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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

ひと下垂体腺腫の組織のプロテオームの分析のための質量分析法と相まって二次元ゲル電気泳動

Published: April 2, 2018 doi: 10.3791/56739
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,2,3, 1,2,3
1Key Laboratory of Cancer Proteomics of Chinese Ministry of Health, Xiangya Hospital, Central South University, 2Hunan Engineering Laboratory for Structural Biology and Drug Design, Xiangya Hospital, Central South University, 3State Local Joint Engineering Laboratory for Anticancer Drugs, Xiangya Hospital, Central South University, 4The State Key Laboratory of Medical Genetics, Central South University

Summary

二次元ゲル電気泳動 (2DE) 質量分析 (MS) を人間の下垂体腺腫組織プロテオーム良いと再現可能な 2DE パターンを提示を区別して結合を紹介します。高感度 MS を使って複雑ながんのプロテオームを解析するとき、多くの蛋白質は各 2DE スポットで観察されます。

Abstract

ひと下垂体腺腫 (PA) は、視床下部下垂体標的臓器軸システムのひと下垂体腺で発生し、臨床的に機能または機能しない PA (FPA と NFPA) として分類されるかもしれない一般的な腫瘍です。NFPA は、初期段階の診断とやっと FPA と比較して血液中のホルモンを高めるための治療困難です。私たちの長期的な目標は、PA の分子メカニズムの解明と効果的な診断、予後マーカーや治療標的の認識のための信頼性の高いバイオ マーカーを発見するプロテオミクス メソッドを使用します。効果的な二次元ゲル電気泳動 (2DE) 質量分析 (MS) 法と相まってがここで示されたサンプル、第 2 ゲルの電気泳動、タンパク質の可視化、画像解析、ゲルでの準備を含む人間の PA プロテオームの分析トリプシンの消化力、ペプチドマスフィンガー プリント (PMF)、タンデム質量分析 (MS/MS)2 二次元のゲルの電気泳動マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法 PMF (2DE MALDI MS PMF) 2DE MALDI MS/MS、および 2DE 液体クロマトグラフィー (LC) MS/MS プロシージャを正常に NFPA プロテオームの解析に適用されています。高感度質量分析計を用いる多くの蛋白質は 2DE-LC ・ MS/MS メソッドを各第 2 ゲル人間 PA プロテオームのカバレッジを最大化する複雑な PA 組織の分析にスポットしました。

Introduction

PA は、ひと下垂体腺で人間の内分泌系で重要な役割を果たす器官の視床下部-下垂体-ターゲット軸システムで発生する一般的な腫瘍です。PA には、臨床的に機能的および非機能的 (FPA と NFPA) PAs1,2が含まれています。NFPA はだけ小高いホルモン レベル (例えばLH と FSH) FPA 血3,4 に対応するホルモンのレベルを増加している大幅に比較して血液中のため初期段階の診断と治療における困難 ,5。分子機構の解明と効果的なバイオ マーカーの発見、診断、治療、および NFPA の予後に重要な臨床的意義。私たちの長期的な目標は、開発しプロテオーム メソッドを使用して、その分子メカニズムを明らかにする信頼性の高いバイオ マーカーの発見のための NFPA の研究し、効果的な治療上のターゲットとして診断と予後マーカーを認識することです。MS 方式と相まって 2 デは人間 PA プロテオーム1,2,6、7、プロテオーム参照の設立を含むに関する長期研究プログラムで広く使用されています。3、8、発現タンパク質プロファイル9,10、11,12,13, ホルモンの亜種14 の分析マップします。 ,15、リン酸化チロシンと14ニトロ化16,17,など18のポスト翻訳の修正、関連する侵襲のプロテオーム変化非侵襲的 NFPAs19、および NFPA サブタイプ13、複数の重要な経路ネットワーク (ミトコンドリア、細胞周期調節不全、酸化ストレス、MAPK シグナルの発見につながったのプロテオームの不均一性システム異常) NFPA13,,1920に変更します。

2DE は、等電点 (pI) (等電集中、IEF) と分子量 (ナトリウム dodecyl 硫酸塩ポリアクリルアミドゲル電気泳動、SDS ページ) 経由で蛋白質を分ける1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23. プロテオームと 1995年24プロテオ ミックスの概念の導入以来、プロテオミクスの分野で一般的で古典的な分離技術は、これ。MS は PMF と MS/MS の戦略を含む、2DE で区切られた蛋白質のアイデンティティを見つけることの重要な技法です。検出感度と LC システムの改善との組み合わせで、解像度の面で特に、MS の器械の非常に急速な開発向上を最大化するプロテオームの低または非常に低の豊富な蛋白質のアイデンティティ、プロテオームの報道。それはまた従来の概念を課題に 1 つまたは 2 つのタンパク質が第 2 ゲルの複雑な人体組織のプロテオームの分析にスポットに存在し第 2 ゲルの複雑な人体組織の分析にスポットで複数の蛋白質を識別する機会を提供しますプロテオームと NFPA プロテオームのカバレッジを最大化します。

