombarderade kornen från en 60 mm petriskål och torka dem torra på en pappershandduk. Dela upp kornen i två märkta 2,0 mL-rör (4 korn per rör) vardera 800 μL slipning buffert (100 mM Na fosfatbuffert pH 7,2, 5 mM DTT, 10 µg/mL leupeptin, 20% glycerol) och en 5 mm rostfri pärla. Upprepa denna process för alla bombarderade korn.
- Placera (upp till 48) 2,0 mL-rör i två rack av pärla homogenisatorn (se Tabell för material). Montera rack på homogenisatorn.
- Skaka proverna vid 30 Hz i 3 minuter.
- Ta bort Homogenisatorer rack från homogenisatorn och placera dem på isen (5 min) svalna igen proverna.
- Montera rack tillbaka på homogenisatorn - i motsatt riktning. Skaka proverna igen vid 30 Hz i 3 minuter.
- Cool rack på isen, sedan upprepa steg 5.3 5.5. Detta kommer att lägga till upp till totalt 12 minuter med skakningar.
- Centrifugera extrakt av spannmål vid 16 000 x g vid 4 ° C i 10 minuter.
- Omedelbart efter centrifugeringen, Dekantera tydlig supernatanterna i en andra uppsättning mikrocentrifugrör. Ge varje rör en snabb virvel. Förvara rören på is.
- Efter överför supernatanten, återställa stål pärlorna från pellets så de kan tvättas och återanvändas.
6. mätning av luciferas aktivitet från Grain extrakt
- För varje tub av Grynextrahering att analyseras, förbereda ett 12 x 75 mm glas provrör innehållande 200 μL av luciferas Assay blandning (45 mM Tris sulfat pH 7,7, 15 mM MgCl2, 20 mM DTT, 1,5 mM EDTA, 1 mM luciferin, 1 mM ATP).
- Tillsätt 100 μL av den första Grynextrahering till första assay röret. Vortex snabbt att blanda väl. Omedelbart placera röret till röret innehavaren av luminometern och Stäng luckan. När mätningen är klar, ta bort röret från luminometern – lämnar dörren öppen för placering av nästa röret.
- Upprepa denna process tills alla prover har mätts.
7. mätning av GUS aktivitet från Grain extrakt
- Tillsätt 200 μl analysbuffert för GUS (50 mM Na fosfatbuffert pH 7,2, 2,5 mM 4-methylumbelliferyl--D-glukuronid, 10 mM DTT, 2 mM EDTA, 10 µg/mL leupeptin, 20% metanol, 0,02% natriumazid) till varje brunn 96 väl platta.
- Plats 50 μL av varje Grynextrahering i motsvarande väl. Blanda med spetsen efter att lägga till. Försegla toppen med tätning film.
- Inkubera 96 väl plattan vid 37 ° C i mörker under 20 timmar.
- Centrifugera 96 väl plattan vid 4000 x g vid 4 ° C i 10 minuter och placera den på is.
- Tillsätt 0,2 M Na2CO3 250 μL till varje brunn svart 96 väl platta.
- Lägg till 6,25 μL av varje centrifugeras GUS assay blandning i motsvarande väl (som innehåller 0,2 M Na2CO-3) av svarten 96 väl plåt. Blanda med spetsen efter att lägga till. Inkludera brunnar med 6,25 μL 10 μM, 40 μM och 100 μM 4-methylumbelliferone som standard.
- Placera den svarta plåten till en tallrik fluorometer och Läs fluorescensen av methylumbelliferone. Ta avläsningar vid en magnetisering våglängd på 360 nm och emissionsvåglängden 460 nm. Ställa in förstärkningen av instrumentet så att en väl innehållande 6,25 μL av 40 μM 4-methylumbelliferone och 250 μL av 0,2 M Na2CO3 ger en avläsning av fluorescens 1000enheter.
8. dataanalys
- Ange värden för luciferas och GUS analyser i ett kalkylblad. Exkludera från övervägande varje prov med ett luciferas läsning av lägre än 20.000 relativa luminiscens enheter s-1, eftersom detta tyder på att genen konstruktioner inte framgångsrikt levererades till aleurone celler.
