Cancer Research

Elettroforesi bidimensionale accoppiata con spettrometria di massa per un'analisi del proteoma di tessuto umano Adenoma pituitario

Published: April 2, 2018 doi: 10.3791/56739

Xianquan Zhan^1,2,3,4, Yuda Huang^1,2,3, Ying Long^1,2,3

¹Key Laboratory of Cancer Proteomics of Chinese Ministry of Health, Xiangya Hospital, Central South University, ²Hunan Engineering Laboratory for Structural Biology and Drug Design, Xiangya Hospital, Central South University, ³State Local Joint Engineering Laboratory for Anticancer Drugs, Xiangya Hospital, Central South University, ⁴The State Key Laboratory of Medical Genetics, Central South University

Summary

Qui, presentiamo un'elettroforesi bidimensionale (2DE) accoppiata alla spettrometria di massa (MS) per separare e identificare adenoma pituitario umano tessuto proteoma, che presenta un modello 2DE buona e riproducibili. Molte proteine sono osservati in ogni spot 2DE analizzando nel complesso cancro proteoma con l'uso di MS ad alta sensibilità.

Abstract

Adenoma pituitario umano (PA) è un tumore comune che si verifica nella ghiandola pituitaria umana nei sistemi di asse ipotalamo-ipofisi-mirati dell'organo e può essere classificato come PA clinicamente funzionali o non funzionali (FPA e NFPA). NFPA è difficile per diagnosi di stadio precoce e la terapia a causa di a malapena elevando gli ormoni nel sangue rispetto al FPA. Il nostro obiettivo a lungo termine consiste nell'utilizzare metodi di proteomica alla scoperta di biomarcatori affidabili per chiarimento dei meccanismi molecolari di PA e riconoscimento delle efficaci marcatori diagnostici, prognostici e bersagli terapeutici. Efficace elettroforesi bidimensionale (2DE) accoppiato con metodi di spettrometria di massa (MS) sono stati presentati qui per analizzare proteomi PA umani, compresa la preparazione dei campioni, 2D elettroforesi del gel, visualizzazione di proteine, analisi delle immagini, in gel digestione della tripsina, impronta digitale totale del peptide (PMF) e tandem (MS/MS) di spettrometria di massa. 2-dimensional gel elettroforesi matrix-assisted laser desorbimento/ionizzazione spettrometria totale PMF (2DE-MALDI MS PMF), 2DE-MALDI MS/MS e le procedure di MS/MS cromatografia 2DE-liquido (LC) sono state applicate con successo in un'analisi del proteoma NFPA. Con l'uso di uno spettrometro di massa ad alta sensibilità, molte proteine sono state identificate con il metodo 2DE-LC-MS/MS in ogni gel 2D spot in un'analisi del complesso tessuto di PA per massimizzare la copertura del proteoma umano PA.

Introduction

PA è un tumore comune che si verifica nella ghiandola pituitaria umana nei sistemi di asse ipotalamo-ipofisi-mirati dell'organo, che svolgono un ruolo importante nel sistema endocrino umano. PA comprende clinicamente funzionali e non funzionali PAs (FPA e NFPA)¹^,². NFPA è difficile nella diagnosi di stadio precoce e la terapia a causa di livelli di ormone solo leggermente elevati (ad es., LH e FSH) nel sangue rispetto al FPA, che ha aumentato significativamente i livelli di ormoni corrispondenti nel sangue³^,⁴ ^,⁵. Il chiarimento dei meccanismi molecolari e scoperta di biomarcatori efficace è importante significato clinico nella diagnosi, terapia e prognosi di NFPA. Il nostro obiettivo a lungo termine è quello di sviluppare e utilizzare metodi di proteomica per studiare NFPA per la scoperta di biomarcatori affidabili per chiarire i meccanismi molecolari e riconoscere bersagli terapeutici efficaci così come marcatori diagnostici e prognostici. 2-DE accoppiato con metodi MS sono stati ampiamente usati nel nostro programma di ricerca a lungo termine per quanto riguarda umano PA proteoma¹^,²^,⁶^,⁷, compresa l'istituzione di riferimento proteome Mappe:³^,⁸, analisi di proteine differenzialmente espresse profili⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³, varianti di ormone¹⁴ ^,¹⁵, modificazioni post-traduzionali come la fosforilazione della tirosina e¹⁴ nitrazione¹⁶^,¹⁷^,¹⁸, la variazione di proteomica di invasivo rispetto al non invadente NFPAs¹⁹e l'eterogeneità di proteomica di NFPA sottotipi¹³, che ha condotto alla scoperta di più reti via importante (disfunzione mitocondriale, disregolazione del ciclo cellulare, stress ossidativo e segnalazione MAPK anomalia di sistema) che vengono modificate in NFPA¹³^,¹⁹^,²⁰.

2DE separa le proteine secondo il loro punto isoelettrico (pI) (messa a fuoco isoelettrica, IEF) e il peso molecolare (tramite elettroforesi del gel di poliacrilammide del sodio dodecil solfato, SDS-PAGE)¹^,²^,³^, ⁴ ^, ⁵ ^, ⁶ ^, ⁷ ^, ⁸ ^, ⁹ ^, ¹⁰ ^, ¹¹ ^, ¹² ^, ¹³ ^, ¹⁴ ^, ¹⁵ ^, ¹⁶ ^, ¹⁷ ^, ¹⁸ ^, ¹⁹ ^, ²⁰ ^, ²¹ ^, ²² ^, ²³. si tratta di una tecnica di separazione classica e comuni nel campo della proteomica, poiché l'introduzione dei concetti del proteoma e la proteomica in 1995²⁴. MS è la tecnica fondamentale per scoprire l'identità delle proteine 2DE-separati, comprese strategie di PMF e MS/MS. Il molto rapido sviluppo degli strumenti di MS, soprattutto negli aspetti della sensibilità di rilevazione e risoluzione, in combinazione con il miglioramento del sistema di LC, migliora notevolmente l'identità delle proteine di basso o bassissimo abbondanza in un proteoma per massimizzare la copertura di un proteoma. Essa contesta anche i nostri concetti tradizionali che solo uno o due proteine sono presenti in un gel 2D spot in un'analisi del proteoma di tessuto umano complesso e offre l'opportunità di identificare proteine multiple in un gel 2D spot in un'analisi del complesso tessuto umano proteoma e massimizzare la copertura del proteoma NFPA.