ここで述べる 2DE MALDI MS PMF、2DE MALDI MS の詳しいプロトコル/MS と 2DE-クロマトグラフィー-タンデム質量人間 NFPA プロテオーム解析で正常に使用されています。プロトコルの準備は、サンプルの最初の寸法 (等電集中、IEF)、2 番目の次元 (SDS-PAGE)、タンパク質 (銀製の汚損とクマシー ブルー染色) の可視化、画像 2次元ゲル、ゲルのトリプシンの消化力の解析3,8,25,26の焼け付くようなデータベース ・ MS/MS、PMF 由来ペプチドの精製。また、このプロトコルは、他の人間の組織のプロテオームの分析のため簡単に変換します。

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Protocol

この議定書、xiangya の第 2 病院医療倫理委員会の中央南大学、中国のガイドラインに従います。肌や髪の8からケラチン汚染を避けるために全体の実験手順ヘッド キャップと手袋を着用する必要があります。

1. 試料の調製

  1. 脳神経外科部から PA 組織 (0.2 - 0.5 mg) を収集します。すぐに液体窒素で凍結し、-80 ° C、ストレージに転送します。
  2. 0.9 %2 mL を加える脱イオン蒸留水 (ddH2O) で塩化ナトリウム。このソリューションを使用して、組織の表面 (3 x) から血を軽く洗います。
    注: ddH2O 伝導率 18.2 MΩ/cm はプロトコルで使用されています。組織の表面から血を洗うとき、tissuemight の一部が失われます。
  3. 2 M 酢酸と 0.5 - 組織の 0.6 g を 0.1% (v/v) β-メルカプトエタノールを含む溶液 (10 mL; 4 ° C) ボリュームを追加、組織ホモジナイザーを用いた (1 分、13,000 rpm、4 ° C, 10 x) を均質化、20 の磨砕液を超音波 s、凍乾、−80 ° C で保存
  4. 凍結乾燥タンパク質含有量を測定、ビシンコニン酸 (BCA) を用いた均質化試料分析キット。
    注:BCA の定量化は、絶対定量ではなく、測定結果が異なる技術者と実験的エージェント変更されます。固定濃度サンプル標準は異なる実験のために使わなければなりません。したがって、それぞれの第 2 ゲルのための蛋白質の最終的なロード量も前設計されていた実験で、銀染色や Coomassie ステンド良い解像度の画像と異なります。
    1. タンパク質抽出の 1 つのボリューム (282 μ L) に、凍結乾燥試料約 300 μ g を追加バッファー (8 M 尿素と 4% チャップス) は続いて立って 2 時間、5 分、1 時間、5 分間湯せんでもう一度 sonicating 回転の水風呂で sonicating、1 時間、もう一度回転と 20 分間 15,000 × g で遠心分離します。
    2. 前述のように BSA 濃度の標準溶液を準備: 0、25、125、250、500、750、1,500、2,000 μ g/mL で商業の BSA の標準 (2 mg/mL)。
    3. ミックス BCA 試薬 A と B (A:B = 50: 1) 使用前に BCA 作業ソリューションとして。
    4. 続いて混合とし、30 分の 37 ° C で培養および microfuge の管で BCA 作業溶液 2 mL に試料または標準液の 0.1 mL を追加します。最終的に室温で 10 分間冷却し、A を測定562 nm外径値。
    5. 標準的な直線を計算 (A562 nm BSA 濃度対)562nm値を持つコンテンツ サンプル蛋白質を計算するための回帰式を取得します。
  5. 染色、銀の蛋白質と同等の凍結乾燥サンプルの 150 μ g または Coomassie 染色、18 cm 固定化 pH 勾配 (IPG) ストリップ pH 3-10 非線形 (NL) のための蛋白質の 500 μ g を使用します。
    注:IPG のドライ ストリップは、0.5 mm 厚と 3 mm ワイド、7、11、13、18、および 24 cm どちらか線形や非線形の pH 勾配で pH 4-5、4-7、6-9 と 3 10 を含むさまざまな pH 範囲など異なる長さです。使用される IPG バッファーは、ストリップ27,28に収まる必要があります。
  6. バッファーを抽出 1.6.Add 250 μ L (7 M 尿素、チオ尿素 2 M、4% (w/v) チャップス、100 mM DTT (使用する前に追加)、0.5 %v/v pharmalyte (使用する前に追加)、ブロモフェノール ブルーのトレースなど)。
  7. ボルテックス sonicating 5 分と 50 分間回転、5 分間続いて、30 の ° C の下にソリューションをしてください。
  8. 水分補給バッファーの 110 μ L を追加 (7 M 尿素、チオ尿素 2 M、4% (w/v) チャップス、60 mM DTT (使用する前に追加)、0.5 %v/v IPG バッファー (使用する前に追加)、ブロモフェノール ブルーのトレースなど)。5 分の超音波照射します。50 分のサンプルを 5 分間渦と 15,000 × g で 20 分間遠心を回します。
  9. タンパク質サンプル ソリューション8清 (350 μ L) を収集します。