- För varje framgångsrikt bombarderade korn extrakt (som representerar en grupp av fyra embryoless korn), beräkna normaliserade GUS uttrycket från GUS och luciferas rådata som följer: normaliserade GUS = [(GUS uttryck - GUS tomt) x (2.000.000)] / (luciferas uttryck – luciferas tomt).
Obs: Detta normaliserar GUS aktiviteten till vad skulle har observerats hos en beskjutning som gav en luciferas läsning av 2.000.000. - Rapportera den relativa nivån av uttryck för en viss reporter konstruktion i närvaro av effektor konstruktioner eller hormonbehandlingar testas genom att jämföra nivån på uttryck i avsaknad av effektorer eller hormoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den teknik som beskrivs här kan användas för att införa någon test gen konstruktion i aleurone celler av kornkorn. Uttryck från test-genen kan sedan vara bekvämt mätt (figur 2). Det högre genomströmning-protokollet som beskrivs här kraftigt ökar effektiviteten av utsäde slipning och enzym analysstegen. Denna metod har använts för att bedöma transkription faktorn TaABF15,6 förmåga att aktivera uttrycket av genen ABA-inducerad HVA17. I de representativa resultat presenteras här, infördes en HVA1::GUS reporter konstruktion i aleurone celler tillsammans med en UBI::TaABF1 effektor konstruktion (figur 3A). Medan en TaABF1/HVA1 bara 0,01 var tillräcklig för att orsaka en 3-faldig induktion av HVA1 reporter genen i avsaknad av exogena ABA, högre nivåer av den TaABF1 konstruktionen resulterade i successivt större HVA1 uttryck, på ett dosberoende sätt (figur 3BC).
Detta experimentellt protokoll kan även omfatta användning av hormoner eller andra föreningar under efter beskjutning inkubationstiden att bedöma rollen av dessa molekyler i reglering av genuttryck. Tidigare arbete av andra utredare har föreslagit vikten av fosfolipas D i vissa aspekter av ABA signalering. Specifikt, har produkten av fosfolipas D aktivitet, fosfatidsyror acid, varit inblandad som intermediär i vissa svar till ABA8,9. Det faktum att 1-butanol, en hämmare av fosfolipas D (PLD), har visat sig förhindra ABA-inducerade genuttryck i aleurone celler tyder på att PLD skulle vara en integrerad del av ABA signalering i denna vävnad. Beskjutning protokollet användes för att testa om 1-butanol skulle kunna hämma antingen ABA-inducerad eller TaABF1-inducerad HVA1 uttryck. Som förväntat, kunde antingen exogena ABA eller TaABF1 starkt inducerar uttryck av den HVA1::GUS reporter konstruktion (figur 3 c). I båda fallen hämmade förekomsten av 1-butanol starkt HVA1 induktion. Detta tyder på att PLD skulle kunna spela en viktig roll i aktiveringen av HVA1 genuttryck av ABA, genom TaABF1.
Utöver sin roll i utveckling och groende korn, är ABA också kritisk för att reglera stomatala bländare i bladen. I guard celler stomata, stimuleras produktionen av fosfatidsyror acid av kväveoxid (NO), som i sin tur framkallas av väteperoxid (H2O2). För vissa svar, nr och H2O2 kan ersätta ABA9. För att avgöra om detta är också fallet i aleurone celler, användes beskjutning protokollet för att testa om den nr givare natriumnitroprussid (SNP) eller H2O2 kunde ersätta för ABA i hämmar uttrycket av den GA-inducerad Amy32b gen. Medan ABA kan starkt hämma GA-inducerad uttryck för den Amy32b::GUS reporter konstruera, varken H2O2 eller SNP orsakade någon signifikant (figur 3D). Dessa resultat, därför stöder inte en roll för NO och H2O2 i aleurone cell ABA svaren.