Qui descriviamo protocolli dettagliati di 2DE-MALDI MS PMF, 2DE-MALDI MS/MS e 2DE-LC-MS/MS che sono state utilizzate con successo nell'analisi del proteoma umano NFPA. I protocolli prevedono la preparazione di campioni, prima dimensione (messa a fuoco isoelettrica, IEF), seconda dimensione (SDS-PAGE), visualizzazione delle proteine (macchiatura d'argento e la macchiatura blu di Coomassie), analisi del gel 2D, digestione della tripsina in-gel, l'immagine purificazione di peptidi triptici, PMF, MS/MS e database bruciante³^,⁸^,²⁵^,²⁶. Inoltre, questo protocollo si traduce facilmente per l'analisi di altri proteomi di tessuto umano.

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Protocol

Il presente protocollo segue le linee guida del Xiangya ospedale medica etica Comitato della Central South University, Cina. Un tappo di testa e guanti devono essere indossati per l'intera procedura sperimentale evitare la contaminazione di cheratina da pelle e capelli⁸.

1. preparazione dei campioni

Raccogliere tessuti PA (0,2 - 0,5 mg) dal reparto neurochirurgico. Immediatamente congelato in azoto liquido e poi il trasferimento a-80 ° C per la conservazione.
Aggiungere 2 mL di 0,9% NaCl in acqua distillata deionizzata (ddH₂O). Utilizzare questa soluzione leggermente lavare il sangue dalla superficie del tessuto (3x).
Nota: ddH₂O con una conducibilità di 18,2 MΩ/cm è utilizzato in tutto il protocollo. Alcune del tissuemight essere perso quando si lava via il sangue dalla superficie di un tessuto.
Aggiungere un volume (10 mL; 4 ° C) della soluzione contenente acido acetico 2m e 0,1% (v/v) β-mercaptoetanolo per ogni 0,5 - 0,6 g di tessuto, omogeneizzare (1 min, 13.000 rpm, 4 ° C, x 10) con un omogeneizzatore del tessuto, trattare con ultrasuoni l'omogeneizzato per 20 s, lyophilize e conservare a − 80 ° C.
Misurare il contenuto proteico del liofilizzato, omogeneizzati campioni usando acido bicinconinico (BCA) kit di saggi.
Nota: Quantificazione di BCA non è una quantificazione assoluta, e il risultato della misurazione sarà alterato con un tecnico diverso e l'agente sperimentale. Uno standard di campione di concentrazione fissa deve essere utilizzato per diversi esperimenti. Pertanto, l'importo finale carico di proteine per ogni gel 2D sarà essere determinato con l'argento o tinto Coomassie buono-risoluzione immagine negli esperimenti pre-progettati.
1. Aggiungere circa 300 µ g del campione omogeneizzato liofilizzato per un volume (µ l 282) di estrazione di proteine buffer (urea 8 M e 4% CHAPS), seguita da in piedi per 2 h, sonicating in un bagno d'acqua per 5 min, rotante per 1 h, sonicating nuovamente nel bagno d'acqua per 5 min , ruotando nuovamente per 1 h e centrifugazione a 15.000 x g per 20 min.
2. Preparare soluzioni standard di BSA con concentrazioni come accennato: 0, 25, 125, 250, 500, 750, 1.500, 2.000 µ g/mL con lo standard commerciale di BSA (2 mg/mL).
3. Reagente di BCA mix A e B (A:B = 50: 1) come soluzione di lavoro BCA prima dell'uso.
4. Aggiungere 0,1 mL di campione o la soluzione standard a 2 mL di soluzione di lavoro di BCA in un tubo di microfuge, seguito da miscelazione e poi incubare a 37 ° C per 30 min. Infine raffreddare a temperatura ambiente per 10 min e misura A_{562 nm} O.D. valore.
5. Calcolare la linea lineare standard (A_{562 nm} vs concentrazione BSA) per ottenere un'equazione di regressione per il calcolo del campione contenuto proteico con un valore di_562nm .
Utilizzare 150 µ g del campione liofilizzato equivalente proteico per la macchiatura d'argento, o 500 µ g di proteina per Coomassie macchiatura, per un pH di striscia 18 cm pH immobilizzati (IPG) gradiente 3-10 non lineare (NL).
Nota: La striscia di asciutto di IPG è largo 0,5 mm spessa e 3 mm con lunghezze differenti compreso 7, 11, 13, 18 e 24 cm e intervalli di pH diversi tra cui pH 4-5, 4-7, 6-9 e 3-10 in entrambi una sfumatura lineare o non lineare pH. Il buffer IPG utilizzato deve inserirsi la striscia²⁷^,²⁸.
1.6.Add 250 µ l di tampone di estrazione (7m urea, 2m tiourea, CHAPS 4% (p/v), 100 mM DTT (aggiungere prima dell'uso), 0,5% v/v pharmalyte (aggiungere prima dell'uso) e una traccia di blu di bromofenolo).
Mantenere la soluzione sotto 30 ° C, seguita da Vortex per 5 min, sonicating per 5 min e rotanti per 50 min.
110 µ l di tampone di reidratazione (7m urea, 2m tiourea, CHAPS 4% (p/v), 60 mM DTT (aggiungere prima dell'uso), buffer di IPG 0,5% v/v (aggiungere prima dell'uso) e una traccia di blu di bromofenolo). Sonicare per 5 min. Quindi ruotare il campione per 50 min, vortexare per 5 min e centrifugare per 20 min a 15.000 x g.
Raccogliere il surnatante (350 µ l) come la proteina esempio soluzione⁸.