2. 二次元ゲル電気泳動

  1. IEF (最初寸法): 下記のとおり等電点焦点システムで IEF を実行します。
    1. 18 cm IPG ストリップ ホルダーのスロットにタンパク質サンプル溶液の 350 μ L を追加します。
    2. 置く、18 cm IPG ストリップ ゲル-サイド - タンパク質サンプル溶液に (泡を避けるため)。
    3. IPG ストリップをカバーする鉱物油の 3-4 mL を追加します。
    4. バック (+) プレート、フロント (−) 皿の上の正方形のプラグ等電点焦点システム先の尖った端に IPG ストリップ ホルダーを組み立てます。
    5. 一晩 (室温 〜 18 h) を水分補給します。
    6. IEF パラメーターを設定: ストリップ、20 ° C あたり最大電流 30 μ A250 V、1 h, 125 台、ステップとホールド;1,000 V、1 h、500 Vh グラデーション8,000 V、1 h、4,000 台のグラデーション。8,000 V、4 h、32,000 Vh、ステップ、ホールド;500 V、0.5 h, 250 Vh、ステップとホールド。7.5 h と 36,875 Vh の合計時間に実行すること。
    7. IEF 後、各 IPG のストリップを取るし、不溶性の紙タオルで余分な鉱物油を除去します。今、ラップのシートでストリップをラップし、−80 ° C で保存
      注:IPGstrip ホルダー IPGstrip ホルダーの洗浄液で洗浄してくださいし、蒸留水します。
  2. SDS ページ (2 番目の寸法): 垂直セル電気泳動システムで SDS-PAGE を実行
    注:各 SDS ページのゲルのサイズは 255 × 190 × 1 mm をする必要があります。
    1. マルチ ゲル キャスターを使用してキャスト 12% ゲルを解決するページです。鋳造 12% のゲルのページは、次の手順を実行します。
      1. DdH2O、1.5 150 mL 270 mL を加える M トリス-HCl (pH 8.8)、40% (w/v) アクリルアミド/bisacrylamide 原液 180 mL (29:1、40 %w/アクリルアミドと 1.38 %w/v N, N'-methylenebisacrylamide)、過硫酸アンモニウム 10%、3 mL、150 μ L のゲルに TEMEDビーカー内のソリューションです。穏やかに混合し、泡を避けるため。
      2. 予想されるゲルの高さ (19 cm) までのマルチキャストの商工会議所にそっとゲル溶液を注ぐ。
      3. すぐに各解決のゲル、ゲルをカバーするために約 3 mL の ddH2O を追加します。約 1 時間の重合ゲルをしましょう。
    2. 電気泳動バッファー (25 mM トリス、192 mM グリセリンと 0.1 %sds) の 20 L を準備します。このバッファーに電気泳動分離単位バッファー槽を埋めます。
    3. 冷凍庫から焦点を当てた IPG ストリップを取り出して 4 mL の平衡バッファー (375 mM トリス-HCl (pH 8.8) 6 M 尿素 2% (w/v) SDS、20% (v/v) グリセロール、2 w/v DTT (使用する前に追加) を減らすに優しくロッキング 10 分のストリップを平衡、ブロモフェノール ブルーのトレースなど)。
    4. 4 mL アルキル化平衡バッファーの削減 IPG ストリップを軽くロッキング 10 分の平衡 (375 mM トリス-HCl (pH 8.8) 6 M 尿素 2% (w/v) SDS、20% (v/v) グリセロール、2.5 w/v ヨードアセトアミド (使用する前に追加)、ブロモフェノール ブルーのトレースなど)。
    5. ゲルの平衡の中にマルチキャスト会議を分解し、準備ができて解決するゲル カセットを取り出します。DdH2O を削除過剰な ddH2O 不溶性紙タオルで 3 x を洗浄し、ゲル スタンダー。
    6. 電気泳動バッファーで平衡 IPG ストリップをリンスし、不溶性ペーパー タオルで IPG ストリップ表面に余分な液体を削除します。
    7. 解決の SDS ページのゲルに IPG のストリップを置くし、IPG ストリップのプラスチック側面長いガラス板と左に先の尖った端にお問い合わせください。
    8. 各の SDS ページのゲルの上にホットの 1% の agarose IPG ストリップを密封するためにすぐに SDS 電気泳動バッファー (~ 80 ° C) での 3-4 mL を注ぐと泡なし短いガラス板の上部に IPG ストリップの上部側を入れて、10 分間重合。
    9. 垂直電気泳動システムのプラスチック製のガスケットの間に垂直に組み立てられたゲル カセットを挿入します。陰極 (−) の横にある IPG ストリップとゲルの上部に配置します。
    10. 電気泳動ゲルのカセットを没頭するバッファーのレベルを調整します。
    11. 接続、定電圧モードで電源供給/コントロール ユニットを設定し、染料を監視しながら約 370 分の 200 V で実行します。
    12. 実行した後、電気泳動システムからゲル カセットを取り出し、2DE 分離タンパク質の染色に続いて、ゲルを引き裂く回避するゲル カセットからゲルを慎重に取り外します。
  3. 2DE 分離タンパク質の染色
    1. 銀製の汚損
      1. 優しく固定溶液 (50% メタノール (v/v) と 5% (v/v) 酢酸) 250 mL を含むトレイに 2 つの手を持つゲルを転送し、20 分のためのゲルを軽く振る。
      2. 液を捨て、トレイに 250 mL のメタノールの 50% (v/v) を追加、軽く 10 分間振る。
      3. メタノールを破棄し、トレイに ddH2O の 250 mL を追加します。10 分間軽く振る。
      4. 優しく 0.02% (w/v) チオ硫酸ナトリウムを含む鋭敏化バッファーの 250 mL で 1 分のゲルを振るし、液体を廃棄します。
      5. DdH2O 1 分 (再放送 1 つより多くの時間) のための 250 mL のゲルを軽く振る。各手順の後、液を破棄します。
      6. 250 mL 銀反応溶液 (0.1% (w/v) 硝酸銀使用の前に追加された 200 μ L 37% (v/v) ホルムアルデヒド) で 20 分のためのゲルを軽く振る。
      7. DdH2O 1 分 (再放送 1 つより多くの時間) のための 250 mL のゲルを軽く振る。各手順の後、液を破棄します。
      8. シェイク 250 mL 開発ソリューションで優しくゲルは染色の目的の強度 (一般 1-3 分) を取得するまで、液体破棄を (100 μ L 37% (v/v) ホルムアルデヒドと炭酸ナトリウム 3% (w/v) を使用する前に追加)。
      9. ゆっくり 250 mL のソリューション (5% (v/v) 酢酸) を停止に 10 分のためのゲルを振るし、液体を廃棄します。
      10. 優しく ddH2O の 250 mL で 5 分間振るし、液体を破棄します。
      11. 4 ° C で 8.8% グリセロールのソリューションを格納する 250 mL のゲルを維持します。
    2. クマシーの鮮やかな青染色
      1. Coomassie Coomassie の華麗なを溶解することにより染色液の準備ブルー G250 0.3 g、25 g の硫酸アンモニウム、リン酸 25 mL ddH2O で、200 mL の容量まで。使用前に追加メタノール 50 mL。
      2. 染色液ゲルに Coomassie の 250 の mL を追加し、クリアまで室温でゆっくり振る蛋白スポット表示 (2 〜 4 h)。液体を破棄します。
      3. DdH2O の 250 の mL を追加し、5 分間ゆっくりと、二回振るより。液体を破棄します。
      4. 脱染め色液 (20% (v/v) エタノール) の 250 の mL を追加し、背景色はほぼ無色になるし、液体を廃棄するまでゆっくりと横に振る。
      5. 古い 1 つは、暗くなっているときに新鮮な脱染め色液を交換し、液体を破棄します。
      6. DdH2O の 250 mL を加えて 5 分破棄液体をゆっくりと横に振る。
      7. ソリューション (8.8% グリセロール) を格納する 250 mL を追加し、4 ° C で維持
  4. 二次元ゲル電気泳動イメージ分析
    1. 染色ゲルをフラット ベッド スキャナーでデジタル化します。
    2. 第 2 ゲル画像解析システムに入力した画像。
    3. 検出し、製造元のプロトコルに従って第 2 ゲル画像解析ソフトウェアを使用して各スポットを定量化します。
    4. 異なるゲル間の点に一致します。