Figur 1 : Kalkylblad för en typisk beskjutning experiment. Beloppet för varje plasmid beredning placeras i röret för varje beskjutning indikeras. I detta experiment användes fyra skott (8 korn varje) för varje behandling för att ge totalt åtta möjliga prover (4 korn varje) för varje behandling. För att upprätthålla den samma totala DNA-koncentrationen i varje beskjutning, användes en ”dummy” effektor plasmid att ersätta UBI::TaBF1 effektor plasmiden i vissa fall. Behandling A är ett ”tomt” bombardemang att fastställa den bakgrund av GUS och luciferas aktivitet i aleurone celler. Resultaten av beskjutning experimentet beskrivs i kalkylbladet visas i figur 3B. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Diagram över protokollet. (A) Schematisk bild av enhetens beskjutning. (B) guld partiklar belagd med en reporter konstruktion transporterar arrangören ska testas, en effektor (vid behov) och en intern kontroll (UBI::luciferase) införs i korn aleurone cellerna av partikel beskjutning. Efter inkubation (typiskt för 24 h), kornen är marken och analyseras för både GUS aktivitet och luciferas aktivitet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Reglering av HVA1 och Amy32b initiativtagare av TaABF1, ABA och potentiella mediatorer av ABA signalering. (A) Reporter och effektor konstruktioner används i experiment. (B) den effektor bygga UBI::TaABF1 bombarderades Co till aleurone celler med HVA1::GUS reportern och den interna kontroll konstruktion (UBI::luciferase). Mängden UBI::TaABF1 effektor (i förhållande till den HVA1::GUS reportern) varierade från 0 till 0,1, som anges nedan i barerna. GUS och luciferas aktiviteter mättes efter 24 h inkubation. Data som visas är medel (± SE) för 6-8 biologiska replikat. (C) HVA1::GUS reportern bombarderades Co till aleurone celler med den interna kontroll konstruktion (UBI::luciferase) i närvaron eller frånvaron av den effektor bygga UBI::TaABF1. Mängden TaABF1 effektor (i förhållande till reportern) var 1,0. GUS och luciferas aktiviteter mättes efter 24 h inkubation med eller utan 20 µM ABA och 0,4% 1-butanol. (D) Amy32b::GUS reportern var samtidig bombarderade till aleurone celler med den interna kontroll konstruktion (UBI::luciferase). GUS och luciferas aktiviteter mättes efter 24 h inkubation i närvaro av 1 mM GA med eller utan 20 µM ABA, 1 mM H2O2eller 100 µM natriumnitroprussid (SNP). Värden för GUS aktivitet är i förhållande till uttrycket av Amy32b::GUS reporter i avsaknad av GA. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Införandet av effektor gen konstruerar via partikel beskjutning, följt av övergående uttryck för reporter konstruktioner är en värdefull strategi för dissekera rollen som vissa aktörer i GA/ABA signalering och i den resulterande hormon-reglerade genen uttryck.
Befintliga protokoll för att genomföra sådana experiment i korn aleurone celler2,3,4,5,6 är dock mycket arbetskrävande. Varje grupp av bombarderas knappt korn måste vara hand homogeniseras i en mortel och stöt, och de resulterande extrakt är analyseras individuellt för GUS och luciferas verksamhet. De nuvarande protokoll därför begränsa antalet separata behandlingar som kan ingå i samma experiment och begränsa antalet biologiska replikat som kan rimligen inkluderas för varje behandling. Dessa begränsningar gör det svårare att genomföra omfattande och samtidiga jämförelser mellan flera behandlingar. Sådana jämförelser kan vara särskilt svårt om skillnaden i genuttryck mellan behandlingarna är blygsam och ett relativt stort antal biologiska replikat som behövs för att fastställa statistiska betydelse.
En strömlinjeformad protokoll presenteras här som delvis automatiserar korn extrakt beredning och GUSEN analyser för att tillåta väsentligen högre genomströmning. Denna nya version av protokollet gör det möjligt att inkludera en mycket större total antal prover i ett experiment, vilket möjliggör både införandet av fler olika behandlingar per experiment och mer replikat för varje behandling. För beredning av spannmål extrakt efter beskjutning och inkubation, har vi ersatt ett i hög grad automatiserad slipning protokoll som använder en pärla Homogenisatorer som kan bearbeta 48 prover samtidigt (i ca 20 minuter). Således en enskild utredare kan förbereda lösligt protein extrakt från nästan 200 prover i mindre tid att det skulle ta ett team av fyra utredare att hand slipa bara 100 prover. Modifierade GUS analysen, utförs i plattor med 96, kräver också mycket mindre arbete som den ursprungliga protokollet som anställd enskilda tube-analyser.