2. bidimensionale del Gel elettroforesi

IEF (prima dimensione): eseguire il sistema di messa a fuoco isoelettrico IEF come descritto di seguito.
1. Aggiungere 350 µ l della soluzione del campione di proteina nella fessura di un titolare di striscia IPG 18 cm.
2. Mettere un 18 cm IPG strip gel-side-down sulla soluzione di campione della proteina (evitare bolle).
3. Aggiungere 3-4 mL di olio minerale per coprire la striscia IPG.
4. Assemblare il supporto IPG nel sistemacon messa a fuoco isoelettrica l'estremità appuntita sulla piastra posteriore (+) e l'estremità quadrata sulla piastra anteriore (−).
5. Reidratare il pernottamento (~ 18 h a temperatura ambiente).
6. Impostare i parametri IEF: corrente massima 30 µA per striscia, 20 ° C; 250 V, 1 h, 125 Vh, passo e tenere premuto; 1.000 V, gradiente di 1h, 500 Vh, 8.000 V, gradiente di 1h, 4.000 Vh, 8.000 V, 4 h, 32.000 Vh, passo e tenere premuto; e 500 V, 0,5 h, 250 Vh, passo e tenere premuto. Lasciar correre a un tempo totale di 7,5 h e 36.875 Vh.
7. Dopo IEF, togliere ogni strip IPG e rimuovere l'olio minerale con un tovagliolo di carta insolubile. Ora avvolgere la striscia in un foglio di pellicola trasparente e conservare a − 80 ° C.
  Nota: Il titolare di IPGstrip deve essere pulito con il titolare di IPGstrip soluzione detergente e acqua distillata.
SDS-PAGE (seconda dimensione): eseguire SDS-PAGE in un sistema di elettroforesi cellulare verticale
Nota: Ogni dimensione del gel di SDS-PAGE dovrebbe essere 255 x 190 x 1 mm.
1. Utilizzare un multi-gel caster per lanciare 12% pagina risoluzione dei gel. Per colata 12% gel pagina, attenersi alla seguente procedura.
  1. Aggiungere mL 270 di ddH₂O, 150 mL di 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8), 180 mL di soluzione madre di acrilammide/bisacrylamide 40% (p/v) (29: 1, 40% w/v acrilammide e 1,38% w/v N, N'-methylenebisacrylamide), 3 mL di 10% ammonio persolfato e 150 µ l di TEMED per rendere il gel soluzione in un becher. Mescolare delicatamente ed evitare bolle.
  2. Versate la soluzione di gel delicatamente nella camera di multicasting fino all'altezza di gel previsto (19 cm).
  3. Immediatamente aggiungere circa 3 mL ddH₂O su ogni gel di risoluzione per coprire i gel. Lasciare che il gel polimerizzare per circa 1 h.
2. Preparare 20 L di tampone di elettroforesi (25 mM Tris, glicerina di 192 mM e 0,1% SDS). Riempire il serbatoio tampone di elettroforesi separazione unità con questo buffer.
3. Togliere le strisce IPG focalizzate dal freezer ed equilibrare le strisce per 10 min da dondolo delicatamente in 4 mL di tampone di equilibrio (375 mM Tris-HCl (pH 8,8), 6 M urea, 2% (p/v) SDS, glicerolo 20% (v/v), 2% w/v DTT (aggiungere prima dell'uso) di ridurre e una traccia di blu di bromofenolo).
4. Equilibrare per 10 min da dondolo delicatamente le strisce IPG ridotte in 4 mL di tampone di equilibrio alchilazione (375 mM Tris-HCl (pH 8,8), 6 M urea, 2% (p/v) SDS, 20% (v/v) glicerolo, 2,5% w/v iodoacetamide (aggiungere prima dell'uso) e una traccia di blu di bromofenolo).
5. Durante gel equilibrio, smontare la camera di multicasting ed estrarre il vassoio del gel di risoluzione preparata. Lavare 3 volte con ddH₂O. Remove in eccesso ddH₂O con un tovagliolo di carta insolubile e messo in un gel di stander.
6. Sciacquare le strisce IPG equilibrate con il tampone di elettroforesi ed eliminare il liquido in eccesso sulla superficie IPG striscia con il tovagliolo di carta insolubile.
7. Mettere una striscia IPG sul gel di SDS-PAGE di risoluzione e lasciare che la plastica lato della strip IPG contattare la lastra di vetro più lungo e l'estremità appuntita verso sinistra.
8. Versare 3-4 mL di caldo agarosio all'1% in tampone di elettroforesi di SDS (~ 80 ° C) rapidamente per sigillare la striscia IPG sulla cima di ogni gel di SDS-PAGE e mettere il lato superiore della striscia IPG fino alla cima della lastra di vetro più breve senza bolle e poi polimerizzare per 10 min.
9. Inserire il vassoio del gel assemblato verticalmente fra plastica guarnizioni del sistema di elettroforesi verticale. Mettere la parte superiore del gel con la striscia IPG accanto il catodo (−).
10. Regolare il livello del buffer di elettroforesi per immergere il vassoio del gel.
11. Collegare e impostare l'unità di controllo e alimentazione potenza in modalità di tensione costante e correre a 200 V per circa 370 min mentre la tintura di monitoraggio.
12. Dopo l'esecuzione, estrarre il vassoio dal sistema di elettroforesi del gel e rimuovere delicatamente il gel dal vassoio del gel, evitando strappi il gel, seguito dalla colorazione delle proteine 2DE-separati.
Colorazione delle proteine 2DE-separati
1. Macchiatura d'argento
  1. Trasferire delicatamente il gel con le due mani in un vassoio contenente 250 mL di soluzione di fissaggio (metanolo al 50% (v/v) e acido acetico al 5% (v/v)) e agitare delicatamente il gel per 20 min.
  2. Scartare la soluzione e aggiungere 250 mL di metanolo al 50% (v/v) nel vassoio e agitare delicatamente per 10 min.
  3. Scartare il metanolo e aggiungere 250 mL di ddH₂O nel vassoio. Agitare delicatamente per 10 min.
  4. Agitare il gel per 1 min in 250 mL di tampone di sensibilizzazione contenente 0,02% (p/v) di tiosolfato di sodio, delicatamente e scartare il liquido.
  5. Agitare delicatamente il gel in 250 mL di ddH₂O per 1 min (ripetere ancora una volta). Eliminare il liquido dopo ogni passaggio.
  6. Agitare delicatamente il gel per 20 minuti in una soluzione di reazione 250 mL argento (nitrato d'argento 0,1% (p/v) con 200 µ l 37% (v/v) di formaldeide aggiunto prima dell'uso).
  7. Agitare delicatamente il gel in 250 mL di ddH₂O per 1 min (ripetere ancora una volta). Eliminare il liquido dopo ogni passaggio.
  8. Agitare delicatamente il gel 250 mL di soluzione di sviluppo (carbonato di sodio 3% (p/v) con 100 µ l 37% (v/v) di formaldeide aggiunto prima dell'uso) fino ad ottenere l'intensità di colorazione desiderata (comunemente 1-3 min), quindi eliminare il liquido.
  9. Agitare il gel per 10 min in 250 mL di soluzione (acido acetico 5% (v/v)) di arresto delicatamente e scartare il liquido.
  10. Agitare per 5 min in 250 mL di ddH₂O delicatamente e scartare il liquido.
  11. Tenere il gel 250 mL archiviazione soluzione del 8,8% glicerolo a 4 ° C.
2. Colorazione blu brillante di Coomassie
  1. Preparare Coomassie macchiatura soluzione sciogliendo brillante di Coomassie blue G250 0,3 g, 25 g di solfato di ammonio e acido fosforico 25 mL in ddH₂O e fino a un volume totale di 200 mL. Prima dell'uso, aggiungere metanolo 50 mL.
  2. Aggiungere 250 mL di Coomassie soluzione al gel di colorazione e agitare delicatamente a temperatura ambiente fino a clear spot proteici appaiono (~ 2-4 h). Eliminare il liquido.
  3. Aggiungere 250 mL di ddH₂O e agitare lentamente per 5 minuti, quindi due volte più. Eliminare il liquido.
  4. Aggiungere 250 mL di soluzione decolorante (etanolo al 20% (v/v)) e agitare lentamente fino a quando il colore di sfondo diventa quasi incolore ed eliminare il liquido.
  5. Sostituire con la soluzione decolorante fresca quando il vecchio si sta facendo buio e scartare il liquido.
  6. Aggiungere 250 mL di ddH₂O e agitare lentamente per 5 min. scartare il liquido.
  7. Aggiungere 250 mL di soluzione (8,8% glicerolo) di memorizzare e conservare a 4 ° C.
Analisi di immagini di elettroforesi bidimensionale del gel
1. Digitalizzare i gel colorati con uno scanner piano.
2. Il sistema di analisi di immagine 2D gel, inserire l'immagine.
3. Rilevare e quantificare ogni spot utilizzando un software di analisi di immagine 2D gel secondo il protocollo del produttore.
4. Corrispondere le macchie tra gel differenti.

3. identificazione di proteine 2DE-separati con MS

Preparazione della miscela peptide triptico
Nota: Siliconata o bassa ritenzione tubi e puntali devono essere utilizzati per evitare qualsiasi perdita di proteine o peptidi.
1. Argento-gel decolorante
  1. Asportare il gel macchie in un 1,5 mL siliconate tra tubo e lavare in 500 volte di₂O 6 ddH µ l.
  2. Mettere il gel lavato in un nuovo tubo di 1,5 mL siliconato e usa mezzi in tanti piccoli pezzi (0,5-1 mm³).
  3. Decolorare i pezzi di gel in 20 µ l della soluzione decolorante che mescola una parte di ferricianuro di potassio di 30 mM e una parte di tiosolfato di sodio di 100 mM (1:1) prima dell'uso per lasciare il colore brunastro scomparire (comunemente 1-2 min). Eliminare il liquido.
  4. Lavare i pezzi di gel con 20 µ l di ddH₂O 5 - 6 volte lasci il colore giallo a sparire. Eliminare il liquido dopo ogni passaggio.
  5. Aggiungere 20 µ l di bicarbonato di ammonio di 200 mM per i pezzi di gel e rimanere per 20 min. lavare i pezzi gel con ddH₂O (20 µ l, 1 ora). Eliminare il liquido.
  6. Disidratare i pezzi gel con 30 µ l di acetonitrile, almeno due volte per lasciare che i pezzi di gel girare un bianco opaco e vuoto-centrifuga a secco per 30 min.
2. Coomassie blu brillante del gel decolorante
  1. Tagliare macchie di gel in una provetta da 1,5 mL siliconato e lavare con 500 µ l ddH₂O almeno 3 volte.
  2. Mettere il gel lavato in un nuovo tubo siliconato 1,5 mL e usa mezzi in più pezzi (0,5-1 mm³) con un puntale.
  3. Decolorare il gel in 50-100 µ l di soluzione decolorante (1:1 v/v mix 200mm NH₄HCO₃ con acetonitrile) a seconda del volume di gel, incubare a 37 ° C in un bagno d'acqua. Ripetere e aggiungere soluzione decolorante fresco fino a quando il colore scomparirà (~ 1 h). Eliminare il liquido dopo ogni passaggio.
  4. Lavare i pezzi di gel una volta con 20 µ l di ddH₂O.
  5. Disidratare i pezzi di gel in 100 µ l acetonitrile (almeno due volte) di lasciare i pezzi gel girare un opaco bianco.
  6. Vuoto a secco per 30 min.
3. Digestione della tripsina in-gel delle proteine nei pezzi gel secchi
  1. Sciogliere 20 µ g (833 pmol) di polvere liofilizzata tripsina in 100 µ l di acido acetico 50 mM.
  2. Diluire 20 µ l di soluzione di tripsina (200 ng / µ l) a 16 ng / µ l con 230 µ l di bicarbonato di ammonio di 50 mM.
  3. Aggiungere 20-30 µ l (0,32-0,48 µ g) della soluzione diluita di tripsina in ogni provetta contenente gel secchi pezzi. Incubare per 18-20 h a 37 ° C in bagnomaria. Lasciare riposare a 4 ° C per 30 min.
  4. Centrifugare la soluzione delicatamente per 10 s. Sonicate in bagno d'acqua per 5-6 min a 30 ° C e poi Centrifugare a 12.000 x g per 2 min.
  5. Raccogliere il surnatante contenente miscela peptide triptico in un tubo siliconato 0.5 mL.
4. Purificazione della miscela di peptide triptico con C18 microcolonna.
  1. Lavare ogni colonna C18 con acetonitrile (10 µ l, 5 volte) e poi con 50% acetonitrile (10 µ l, 5 volte).
  2. Equilibrare con 0,1% trifluoro acetico acido (TFA) (10 µ l, 5 volte).
  3. Dispensare il campione su e giù attraverso la colonna C18 preparata per 15 volte.
  4. Lavare il campione 2 x con 10 µ l 0,1% TFA.
    Nota: I peptidi triptici purificati vengono mantenuti nella colonna C18.
  5. Aggiungere un volume (6 µ l) di soluzione (acido formico 85% v/v acetonitrile/0.1% v/v) in un tubo siliconato pulito 0,5 mL, pipettare questa soluzione delicatamente e lentamente su e giù attraverso perle di peptide-C18 per 10 x lavare i peptidi di legame nella soluzione, asciugare e store (− 20 ° C) per analisi MS.
Analisi MS
1. Analisi MALDI-MS PMF
  1. Aggiungere 4 µ l di 85% v/v acetonitrile/0.1% v/v TFA per sciogliere la miscela peptide triptico purificata. Carico 2 µ l dissolto peptide triptico miscela su un piatto MALDI e immediatamente aggiungere 2 µ l di soluzione di acido а-cyano-4-idrossicinnamico (CHCA) che contiene 10 g/L a 500 mL/L di acetonitrile 1 mL/L TFA, quindi asciugare all'aria.
  2. Caricare la piastra MALDI con miscela peptide triptico in uno spettrometro di massa MALDI-MS.
    Nota: I parametri dello strumento sono impostati come modalità di reflector con 20 kV accelerando la tensione, polarità positiva e 160 ns ritardo tempo di estrazione. Ogni spettro MS viene acquisito con 200 colpi di laser con una gamma di m/z 1.000 a 4.000 dopo calibrazione esterna con il peptide standard massa.
  3. Utilizzare un software di elaborazione dello spettro MS per elaborare ogni spettro MS, tra cui la correzione della linea di base, rimozione del rumore (5%) e picco deisotoping.
  4. Correggere l'elenco di massa da ogni spettro MS con la rimozione di contaminanti masse da tripsina, matrix, cheratine e altri contaminanti sconosciuti in parallelo di esperimenti di vuoto-gel.
  5. Ingresso la massa corretta riportate in una proteina PMF-based software per identificare le proteine nel database di proteina di Swiss-Prot con i seguenti parametri di ricerca, compreso il tipo di ricerca PMF, umano, di ricerca clivaggio tripsina con 1 massimo persa, fisso carbamidomethyl cisteina, metionina variabile ossidazione, monoisotopic, tolleranza di massa del peptide 50ppm, carica del peptide di stato (1 +) e segnale/rumore (S/N) 5.0.
  6. Identificare le proteine con i punteggi di proteina statisticamente significativo, e dove la proteina Punteggio =-10 × log(p), dove p è la probabilità che la partita osservata è un evento casuale.
2. Analisi MALDI-MS/MS
  1. Aggiungere 4 µ l di 50% v/v acetonitrile/0.1% v/v TFA per sciogliere la miscela peptide triptico purificata. Ogni miscela purificata peptide triptico (0,5 µ l) era macchiato su una piastra MALDI 384 pozzetti, immediatamente notato 0,5 µ l di saturi matrix CHCA in acetonitrile/0.1% 50% TFA sulla parte superiore del campione di peptide e poi essiccato all'aria.
  2. Lasciate che il MALDI-TOF-TOF MS/MS per essere gestita automaticamente, utilizzando 100 colpi di laser per acquisire uno spettro MS1, e accumulando 6 ripetuto MS1 spettri in uno spettro di MS1 sintetico.
  3. Impostare 4 ioni precursori più intenso da ogni spettro MS1 sintetico per analisi MS/MS. Uso laser 100 scatti per ogni ione precursore di acquisire uno spettro MS/MS e accumulare 4 ripetono spettri MS/MS in uno spettro di MS/MS sintetico.
  4. Utilizzare i dati sintetici di MS/MS per la ricerca di proteine attraverso una proteina basate su MS/MS, software di ricerca con parametri tra cui MS/MS Ion ricerca, database umano di Swiss-Prot, tripsina con un massimo di 1 mancato clivaggio, carbamidomethyl fisso (C), variabile Ossidazione (M), valore di massa monoisotopic, peptide massa tolleranza ± 100 ppm e frammento di massa tolleranza ± 0,7 Da.
  5. Identificare una proteina con una probabilità statisticamente significativa basata sul punteggio di Mowse e ioni Punteggio = -10 x Log(P), dove p è la probabilità che la partita osservata è un evento casuale.
3. Analisi LC-ESI-MS/MS
  1. Aggiungere 6 µ l di acido formico al 5% v/v acetonitrile/0.1% v/v per sciogliere la miscela peptide triptico purificata.
  2. Utilizzo un sistema di cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) online accoppiato con un'ionizzazione electrospray (ESI)-MS/MS di massa spettrometro con un software di gestione dati-acquistata di MS/MS per gestire l'intera operazione.
  3. Utilizzare la colonna C18 trappola (300 µm i.d. × 5 mm di lunghezza) e colonna di fase inversa C18 (75 µm i.d. x 15 cm di lunghezza) con un gradiente di separazione al 98% di solvente A (0,1% formico acido) e 2% solvente B (acido formico 0.1% a 100% acetonitrile) per 2 min , 2% al 40% solvente B per 45 min, 40% al 95% solvente B per 5 min e solvente B al 95% per 10 min (un totale di 65 min a 300 nL/min).
  4. Impostare modalità ioni positivi e sorveglianza automatica dipendente dai dati di acquisire spettri MS e MS/MS e impostare la dissociazione indotta da collisione (CID) per frammentazione di ioni.
  5. Impostare ogni scansione MS su un intervallo di massa di m/z 350-1.800 con una risoluzione di 100.000 a m/z 400. Eseguire la scansione per i 7 ioni più intenso durante la scansione di MS.
  6. Proteina basate su uso MS/MS, software di ricerca ho per cercare nel database per l'identificazione delle proteine.
    1. Selezionare il database di proteina umana.
    2. Selezionare tripsina con uno sito di clivaggio mancato permesso.
    3. Impostare la tolleranza del peptide (± 10 ppm), frammento di tolleranza dello ione (± 0.8 Da), peptide carbamidomethylation di carica (2 + 3 + e 4 +), fissato a cisteina e ossidazione variabile a metionina.
    4. Fissare i tassi di falsi scoperta (FDR) < 1% e solo peptidi con rango 1 sono accettati.
    5. Identificare la proteina con PSM≥1 (PSMs: il numero totale di sequenze peptidiche identificati (PSMs) per la proteina, comprese quelle identificate ridondante) e almeno due peptidi unici per proteina.
  7. Inoltre, è possibile utilizzare basato su MS/MS di software di proteine cercato II per cercare nel database per l'identificazione delle proteine.
    1. Convertire i file raw di MS in un file di .mgf.
    2. Selezionato il database di proteina umana (uniprothuman_20161031.fasta che contiene 70940 sequenze e 23897047 residui).
    3. Selezionare digestione della tripsina con un massimo di 2 divisioni perse.
    4. Fisso carbamidomethyl (C), variabili deamidati (NQ) e ossidazione (M), tolleranza di massa dello ione precursore 10ppm, tolleranza di massa dello ione figlia 0.8 Da e monoisotopic picco.
    5. Identificare le proteine con una soglia di significatività di 0,05 e almeno 2 dei peptidi unici.

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Representative Results

1. 2DE-MALDI MS PMF: con la procedura sperimentale descritta sopra, sono stati estratti un totale di 150 µ g proteine dai tessuti NFPA FSH-espresso (donna; 50 anni, ACTH (-), GH (-), PRL (-), (-) di LH e FSH (+) e TSH (-)) e schierati con un 18cm IPG strip (pH 3-10 NL) e un gel di SDS-PAGE di grande formato, poi visualizzati con la macchiatura d'argento. Abbiamo ottenuto un modello di gel 2DE riproducibile e buona di NFPA tessuto proteoma (Figura 1), con una media deviazione posizionale di 1,98 ± 0,75 mm in direzione IEF e 1,62 ± 0,68 mm nella direzione di SDS-PAGE e con un punti di circa 1.200 della proteina rilevato nella mappa gel 2DE che principalmente sono stati distribuiti all'interno dell'area di pH 4-8 e massa 15-150 kDa³. In totale, 337 gel macchie sono stati asportati e sottoposti a gel decolorante, digestione della tripsina, purificazione di peptidi triptici e analisi MALDI-TOF-MS PMF. Dati PMF è stati utilizzati per l'identità della proteina con ricerca di mascotte contro il database di proteina umana. Un totale di 192 proteine ridondanti (pari al 107 proteine nonredundant) sono stati identificati da 141 gel macchie fuori 337 punti analizzati gel (141/337 = 42%), e nessuna proteina è stata identificata in 196 punti (196/337 = 58%) (Tabella 1). Per quei 141 punti, sola proteina al posto è stato identificato in 121 punti, 2 proteine al posto sono stati identificati in 12 punti (punti 31, 32, 33, 41, 42, 43, 44, 68, 75, 137, 148 e 224), sono stati identificati 5 proteine al posto in 3 punti (punti 19 22 e 23), sono stati identificati 6 proteine al posto a 3 punti (punti 24, 91 e 93) e 7 proteine al posto sono state identificate in 2 punti (punti 72 e 92).

2. 2DE-MALDI MS/MS e 2DE-LC-MS/MS: utilizzando la procedura sperimentale descritta sopra, un totale di 500 µ g di proteina estratta da un tessuto NFPA invasivo (maschio, 22 anni, ACTH (-), hGH (-), PRL (+ +), (-) di LH e FSH (-)) fu vestito con un 18 cm IPG strip ( pH 3-10 NL) e un gel di SDS-PAGE di grande formato, poi visualizzati con Coomassie Blue G250 macchiatura. Questa colorazione ha prodotto un modello di gel 2DE riproducibile e di alta qualità di dilagante NFPA tessuto proteoma (Figura 2), con una media deviazione posizionale di 1,95 ± 0,85 mm in direzione IEF e 1.85 ± 0,79 mm nella direzione di SDS-PAGE e con circa spotsdetected proteina 1.100 nella mappa gel 2DE che principalmente sono stati distribuiti all'interno della gamma di pH 4-8 e massa 15-150 kDa²⁹. I 10 punti scelti a caso e l'etichetta in Figura 2 sono stati asportati e sottoposti a gel decolorante, digestione della tripsina, purificazione di peptidi triptici, seguita da analisi LC-ESI-MS/MS e MALDI-MS/MS. Ogni set di dati di MS/MS è stato utilizzato per l'identità della proteina con ricerca di mascotte contro il database di proteina umana. Per tutti i punti, una media di 1 proteina al posto è stata identificata con analisi MALDI-TOF-TOF MS/MS, mentre molte proteine (una media di 63 proteine in un singolo posto di gel, una media di 71 proteine in una piscina di 2 spot abbinati e una media di 118 proteine in una piscina di 3 matc macchie di gel Hed) in ogni punto corrispondente sono stati identificati con l'analisi LC-ESI-MS/MS (tabella 2). Qui, si deve menzionare che il sistema LC-ESI-MS/MS ha una maggiore sensibilità e risoluzione rispetto al sistema di analisi MALDI-MS/MS. Questi dati dimostrano chiaramente che ogni gel 2D spot contiene molte proteine, proteine non solo uno o due nel cancro umano complesso tessuto proteoma.

Figura 1 : Argento macchiato modello 2-DE un proteoma di FSH-espresso NFPA analizzati con IPGstrip pH 3 - 10 NL e 12% concentrazione di gel di SDS-PAGE. Le macchie marrone-rosso sono le proteine argento-macchiati, l'arancia è lo sfondo di gel argento-macchiate. Le macchie con etichettate sono state analizzate con MALDI-TOF-MS PMF. Riprodotto da Wang X, et al. (2015) ³, con il permesso da Wiley-VCH. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2 : Azzurro di Coomassie macchiati modello 2-DE un proteoma di NFPA analizzati con IPGstrip pH 3 - 10 NL e 12% concentrazione di gel di SDS-PAGE. Le macchie con etichettate sono state analizzate con MALDI-TOF-TOF MS/MS e LC-ESI-MS/MS. Punti 1 *, 2 *, 3 *, 5 * e 16 * sono stati abbinati ai corrispondenti punti 1, 2, 3, 5 e 16 e riuniti da 2 gel abbinati. Modificato da Zhan X, et al. (2018) ²⁹, con il permesso da Wiley-VCH. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Table 1
Tabella 1: Il numero di proteine che sono state identificate in ogni 2DE gel spot con analisi MALDI-TOF-MS PMF.

Table 2
Tabella 2: Numero di proteine che sono state identificate in ogni gel 2DE spot con analisi MS/MS.

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Discussion

2de, accoppiato con MS metodi tra cui 2DE-MS PMF e 2DE-MS/MS, è stato utilizzato con successo nel nostro programma a lungo termine - l'uso della proteomica per studiare la variazione di proteomica umane NFPA e rete molecolare per la delucidazione dei meccanismi molecolari e scoperta di biomarcatori efficace per NFPAs. Proteomica comparativa basata su 2DE con buona riproducibilità svolge un ruolo importante nell'identificazione di NFPA proteomica variazioni⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^, ¹⁹e 2DE accoppiato con il metodo di anticorpo dimostra suoi vantaggi nella rilevazione di un determinato post-traduzionali e varianti di una data proteina, ad esempio il rilevamento di tirosina nitrazione¹⁶^,¹⁷ ^, ¹⁸ e GH varianti¹⁴^,¹⁵.

Tuttavia, 2DE accoppiato con un metodo di MS è considerata una tecnica di lavoro ad alta intensità con difficoltà nell'analisi di abbondanza bassa proteine, proteine idrofobiche, proteine estremamente base o acide e proteine massa estremamente bassa o alta². Per esempio, estremamente bassa massa (< 10 kDa) o massa elevata (> 150 kDa) proteine ed estremamente spartano (pI > 7,5 o 8) o acide (pI < 3.5 o 4) proteine non vengono facilmente rilevate da 2DE con un 18 cm IPG striscia di pH 3-10 NL³. Con il rapido sviluppo di metodi di separazione gel-libero, tra cui la cromatografia liquida bidimensionale (2D-LC) accoppiata con isotopo stabile di etichettatura come iTRAQ e TMT l'ultimo dieci anni²³, mi sembra che 2-DE è gradualmente ritirato dal suo lo stato centrale in proteomica di ricerca nell'analisi del proteoma tessuto complesso perché 2D-LC accoppiato con marcatura a isotopi stabili e MS/MS Metodi efficacemente superare gli inconvenienti di metodi basati su 2DE.

Recenti studi hanno trovato che, con l'uso della spettrometria di massa ad alta sensibilità, ad esempio una LC-ESI-MS/MS (la sua sensibilità è nell'intervallo di 1-10 amol) nell'identificazione di proteine 2DE-separati, le nuove caratteristiche del metodo 2-DE sono state scoperte che mostrano che un 2D gel spot contiene molte proteine (tabella 2). Questo è in contrasto con il concetto tradizionale di solo uno o due proteine al posto, come testimoniano il database di 2DPAGE del mondo (World-2DPAGE portal: http://world-2dpage.expasy.org/portal). Questo dimostra chiaramente che la velocità effettiva di 2-DE nell'identità di proteine in un complesso proteoma umano è molto maggiore di quello precedentemente assunto, vale a dire che c'erano solo uno o due proteine in un posto di gel 2D. Questa tecnica offre la promessa di uso per 2DE nel campo della proteomica. Uno 2DE può separare oltre un migliaio di diecimila punti³^,⁸^,²² nell'analisi del proteoma umano complesso così 2DE è una tecnica di separazione più dettagliata per semplificare al massimo la complessità del proteoma campioni prima dell'analisi LC-MS/MS, relativo al sistema di 2D-LC, che il primo-dimensionale LC genera comunemente da 18 a 30 frazioni prima analisi LC-MS/MS. Di conseguenza, 2DE in combinazione con spettrometria di massa ad alta sensibilità consente di stabilire la mappa di riferimento informazioni tremenda per il proteoma umano complesso, soprattutto per quelli bassa o bassissima proteine in abbondanza. Inoltre, 2-DE in combinazione con isotopo stabile etichettatura (come iTRAQ, TMT e SILAC) e spettrometria di massa ad alta sensibilità può essere utilizzati per quantificare le variazioni di proteomica su larga scala tra le diverse condizioni. Inoltre, 2DE accoppiato con marcatura a isotopi stabili e spettrometria di massa ad alta sensibilità ha vantaggi assoluti in larga scala rilevazione e quantificazione della proteina PTMs, varianti della proteina, speciazione di proteina e proteina specie. Questi vantaggi avrà 2DE rivitalizzato nel campo della proteomica.

Inoltre, i protocolli presenti per l'analisi del proteoma umano di tessuto PA descritto qui facilmente traducibili per studiare altri proteomi di malattia umana.

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Disclosures

Gli autori dichiarano che non esiste alcun conflitto di interessi.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato supportato dalla Fondazione nazionale di scienze naturali della Cina (Grant n. 81572278 e 81272798 a XZ), le sovvenzioni da Cina "863" Plan Project (Grant No. 2014AA020610-1 a XZ), i fondi di ospedale Xiangya per introduzione di talento (a XZ) e il Hunan Fondazione di scienza naturale provinciale della Cina (Grant No. 14JJ7008 a XZ). Gli autori riconoscono anche il contributo scientifico del Dr. Dominic M. Desiderio in Health Science Center della University of Tennessee. X.Z. continuamente sviluppato e utilizzato metodi 2DE-MS per analizzare il proteoma di adenoma pituitario a partire dal 2001, concepito il concetto per il manoscritto presente, ha scritto e rivisto il manoscritto, coordinato i lavori pertinenti ed è stato responsabile per la sostegno finanziario e il lavoro corrispondente. Y.L. partecipato revisione del manoscritto. Y.H ha partecipato insieme di riferimenti e revisione del manoscritto. Tutti gli autori approvato il manoscritto finale.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ettan IPGphor 3	GE Healthcare		isoelectric focusing system.
Ettan DALTsix multigel caster	Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA
Ettan DALT II System	Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA		The vertical electrophoresis system
Ettan IPGphor strip holder	Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA
Ettan DALTsix multigel caster	Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA		Multigel caster
Voyager DE STR MALDI-TOF MS	ABI, Foster City,CA		MALDI-MS PMF
MALDI-TOF-TOF	Autoflex III, Bruker		MALDI-MS/MS mass spectrometer
LTQ-OrbiTrap Velos Pro ETD	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA		ESI-MS/MS mass spectrometer
EASY-nano LC system	Proxeon Biosystems, Odense, Denmark		High performance liquid chromatography system
PepMap C18 trap column	300 μm i.d. × 5 mm length; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA
RP C18 column	75 μm i.d., 15 cm length; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA
KimWipe	Kimvipe		Insoluble paper towel
Watter	Made by PURELAB flex instrument
Polytron Model P710/35 homogenizer	Brinkmann Instruments, Westbury, NY
PDQuest	Bio-Rad, Hercules, CA		2D gel image analysis software
SEQUEST	Thermo Proteome Discoverer 1.3 (version No. 1.3.0.339)
DataExplore (ver. 4.0.0.0) software			MS spectrum-processing software
Mascot software			PMF-based protein searching software
Mascot software			MS/MS-based protein searching software
Proteome Discoverer software v.1.3 beta	Thermo Scientific
Xcalibur software v.2.1			MS/MS data-acquired management software
Uniprot version 201410.1_HUMAN.fasta			Human protein database
SEQUEST (version No. 1.3.0.339)			MS/MS-based protein searching software I
MASCOT (version 2.3.02)			MS/MS-based protein searching software II
C18 ZipTip microcolumn	Millipore
PeptideMass Standard kit	Perspective Biosystems
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	23227
2-D Quant Kit	GE Healthcare	80-6483-56
BIS-ACRYLAMIDE	AMRESCO	0172
ACRYLAMIDE	AMRESCO	0341
DTT	Sigma-Aldrich	D0632
Thiourea	Sigma-Aldrich	T8656
Urea	VETEC	V900119
SDS	AMRESCO	0227
CHAPS	AMRESCO	0465
TEMED	AMRESCO	M146
Ammonium Persulfate	AMRESCO	M133
Trypsin	Promega, Madison, WI, USA	V5111
IPG buffer pH 3-10, NL	GE Healthcare	17-6000-87
Immobiline Dry Strip pH 3-10NL,18cm	GE Healthcare	17-1235-01

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Zhan, X., Wang, X., Cheng, T. Human pituitary adenoma proteomics: new progresses and perspectives. Front. Endocrinol. 7 (54), (2016).
Zhan, X., Desiderio, D. M. Comparative proteomics analysis of human pituitary adenomas: Current status and future perspectives. Mass Spectrom. Rev. 24 (6), 783-813 (2005).
Wang, X., Guo, T., Peng, F., Long, Y., Mu, Y., Yang, H., Ye, N., Li, X., Zhan, X. Proteomic and functional profiles of a follicle-stimulating hormone-positive human nonfunctional pituitary adenoma. Electrophoresis. 36 (11-12), 1289-1304 (2015).
Karppinen, A., Kivipelto, L., Vehkavaara, S., Ritvonen, E., Tikkanen, E., Kivisaari, R., Hernesniemi, J., Setälä, K., Schalin-Jäntti, C., Niemelä, M. Transition from microscopic to endoscopic transsphenoidal surgery for nonfunctional pituitary adenomas. World Neurosurg. 84 (1), 48-57 (2015).
Liu, X., Ma, S., Dai, C., Cai, F., Yao, Y., Yang, Y., Feng, M., Deng, K., Li, G., Ma, W., Xin, B., Lian, W., Xiang, G., Zhang, B., Wang, R. Antiproliferative, antiinvasive, and proapoptotic activity of folate receptor α-targeted liposomal doxorubicin in nonfunctional pituitary adenoma cells. Endocrinol. 154 (4), 1414-1423 (2013).
Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. Pituitary adenoma nitroproteomics: current status and perspectives. Oxid. Med. Cell. Longev. 2013, 580710 (2013).
Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. Mass spectrometry analysis of nitrotyrosine-containing proteins. Mass Spectrom. Rev. 34 (4), 423-448 (2015).
Zhan, X., Desiderio, D. M. A reference map of a pituitary adenoma proteome. Proteomics. 3 (5), 699-713 (2003).
Desiderio, D. M., Zhan, X. A study of the human pituitary proteome: The characterization of differentially expressed proteins in an adenoma compared to a control. Cell. Mol. Biol. 49 (5), 689-712 (2003).
Zhan, X., Desiderio, D. M. Heterogeneity analysis of the human pituitary proteome. Clin. Chem. 49 (10), 1740-1751 (2003).
Zhan, X., Evans, C. O., Oyesiku, N. M., Desiderio, D. M. Proteomics and tanscriptomics analyses of secretagogin down-regulation in human non-functional pituitary adenomas. Pituitary. 6 (4), 189-202 (2003).
Moreno, C. S., Evans, C. O., Zhan, X., Okor, M., Desiderio, D. M., Oyesiku, N. M. Novel molecular signaling in human clinically non-functional pituitary adenomas identified by gene expression profiling and proetomic analyses. Cancer Res. 65 (22), 10214-10222 (2005).
Zhan, X., Wang, X., Long, Y., Desiderio, D. M. Heterogeneity analysis of the proteomes in clinically nonfunctional pituitary adenomas. BMC Med. Genomics. 7, (2014).
Zhan, X., Giorgianni, F., Desiderio, D. M. Proteomics analysis of growth hormone isoforms in the human pituitary. Proteomics. 5 (5), 1228-1241 (2005).
Kohler, M., Thomas, A., Püschel, K., Schänzer, W., Thevis, M. Identification of human pituitary growth hormone variants by mass spectrometry. J. Proteome Res. 8 (2), 1071-1076 (2009).
Zhan, X., Desiderio, D. M. The human pituitary nitroproteome: detection of nitrotyrosyl-proteins with two-dimensional Western blotting, and amino acid sequence determination with mass spectrometry. Biochem. Biophys. Res. Commun. 325 (4), 1180-1186 (2004).
Zhan, X., Desiderio, D. M. Nitroproteins from a human pituitary adenoma tissue discovered with a nitrotyrosine affinity column and tandem mass spectrometry. Anal. Biochem. 354 (2), 279-289 (2006).
Zhan, X., Desiderio, D. M. Linear ion-trap mass spectrometric characterization of human pituitary nitrotyrosine-containing proteins. Int. J. Mass Spectrom. 259, 96-104 (2007).
Zhan, X., Desiderio, D. M., Wang, X., Zhan, X., Guo, T., Li, M., Peng, F., Chen, X., Yang, H., Zhang, P., Li, X., Chen, Z. Identification of the proteomic variations of invasive relative to noninvasive nonfunctional pituitary adenomas. Electrophoresis. 35 (15), 2184-2194 (2014).
Zhan, X., Desiderio, D. M. Signal pathway networks mined from human pituitary adenoma proteomics data. BMC Med. Genomics. 3, 13 (2010).
O’Farrell, P. H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J. Biol. Chem. 250 (10), 4007-4021 (1975).
Klose, J., Kobalz, U. Two-dimensional electrophoresis of proteins: an updated protocol and implications for a functional analysis of the genome. Electrophoresis. 16 (6), 1034-1059 (1995).
Zhan, X. Current status of two-dimensional gel electrophoresis and multi-dimensional liquid chromatography as proteomic separation techniques. Ann. Chromatogr. Sep. Tech. 1 (2), 1009 (2015).
Wasinger, V. C., Cordwell, S. J., Cerpa-Poljak, A., Yan, J. X., Gooley, A. A., Wilkins, M. R., Duncan, M. W., Harris, R., Williams, K. L., Humphery-Smith, I. Progress with gene-product mapping of the Mollicutes: Mycoplasma genitalium. Electrophoresis. 16, 1090-1094 (1995).
Zhan, X., Desiderio, D. M. Differences in the spatial and quantitative reproducibility between two second-dimensional gel electrophoresis. Electrophoresis. 24 (11), 1834-1846 (2003).
Zhan, X., Desiderio, D. M. Spot volume vs. amount of protein loaded onto a gel. A detailed, statistical comparison of two gel electrophoresis systems. Electrophoresis. 24 (11), 1818-1833 (2003).
Zhan, X. Two-dimensional electrophoresis. Experimental Protocols for Medical Molecular Biology in Chinese and English. Zheng, W. , Peking Union Medical College Press. Beijing. 93-108 (2005).
Electrophoresis in Practice: A guide to Methods and Applications of DNA and Protein Separations. Westermeier, R. , VCH Wiley. Weinheim. (1997).
Zhan, X., Yang, H., Peng, F., Li, J., Mu, Y., Long, Y., Cheng, T., Huang, Y., Li, Z., Lu, M., Li, N., Li, M., Liu, J., Jungblut, P. R. How many proteins can be identified in a 2DE gel spot within an analysis of a complex human cancer tissue proteome? Electrophoresis. , (2018).

Cancer Research

Elettroforesi bidimensionale accoppiata con spettrometria di massa per un'analisi del proteoma di tessuto umano Adenoma pituitario

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

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