3. ms 2DE 分離タンパク質の同定

  1. トリプシン ペプチド混合物の調製
    注:シリコーンまたは低保持チューブ ・ ピペット チップを使用して、タンパク質、ペプチドの任意の損失を避けるためにください。
    1. 銀-ゲル染め色
      1. ゲル 500 μ L ddH2O 6 回でさせチューブ、1.5 mL の両面にスポットを切除します。
      2. 新しい両面 1.5 mL チューブに洗浄ジェルを入れ、多くの小さな断片にそれをミンチ (0.5-1 mm3)。
      3. 茶色の色 (通常 1-2 分) が消えるようにフェリシアン化カリウム 30 mM の部分と 100 mM チオ硫酸ナトリウム (1:1) 使用前の部分をミックスした脱染め色液の 20 μ L のゲル部分をすすぐ。液体を破棄します。
      4. DdH2O の 20 μ L をゲル部分を洗浄し、5-6 回黄色が消えるようにします。各手順の後、液を破棄します。
      5. ゲル部分に 200 mM 重炭酸アンモニウムの 20 μ L を追加し、滞在 20 分洗浄、ゲル入りの ddH2O (20 μ L、1 時間)。液体を破棄します。
      6. 不透明な白と真空遠心分離機を 30 分間乾燥にゲル部分をように少なくとも 2 回アセトニ トリル 30 μ L 入りのゲルを脱水します。
    2. Coomassie 鮮やかな青ゲル染め色
      1. ケイ化 1.5 mL チューブにゲル スポットをカットし、少なくとも 3 回 500 μ L ddH2O で洗浄します。
      2. 新しい 1.5 mL のシリコーンの管に洗浄ジェルを入れ、いくつかの部分にミンチ (0.5-1 mm3) ピペット チップで。
      3. 脱色するゲルの量に応じて 50-100 μ L 脱染め色液 (1:1 v/v ミックス 200 mM NH4HCO3アセトニ トリル) で、37 の ° C の水浴中で孵化させなさい。繰り返し、色が消える (~ 1 h) まで新鮮な脱染め色液を追加します。各手順の後、液を破棄します。
      4. DdH2o. の 20 μ L で一度ゲル部分を洗浄し
      5. 100 μ L アセトニ トリル中で (最低 2 回) 不透明を白くゲル部分にゲル部分を脱水します。
      6. 真空乾燥 30 分。
    3. 乾燥ゲル部分の蛋白質のゲルのトリプシンの消化力
      1. 凍結乾燥のトリプシン パウダー 50 mM 酢酸の 100 μ L の 20 μ g (833 pmol) を解散します。
      2. トリプシン溶液 (200 ng/μ L) の 20 μ L を 50 mM 重炭酸アンモニウムの 230 μ L で 16 ng/μ L に希釈します。
      3. 20-30 μ L を追加 (0.32 0.48 μ g) 乾燥ゲルを含んでいる各管に希薄トリプシン溶液の。水浴の 37 ° C で 18-20 時間孵化させなさい。解決策は 4 ° C で 30 分間放置をみましょう。
      4. 30 ° C で 5-6 分間水浴の 10 s. Sonicate のソリューションを軽く遠心し、2 分間 12,000 × g で遠心分離します。
      5. 0.5 mL シリコーン チューブにトリプシン ペプチド混合物を含む上清を収集します。
    4. C18 マイクロカラム トリプシン ペプチド混合物の浄化。
      1. アセトニ トリル (10 μ L、5 回) とし、50% アセトニ トリル (10 μ L、5 回) 各 C18 カラムを洗ってください。
      2. 0.1% のみ酢酸 (TFA) (10 μ L、5 回) で平衡します。
      3. 15 回のサンプルの準備の C18 カラムを上下にピペットします。
      4. サンプル 2 を洗って 10 μ L 0.1% x TFA。
        注: 精製由来ペプチドは、C18 カラムに保持されます。
      5. きれいな 0.5 mL シリコーン チューブのソリューション (85 %v/acetonitrile/0.1% v/ギ酸) のボリューム (6 μ L) を追加、このソリューションを優しくピペットおよびゆっくり上下ソリューションに結合ペプチドを洗うに 10 倍のペプチド C18 ビーズを通して空気乾燥、および質量分析のための店 (− 20 ° C)。
  2. MS 分析
    1. MALDI MS PMF 分析
      1. 85 %v/acetonitrile/0.1% v/精製トリプシン ペプチド混合物を溶解する TFA の 4 μ L を追加します。負荷 2 μ L 溶解トリプシン ペプチド混合物 MALDI プレート上に、すぐに追加 2 μ L アセトニ トリル 500 mL/L で 10 g/L を含む а-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸 (CHCA) ソリューションの 1 mL/L TFA、その後風乾します。
      2. MALDI MS の質量分析計にトリプシン ペプチド混合物の MALDI プレートをロードします。
        注:計測器パラメーターを 20 と反射モードとして設定して kV 加速電圧の肯定的な極性と 160 ns 遅延抽出時間。標準的なペプチドに外部で校正後 200 m/z 1,000 に 4,000 の範囲レーザー ショットをつけた各 MS スペクトル質量。
      3. MS スペクトル処理ソフトウェアを使用すると、ベースライン補正、ノイズ除去 (5%)、ピーク deisotoping などそれぞれの MS スペクトルを処理します。
      4. トリプシン、マトリックス、ケラチン、および空白ゲルの実験の並列で他の未知の汚染物質からの大衆の汚染の除去と各 MS スペクトルから大量のリストを修正します。
      5. 修正された質量リスト PMF 検索型、人間を含む、次の検索パラメーターとスイス人 Prot 蛋白質データベースにおける蛋白質を識別するソフトウェアを検索 PMF ベースのタンパク質に逃した 1 最大トリプシン分裂、固定入力carbamidomethyl システイン変数メチオニン酸化、モノアイソ、ペプチド質量公差 50 ppm、ペプチド充電状態 (1 +) と信号ノイズ (S/N) 5.0 を。
      6. 統計学的に重要なタンパク質のスコアを持つ蛋白質を識別してタンパク質がスコア =-10 × log(p)、p が観測された一致がランダムなイベントである確率であります。
    2. MALDI MS/質量分析
      1. 50 %v/v acetonitrile/0.1% v/精製トリプシン ペプチド混合物を溶解する TFA の 4 μ L を追加します。各精製トリプシン ペプチド混合物 (0.5 μ L) 384 ウェルの MALDI プレートの上で発見、ペプチドのサンプルの上に 50% acetonitrile/0.1% TFA で飽和 CHCA マトリックスの 0.5 μ L をすぐに発見し、空気中で乾燥します。
      2. 1 つの MS1 スペクトルを取得する 100 のレーザー ショットを使用して自動的に、なんとか MALDI-TOF TOF MS/MS を聞かせてし、蓄積 6 1 つ合成 MS1 スペクトルに MS1 スペクトルを繰り返されます。
      3. タンデム質量分析のため各合成の MS1 スペクトルから 4 の最も強烈な前駆イオンを設定します。1 つの MS/MS スペクトルを取得して蓄積 4 各前駆イオンの使用 100 レーザー ショットは、1 つの合成の MS/MS スペクトルに MS/MS スペクトルを繰り返します。
      4. 合成の MS/MS データを使用して MS/MS イオン検索、スイス人 Prot 人間データベース 1 逃された胸の谷間があり、固定 carbamidomethyl (C)、変数の最大値とトリプシンを含むパラメーターを持つソフトウェアを検索 MS/MS を用いたタンパク質によるタンパク質を検索酸化 (M)、モノアイソ質量値、ペプチド質量公差 ± 100 ppm とフラグメント質量公差 ± 0.7 ダ。
      5. Mowse スコアとイオンのスコアに基づいて統計的に有意な確率で蛋白質を識別する =-10 x Log(P)、p が観測された一致がランダムなイベントである確率であります。
    3. LC-ESI-タンデム質量分析
      1. 5 %v/acetonitrile/0.1% v/ギ酸精製トリプシン ペプチド混合物を溶解するための 6 μ L を追加します。
      2. 高速液体クロマトグラフィー (HPLC) システムは、エレクトロ スプレー イオン化 (ESI) とオンライン結合の使用-MS/MS 質量全体の動作を管理する MS/MS データ取得管理ソフトウェア。
      3. C18 トラップ列 (300 μ m 内径 × 5 mm)、および逆相 C18 カラム (75 μ m 内径 x 15 cm) 98% 溶媒 (0.1% ギ酸) で分離のグラデーションと 2% 溶剤 B を使用 (0.1% ギ酸アセトニ トリル 100% で) 2 分、2% 〜 40% 溶剤 B 45 分、5 分の 40% から 95% 溶剤 B 95% 溶剤 B 10 分 (合計 300 nL/min で 65 分) のために。
      4. ポジティブ イオン モードと MS、MS/MS スペクトルを獲得し、イオン化の衝突誘起解離 (CID) を設定するデータ依存の自動調査モードを設定します。
      5. M/z 350 1,800 m/z 400 で 100,000 の解像度を持つ質量範囲に各 MS のスキャンを設定します。MS スキャン 7 の最も強烈なイオンのスキャンを実行します。
      6. 検索エンジンのソフトウェア使用 MS/MS を用いたタンパク質タンパク質の同定のためのデータベースを検索します。
        1. 人間蛋白質のデータベースを選択します。
        2. 1 つ逃した胸の谷間サイトとトリプシンを選択します。
        3. ペプチド許容値 (± 10 ppm) を設定、フラグメント イオンの許容値 (Da ± 0.8)、システインでペプチド固定料金 (2 +、3 +、および 4 +)、carbamidomethylation 及びメチオニン変数酸化。
        4. 偽の発見率 (FDR) を設定 < 1% とランク 1 ペプチドのみ受け付けています。
        5. PSM≥1 とタンパク質を識別 (Psm: 重複して識別されたそれらを含む蛋白質のための識別されたペプチド配列 (Psm) の合計数) とタンパク質あたりの少なくとも 2 つのユニークなペプチド。
      7. また、タンパク質の同定のためのデータベースを検索するのにタンパク質検索ソフトウェアの MS MS ベース II を使用します。
        1. 生の MS ファイルを .mgf ファイルに変換します。
        2. 人間蛋白質のデータベース (70940 のシーケンスと 23897047 残基を含む uniprothuman_20161031.fasta) を選択します。
        3. 最大 2 逃した劈開のトリプシンの消化力を選択します。
        4. Carbamidomethyl (C)、変数脱あみど化 (NQ) と酸化 (M)、前駆物質イオン質量公差 10 ppm、娘イオン質量許容差 0.8 固定セット Da、およびモノアイソ ピーク。
        5. 0.05 と少なくとも 2 のユニークなペプチドの意義しきい値と蛋白質を識別します。

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Representative Results

1 です 2DE MALDI MS PMF: FSH 表現 NFPA 組織から抽出した 150 μ g 蛋白質の合計上記実験の手順と (女性; 50 歳、ACTH (-), GH (-), PRL (-)、LH (-), FSH (+) と TSH (-)) 18 cm で配列と。IPG ストリップ (pH 3-10 NL) と銀染色で可視化し、大規模な形式の SDS-PAGE のゲル。NFPA 組織のプロテオーム (図 1)、1.98 ± 0.75 mm IEF 方向の平均位置偏差と 1.62 ± 0.68 mm SDS ページ方向と約 1,200 タンパク質スポットの再現性と良い 2DE ゲル パターンを得たpH 4-8 の質量の 15-150 kDa3エリア内で配布された主に 2DE ゲル マップで検出されました。合計では、337 ゲル スポットは摘出されゲル染め色、トリプシンの消化力、浄化の由来ペプチドと MALDI TOF MS PMF 分析を受けます。PMF データは、ヒトのタンパク質データベースに対してマスコット検索を持つ蛋白質 id に使われました。192 冗長蛋白質 (107 非冗長蛋白質を表す) の合計 337 分析ゲル スポット 141 ゲル スポットから識別された (141/337 = 42%)、196 点で蛋白質が認められなかったと (196/337 = 58%)(表 1)。スポットごとの 2 つのタンパク質が同定されたこれらの 141 のスポット、スポットごとの 1 つだけのタンパク質は、121 点で識別されたの 3 箇所 (スポット 19 で識別されたスポットあたり 5 蛋白質 12 スポット (31、32、33、41、42、43、44、68、75、137、148、および 224 の斑点)、、22、および 23)、1 点につき 6 蛋白質は 3 スポット (スポット 24、91、93) で識別された、1 点につき 7 タンパク質が 2 箇所 (スポット、72 と 92) で識別されました。

2. 2DE MALDI MS/MS と 2DE-クロマトグラフィー-タンデム質量:上記実験の手順を使用して、侵襲の NFPA 組織 (男性、22 歳、ACTH (-)、hGH (-)、PRL (+ +)、(-)、LH および FSH (-)) から抽出したタンパク質の 500 μ g の合計は 18 cm IPG ストリップ (配列だったpH 3-10 NL) と Coomassie 青い G250 染色で可視化し、大規模な形式の SDS-PAGE のゲル。約 1.95 ± 0.85 mm IEF 方向の平均位置ずれと侵襲の NFPA 組織プロテオーム (図 2) と 1.85 ± 0.79 mm SDS ページの方向との再現性と高品質 2DE ゲル パターンをもたらしたこの染色pH 4-8 と質量の 15-150 kDa29の範囲内で配布された主に 2DE ゲル マップで 1,100 タンパク質 spotsdetected。10 のスポットをランダムに選択、切除および受けるゲル染め色が図 2のラベル、トリプシンの消化力、トリプシン ペプチド精製続いて MALDI MS/MS と LC ESI-MS/MS 分析。各 MS/MS データセットは、マスコット人間蛋白質データベースに対して検索を持つ蛋白質 id に使われました。対しすべてのスポットの 1 点につき 1 蛋白質の平均だった/TOF MALDI-TOF タンデム質量分析と識別される多くのタンパク質 (単一ゲル スポット 63 蛋白質の平均、2 一致するスポットのプールで 71 蛋白質の平均と 3 ボラボラ島のプールで 118 蛋白質の平均hed ゲル スポット) - ESI-MS LC/MS 分析 (表 2) で識別された各対応するスポットで。ここでは、一つは-ESI-MS LC/MS システムははるかに高い感度と MALDI/タンデム質量分析システムを基準にして解像度を言及する必要があります。このデータは明らかにそれぞれの第 2 ゲルのスポットは、多くの蛋白質、複雑なひと癌組織のプロテオームのないちょうど 1 つまたは 2 つのタンパク質が含まれていることを示します。

Figure 1
図 1: 銀染色 2 デ IPGstrip ph 3 分析 FSH 表現 NFPA プロテオームのパターン-SDS ページの 10 NL および 12% のゲル濃度。赤茶色の斑点が銀染色蛋白質, オレンジ色は、銀染色ゲルの背景。ラベル付きのスポットは、MALDI TOF MS PMF と分析しました。ら王 X から再現(2015)3、ワイリー VCH の許可を得ています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 2
図 2: ブルー染色 2 デ IPGstrip ph 3 - 分析 NFPA プロテオームのパターンSDS ページの 10 NL および 12% のゲル濃度。ラベル付きのスポットは MALDI-TOF TOF MS/MS とLC ESI-MS/MS分析しました。スポット 1 * 2、* 3、* 5、*、16 * 対応するスポット 1、2、3、5、および 16 と一致し、2 一致したゲルからプールされました。ら占 X から変更(2018)29、ワイリー VCH の許可を得ています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Table 1
表 1:各 2DE で識別された蛋白質のゲル MALDI TOF MS PMF 分析スポットの数。

Table 2
表 2: タンデム質量分析によるスポット 2DE ゲルで識別された蛋白質の数です。

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Discussion

2DE MS PMF と 2DE ・ MS/MS を含む MS 方式と相まって、2DE は正常に私たちの長期的なプログラム - 人間の NFPA プロテオーム変動と分子機構の解明に向けた分子ネットワーク変動を研究するプロテオミクスの使用で使用されているとNFPAs に効果的なバイオ マーカーの発見。再現性の良い 2DE ベースの比較プロテオミクス NFPA プロテオーム変動9,10、11,12,13,の識別に重要な役割を果たしています。19、および抗体法と相まって 2DE 与えられた翻訳後修飾の検出とチロシン ニトロ化16,17の検出などの特定の蛋白質の変形でその利点を示します,18 GH の亜種14,15。

ただし、MS 法と相まって 2DE は、非常に低いまたは高いタンパク質2非常に基本的なまたは酸性蛋白質疎水性蛋白質低豊富な蛋白質の分析の難しさと手間のかかる手法と見なされます。例えば、非常に低質量 (< 10 kDa) または高質量 (> 150 kDa) 蛋白質、および非常に基本的な (pI > 7.5 または 8) または酸性 (pI < 3.5 または 4) タンパク質が簡単にで検出されない 18 cm 2DE IPG は 3-10 NL3pH のストリップします。だが、安定同位体は、最後の 10 年間23では、iTRAQ、TMT など標識と相まって二次元液体クロマトグラフィー (2次元 LC) を含む無料のゲルの分離方法の急速な発展その 2 ドが脱退して徐々 にその2次元 LC は、安定同位体標識と相まって、MS/MS メソッドは効果的に 2DE ベースの方法の欠点を克服するため、プロテオミクスにおける中央状態は複雑な組織のプロテオーム解析の研究します。

最近の研究では、- ESI-MS LC/MS (感度は 1-10 amol の範囲では) 2DE で区切られた蛋白質の同定におけるなどの高感度質量分析を用いる 2 ド法の新しい特性が発見されたを示す発見します。2次元ゲル スポットには、多くの蛋白質 (テーブル 2) が含まれています。これに反したスポット、あたり 1 つまたは 2 つの蛋白質の伝統的な概念世界 2DPAGE データベースによって証明されている (世界 2DPAGE ポータル: http://world-2dpage.expasy.org/portal)。これは明らかに複雑な人間の proteome の蛋白質のアイデンティティで 2 de スループットが以前とされる、すなわちものよりはるかに高いことを示して第 2 ゲル スポットで 1 ~ 2 タンパク質だけがあった。この手法では、プロテオミクスの分野で 2DE 用の約束を提供しています。1 つの 2DE することができます複数の千に 1 万スポット3,8,22 2DE 従って複雑な人間の proteome の分析を最大限に簡素化プロテオームのより詳細な分離技術最初の次元の LC がよくクロマトグラフィー-タンデム質量分析の前に 18 に 30 分画を生成する 2次元 LC システムを基準にしてクロマトグラフィー-タンデム質量分析の前にサンプル。したがって、これらの低の特に複雑な人間の proteome の多大な情報参照マップを確立するか、非常に豊富なタンパク質を低高感度質量分析法との組み合わせで 2DE を使用できます。さらに、安定同位体比との組み合わせで 2 デ (iTRAQ、TMT、SILAC など) ラベル付けおよび高感度質量分析法による使用できます異なる条件の中で大規模プロテオーム変化を定量化します。また、2DE は、安定同位体標識と相まって、高感度質量分析法による大規模な検出と定量化タンパク質 Ptm、蛋白質の変形、蛋白種分化と蛋白質種の絶対的な利点があります。これらの利点はプロテオミクスの分野で復活した 2DE をだろう

さらに、ここで説明した人間の PA 組織のプロテオーム解析の現在のプロトコルは、他のヒトの疾患プロテオームを研究に簡単に変換されます。

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Disclosures

著者は、利害の衝突がないことを宣言します。

Acknowledgments

この作品は、国家自然科学基金中国 (許可番 81572278 と 81272798 XZ)、中国「863」計画プロジェクト (XZ にグラント号 2014AA020610-1)、才能入門 (XZ)、xiangya の第 3 病院の資金と、湖南省からの補助金によって支えられました。中国の地方の自然科学基礎 (XZ にグラント号 14JJ7008)。著者はまた博士ドミニク M. でテネシー大学健康科学センターでの科学の貢献を認めます。X.Z. 継続的に開発し 2001 年から始まって下垂体腺腫プロテオームを解析する 2DE MS メソッドを使用、現在の原稿のための概念を考案した、書いた原稿に、関連の仕事の調整し、に責任があった、財政支援と対応する作業。Y.L. は、原稿の修正に参加しました。YH は参加する参照のコレクションと原稿の修正。すべての著者は、最終原稿を承認しました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ettan IPGphor 3  GE Healthcare isoelectric focusing system.
Ettan DALTsix multigel caster Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA
Ettan DALT II System Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA The vertical electrophoresis system
Ettan IPGphor strip holder Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA
Ettan DALTsix multigel caster Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA Multigel caster
Voyager DE STR MALDI-TOF MS  ABI, Foster City,CA MALDI-MS PMF
MALDI-TOF-TOF Autoflex III, Bruker MALDI-MS/MS mass spectrometer
LTQ-OrbiTrap Velos Pro ETD Thermo Scientific, Waltham, MA, USA ESI-MS/MS mass spectrometer
EASY-nano LC system  Proxeon Biosystems, Odense, Denmark High performance liquid chromatography system
PepMap C18 trap column  300 μm i.d. × 5 mm length; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA
RP C18 column 75 μm i.d., 15 cm length; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA
KimWipe Kimvipe  Insoluble paper towel
Watter Made by PURELAB flex instrument
Polytron Model P710/35 homogenizer Brinkmann Instruments, Westbury, NY
PDQuest Bio-Rad,  Hercules, CA 2D gel image analysis software
SEQUEST  Thermo Proteome Discoverer 1.3 (version No. 1.3.0.339)
DataExplore (ver. 4.0.0.0) software MS spectrum-processing software
Mascot software PMF-based protein searching software  
Mascot software MS/MS-based protein searching software
Proteome Discoverer software v.1.3 beta Thermo Scientific
Xcalibur software v.2.1 MS/MS data-acquired management software 
Uniprot version 201410.1_HUMAN.fasta Human protein database
SEQUEST (version No. 1.3.0.339)  MS/MS-based protein searching software I
MASCOT (version 2.3.02)  MS/MS-based protein searching software II
C18 ZipTip microcolumn Millipore
PeptideMass Standard kit  Perspective Biosystems
Pierce BCA Protein Assay Kit  Thermo Fisher Scientific 23227
2-D Quant Kit GE Healthcare 80-6483-56
BIS-ACRYLAMIDE AMRESCO 0172
ACRYLAMIDE AMRESCO 0341
DTT Sigma-Aldrich D0632
Thiourea Sigma-Aldrich T8656
Urea VETEC V900119
SDS AMRESCO 0227
CHAPS AMRESCO 0465
TEMED AMRESCO M146
Ammonium Persulfate AMRESCO M133
Trypsin Promega, Madison, WI, USA V5111
IPG buffer pH 3-10, NL GE Healthcare 17-6000-87
Immobiline Dry Strip pH 3-10NL,18cm GE Healthcare 17-1235-01

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References

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がん研究、問題 134、二次元ゲル電気泳動法、等電点焦点、アクリルアミドゲル電気泳動、銀染色、クマシー染色、画像解析、ペプチドマスフィンガー プリント (PMF)、タンデム質量分析 (MS/MS)、下垂体腺腫、プロテオーム
ひと下垂体腺腫の組織のプロテオームの分析のための質量分析法と相まって二次元ゲル電気泳動
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Zhan, X., Huang, Y., Long, Y. Two-dimensional Gel Electrophoresis Coupled with Mass Spectrometry Methods for an Analysis of Human Pituitary Adenoma Tissue Proteome. J. Vis. Exp. (134), e56739, doi:10.3791/56739 (2018).

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