Förbereda de plasmid blandningarna för beskjutning (steg 3.1), är det möjligt att använda en effektor reporter förhållandet 1.0, särskilt för preliminära tester för att avgöra om en viss effektor har någon effekt alls. Dock på grund av styrkan i promotorn majs ubiquitin (UBI), kan en stark effekt ofta observeras med mycket lägre nyckeltal, som kan ses i figur 2B och i tidigare publicerade rapporter4,5,6. Andra kritiska steg i detta protokoll inkluderar peeling av utsäde pälsen från kornkorn och användningen av noggrant definierade inställningarna i beskjutningen apparaten. Om den frö rockar inte avlägsnas helt, kommer den guld microcarriers att förhindras från att komma in de motstående aleurone cellerna. Framgångsrik leverans av den guld microcarriers in i aleurone celler är också helt beroende på den specifika typ av bristning skivan används, placera av microcarrier täcker locket, stoppa skärmen och vävnad till att bombarderas. Villkor redovisas här normalt leda till framgångsrik leverans av genen konstruktioner (se steg 8,1) att en hög andel (≥70%) bombarderade korn korn prover. Bör det förväntas att andra biologiska material skulle kräva olika villkor för optimal gen leverans.
Även om det inte beskrivs här, skulle det vara möjligt att ytterligare effektivisera förfarandet genom att utföra flash luciferas analyserna i plattor med 96. Men som ljus produktionen från luciferas måste mätas i en luminometer omedelbart efter blandning proteinet extrakt med substratet (luciferin), skulle detta kräva användning av en tallrik flash luminometer med spridare, ett instrument som är mycket mer dyrare än en enda tube luminometern.
De representativa resultat redovisas här bekräfta att en transkriptionsfaktor TaABF1 kan aktivera HVA1 uttryck i avsaknad av exogena ABA5,6. Aktivering av HVA1 av antingen TaABF1 eller exogena ABA förhindrades av den PLD hämmare av 1-butanol, vilket tyder på att produktionen av fosfatidsyror acid av PLD kan krävas för HVA1 aktivering. Dessa resultat för HVA1 reglering av TaABF1 och ABA är liknande dem som erhålls genom Zou o.a. 10 för aktivering av HVA22 genom Transkriptionfaktorn LtWRKY21 och ABA. Konstaterandet att H2O2 eller SNP inte ersätta exogena ABA i undertrycka aleurone uttryck för Amy32b, bekräftar att vissa aspekter av ABA signalering i spannmål är skild från vad som sker i stomatala guard celler. Konstaterandet att H2O2 gör inte downregulate Amy32b uttryck stämmer överens med de resultat som observerats av Ishibashi et al. 11 för amylas enzymaktivitet.
Ökad genomströmning protokollet används nu att genomföra en omfattande studie av effekterna av TaABF1 fosforylering på dess förmåga att reglera nedströms genuttryck. Som andra medlemmar i ABF kan familj av transkriptionsfaktorer vara fosforyleras på ett antal olika platser12,13,14,15,16, flera förmodade fosforylering platser på TaABF1 måste testas. Den högre genomströmning som tillåts av detta protokoll tillåter ett stort antal mutant versioner av TaABF1 (med potentiellt phosphorylatable serine och treonin rester modified) för att förhöras, alla med ett stort antal biologiska replikerar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tackar Greyson Butler och Margaret Barrett för hjälp vid utförandet av de experiment, Judy Stone för råd om spannmål homogenisering och Lynn Hannum för råd om fluorometry. Detta arbete stöddes av National Science Foundation (IOB 0443676), genom en institutionell utveckling Award (IDeA) från National Institute of General Medical Sciences av National Institutes of Health under licensnummer P20GM0103423 och genom bidrag från Colby College avdelningen för naturvetenskap.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GeneElute HP plasmid Maxiprep kit | Sigma | NA0310-1KT | |
| UV-vis spectrophotometer | Nanodrop | ND-1000 | |
| Himalaya barley grains | / | / | A variety of hulless barley (store in the dark at 4° C) |
| sodium succinate | Sigma | S2378 | Reagent for Imbibing Solution |
| calcium chloride (dihydrate) | Fisher | C79-500 | Reagent for Imbibing Solution |
| Imbibing Solution | home made | / | 20 mM sodium succinate, 20 mM calcium chloride, pH 5.0. Sterilize by autoclaving before use. |
| chloramphenicol | Sigma | C0378 | Prepare a 10 mg/mL stock solution in 70% ethanol. |
| vermiculite | Fisher | NC0430369 | Used for vermiculite plates. |
| filter paper circles (90 mm) | Whatman | 1001 090 | Used for vermiculite and for pre-bombardment grain preparation |
| Vermiculite Plates | home made | / | Add 50 mL of vermiculite to a glass petri dish. Place a 90 mm paper circle on top of the vermiculite. Autoclave. |
| forceps (fine pointed) | Fisher | 13-812-42 | Used for removing seed coat from barley grains. |
| forceps (ultra fine point) | Fisher | 12-000-122 | Used for removing seed coat from barley grains. |
| gold microcarriers (1.6 μm) | BioRad | 1652264 | |
| macrocarriers | BioRad | 1652335 | |
| calcium chloride (dihydrate) | Fisher | C79-500 | Prepare a 2.5 M stock solution and store 1 mL aliquots at -20° C. |
| spermidine | Sigma | S0266 | Prepare a 100 mM stock solution and store 500 μL aliquots at -20° C (use within 2 months). |
| rupture discs (1550 psi) | BioRad | 1652331 | |
| stopping screens | BioRad | 1652336 | |
| macrocarrier holders | BioRad | 1652322 | |
| Biolistic particle delivery system | BioRad | PDS-1000/He | |
| sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2 |
| sodium phosphate dibasic | Sigma | S9763 | Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2 |
| 1M sodium phosphate pH 7.2 | home made | / | Combine 6.9 g of sodium phosphate monobasic monohydrate with 7.1 g of sodium phosphate dibasic. Add water to 100 mL. Add NaOH to get pH 7.2. |
| dithiothrietol (DTT) | Sigma | 43819 | Dissolve in water to 1 M. Store at -20° in 1 mL aliquots. |
| leupeptin | Sigma | L2884 | Dissolve in water to 10 mg/mL. Store at -20° C. |
| glycerol | Sigma | G5516 | Prepare a 50% solution in water. |
| Grinding Buffer | home made | / | Combine 10 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 500 μL of 1 M DTT, 100 μL of 10 mg/mL leupeptin, and 40 mL of 50% glycerol. Add water to 100 mL. |
| stainlesss steel beads (5 mm) | Qiagen | 69989 | |
| 2.0 mL tubes | Eppendorf | 22363352 | This specific model of tube is recommended for use with the homogenizer. |
| bead homogenizer (TissueLyser) | Qiagen | 85210 | |
| 12mm x 75 mm glass test tubes | Fisher | ||
| luciferin | Goldbio | LUCK-100 | Prepare a 25 mM stock solution and store 1 mL aliquots at -20° C. |
| ATP | Sigma | A7699 | Prepare a 100 mM stock solution and store 250 μL aliquots at -20° C. |
| Tris base | Sigma | T1503 | Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7. |
| sulfuric acid | Sigma | 258105 | Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7. |
| 1M Tris sulfate pH 7.7 | home made | / | Dissolve 12.1 g Tris base in 100 mL of water. Adjust pH to 7.7 with sulfuric acid. |
| magnesium chloride | Sigma | M9397 | Dissolve in water to 2 M. |
| Luciferase Assay Buffer (LAB) | home made | / | Combine 3 mL of 1 M Tris sulfate pH 7.7, 500 μL of 2 M magnesium chloride, 1 mL of 1 M DTT, and 200 μL of 0.5 M EDTA. Add water to 50 mL. |
| Luciferase Assay Mixture | home made | / | Combine 15 mL of LAB, 800 μL of 25 mM luciferin, 200 μL of 100 mM ATP, and 4 mL of water. This makes enough assay mixture (20 mL) for 100 luciferase assays. |
| luminometer (Sirius) | Berthold | / | |
| 4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide (MUG) | Goldbio | MUG1 | Dissolve in DMSO to 100 mM. |
| sodium azide | Sigma | S8032 | Prepare a 2% stock solution in water and store 1 mL aliquots at -20° C. |
| 96 well plates (standard) | Fisher | 12565501 | |
| GUS assay buffer | home made | / | Combine 2.5 mL of MUG, 5 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 400 μL of 0.5 M EDTA, 1 mL of 1 M DTT, 100 μL of 10 mg/ml leupeptin, 20 mL of methanol, and 1 mL of 2% sodium azide. Add water to 100 mL. |
| TempPlate sealing film | USA Scientific | 2921-1000 | |
| 96 well plates (black) | Costar | 3916 | |
| sodium carbonate | Sigma | S7795 | Prepare a 200 mM solution in water. |
| 4-methylumbelliferone | Sigma | M1381 | Prepare a 100 μM solution in water. Freeze 1 mL aliquots at -20° C. |
| microplate fluouresence reader | Bio-Tek | FLX-800 |
References
- Chen, K., An, Y. Q. C. Transcriptional responses to gibberellin and abscisic acid in barley aleurone. J. Integ. Plant Biol. 48, 591-612 (2006).
- Lanahan, M. B., Ho, T. H. D., Rogers, S. W., Rogers, J. C. A gibberellin response complex in cereal alpha-amylase gene promoters. Plant Cell. 4, 203-211 (1992).
- Shen, Q., Zhang, P., Ho, T. H. D. Modular nature of abscisic acid (ABA) response complexes; composite promoter units that are necessary and sufficient for ABA induction of gene expression. Plant Cell. 8, 1107-1119 (1996).
- Gómez-Cadenas, A., Zentella, R., Walker-Simmons, M. K., Ho, T. H. D. Gibberellin/abscisic acid antagonism in barley aleurone cells: site of action of the protein kinase PKABA1 in relation to gibberellin signaling molecules. Plant Cell. 13, 667-679 (2001).
- Johnson, R. R., Shin, M., Shen, J. Q. The wheat PKABA1-interacting factor TaABF1 mediates both abscisic acid-suppressed and abscisic acid-induced gene expression in bombarded aleurone cells. Plant Mol. Biol. 68, 93-103 (2008).
- Harris, L. J., Martinez, S. A., Keyser, B. R., Dyer, W. E., Johnson, R. R. Functional analysis of TaABF1 during abscisic acid and gibberellin signaling in aleurone cells of cereal grains. Seed Science Res. 23, 89-98 (2013).
- Shen, Q., Casaretto, J., Zhang, P., Ho, T. H. D. Functional definition of ABA-response complexes: the promoter units necessary and sufficient for ABA induction of gene expression in barley (Hordeum vulgare). Plant Mol. Biol. 54, 111-124 (2004).
- Ritchie, S., Gilroy, S. Abscisic acid signal transduction in the barley aleurone is mediated by phospholipase D activity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 2697-2702 (1998).
- Takemiya, A., Shimazaki, K. Phosphatidic acid inhibits blue light-induced stomatal opening via inhibition of protein phosphatase 1. Plant Physiol. 153, 1555-1562 (2010).
- Zou, X., Seeman, J. R., Neuman, D., Shen, Q. J. A WRKY gene from creosote bush encodes an activator of the abscisic acid signaling pathway. J. Biol. Chem. 279, 55770-55779 (2004).
- Ishibashi, Y., et al. Reactive oxygen species are involved in gibberellin/abscisic acid signaling in barley aleurone cells. Plant Physiol. 158, 1705-1714 (2012).
- Piskurewicz, U., et al. The gibberellic acid signaling repressor RGL2 inhibits Arabidopsis seed germination by stimulating abscisic acid synthesis and ABI5 activity. Plant Cell. 20, 2729-2745 (2008).
- Hong, J. Y., et al. Phosphorylation-mediated regulation of a rice ABA responsive element binding factor. Phytochemistry. 72, 27-36 (2011).
- Lopez-Molina, L., Mongrand, S., McLachlin, D. T., Chait, B. T., Chua, N. H. ABI5 acts downstream of ABI3 to execute an ABA-dependent growth arrest during germination. Plant J. 32, 317-328 (2002).
- Zhou, X., et al. SOS2-LIKE PROTEIN KINASE5, an SNF1-RELATED PROTEIN KINASE3-Type protein kinase, is important for abscisic acid responses in Arabidopsis through phosphorylation of ABSCISIC ACID-INSESENSITIVE5. Plant Physiol. 168, 659-676 (2015).
- Zong, W., et al. Feedback regulation of ABA signaling and biosynthesis by a bZIP transcription factor targets drought-resistance-related genes. Plant Physiol. 171, 2810-2825 (2016).
