一种改进的小鼠麻醉状态下脑脊液采集方法

摘要

本方案描述了一种改进的技术，可用于大量采集无血液污染的脑脊液（CSF）。通过获取更多且更纯净的样本，可利用脑脊液开展更多分析，从而加深对影响脑和脊髓疾病的认知。

摘要

脑脊液（CSF）是神经科学研究中一种有价值的体液，因其与中枢神经系统接触最为密切，故可用于分析脑或脊髓的病变状态，而无需直接获取这些组织。然而，在小鼠中，由于延髓池靠近血管，采集脑脊液时常受到血液污染，导致样本质量受限。此外，小鼠脑脊液采集区域解剖难度较大，通常仅能获得少量样本（最多5–7 µL或更少）。本方案详细描述了一种改进现有采集方法的技术，可最大限度减少血液污染，并实现脑脊液的充分采集（平均可采集10–15 µL）。该技术可与其他小鼠组织取材的解剖方法联合使用，因为在脑脊液提取过程中不会影响任何组织。因此，采用该技术后，脑和脊髓未受干扰，保持完整。通过获得更大量且更纯净的脑脊液样本，可对该体液开展更多分析，进一步推动神经科学研究，加深对影响脑和脊髓疾病的理解。

引言

脑脊液（CSF）是神经科学研究中一种有价值的体液，主要用于分析。脑脊液主要由血浆生成，细胞含量极少（无红细胞，仅有少量白细胞），几乎不含蛋白质。它是与中枢神经系统（CNS）密切接触的体液之一，能够将多种电解质从脑和脊髓转运至外周系统。在人类中，可通过腰椎穿刺（又称脊椎穿刺）这一轻微的侵入性操作采集脑脊液样本，用于临床诊断疾病或参与临床试验的研究。由于脑脊液能够反映中枢神经系统的改变，而无需直接获取这些组织，因此近年来在临床研究中，已从阿尔茨海默病及其他类型痴呆等神经退行性疾病患者中获取脑脊液样本^1,2,3。目前已有多种基于脑脊液样本开发的生物标志物检测方法，有望辅助临床疾病的诊断^2,3。然而，这些检测方法在产生一致且敏感的结果以特异性诊断疾病方面的可靠性仍存在广泛争议^4,5。因此，迫切需要开发更优的检测方法和靶点，这些靶点可存在于脑脊液中，以助于建立一种具有更高敏感性和特异性的标准技术，用于诊断神经退行性疾病。鉴于人脑脊液样本在疾病研究中的潜在重要性，在神经科学研究中，从啮齿类动物中采集脑脊液也受到广泛关注。

小鼠是生物医学研究中的重要动物模型，在开展人体临床试验之前，可用于测试潜在的治疗性化合物并进行概念验证研究。然而，由于小鼠体型较小且脑脊液（CSF）位置靠近大脑，获取其脑脊液样本较为困难。目前小鼠脑脊液采集的常规方法是通过延髓池（cisterna magna）取样，即在小脑与延髓背侧表面之间的腔隙进行穿刺。该区域解剖难度较大，且邻近血管，因此在操作过程中容易导致血液细胞污染，增加了样本污染的风险。由于这些技术难点，大多数研究人员仅能获得少量脑脊液用于分析（通常为5–7 µL），而脑脊液样本中混入血液细胞是分析过程中首要关注的问题^6,7,8,9。血液污染可能掩盖真实结果，无法准确反映中枢神经系统（CNS）的实际状态。此外，样本量有限也会影响研究的开展，因为从小鼠获取的常规样本量通常仅够进行一次检测（设双复孔或三复孔）的酶联免疫吸附测定（ELISA）。因此，通常需要将多只小鼠的脑脊液样本合并，以获得足够量的样本用于多项检测。建立一种能够大量、无污染地采集小鼠脑脊液的实验方案具有重要意义，将有助于推动基于啮齿类动物的神经科学研究进展。

本方案详细描述了一种从麻醉小鼠中大量（平均10-15 µL）采集脑脊液（CSF）的技术，该方法在现有脑脊液采集技术的基础上进行了改进，以最大程度减少血液污染¹⁰。可靠的脑脊液采集方案将有助于开发基于脑脊液的生物标志物检测方法，可用于辅助疾病诊断，并推动对影响中枢神经系统（CNS）疾病机制的研究。

方案

所有动物实验均按照神经科学学会（美国）和复旦大学（中国上海）伦理委员会的政策进行。本操作适用于非存活手术。

1. 脑脊液采集装置的设置

1. 使用显微拉针仪将玻璃毛细管（内径 0.75 mm，外径 1.0 mm）拉制成针尖（如 Liu et al.¹⁰ 所示； sharpened capillary 参见 图 1）。
2. 将拉制好的玻璃毛细管牢固地插入安装在显微操作仪上的毛细管固定器中（见 图 1A）。
3. 在解剖显微镜下，使用直头镊子轻折毛细管尖端，使其断裂后的内径约为 10–20 µm（见 图 1C）。
4. 将一根细管和注射器连接至毛细管固定器的另一端，并通过三通阀将细管与注射器连接。
5. 转动三通阀至开放位置，推动注射器活塞，使空气从注射器经管道吹入玻璃毛细管，以清除任何污染物，并在毛细管内建立正压。
6. 在最后一次将注射器重新连接至三通阀之前，重复数次断开和重新连接注射器的操作，并在每次连接前将注射器抽吸约 100–200 µL（见 图 1B）。
7. 将带有玻璃毛细管的显微操作仪移至一侧，以避免在小鼠解剖过程中造成损坏。

图1. 显微镜、显微操作仪和毛细管装置。（A）配备毛细管的显微镜与显微操作仪装置，以及（B）连接的注射器和三通阀的近照，用于打开（如图所示）或关闭管路，和（C）用于脑脊液采集的完整（右侧）与断裂（左侧）的毛细管尖端。断裂后，毛细管尖端的内径应为0.75 mm，外径为1.0 mm。请点击此处查看此图的放大版本。

2. 小鼠解剖

1. 麻醉小鼠。
   注意：本实验方案使用 C57BL/6 小鼠和淀粉样前体蛋白/早老素 1（APP/PS1）转基因小鼠（阿尔茨海默病小鼠模型），并以 4% 水合氯醛（溶于 dH₂O）进行麻醉₂0）以每克小鼠体重10 µL的剂量通过腹腔注射。
2. 当小鼠完全麻醉后，需确保其麻醉程度充分。通过轻度伸展后肢并捏压脚趾，观察是否存在回缩反应，以此评估麻醉是否充分。应捏压全部四个肢体进行检查；若无任何反应，则表明小鼠已适当麻醉。使用解剖剪从眼睛上方、耳间区域至颈部底部，剪除并修整小鼠头部背面的毛发。图2A或者，可使用剪毛器或脱毛膏辅助去除毛发。
3. 使用小鼠适配器固定小鼠头部（头部背面朝上，鼻部向下倾斜约 45 °）， 图2A将耳杆固定在小鼠的耳朵与眼睛之间并拧紧。确保小鼠头部无法移动，并通过轻轻下压头部使其牢固固定在适配器中。
4. 在进行手术切口前，需重新检查脚趾夹捏的回缩反应，并在之后定期检查，以确保麻醉深度达到手术要求。术中应密切观察呼吸频率的任何视觉变化，以提示麻醉深度的改变。本短时非存活手术可采用清洁但非无菌的技术。使用剪刀和弯头镊子剪开皮肤及第一层肌肉，直至颅底仅剩一层薄肌肉覆盖。
   注意：在小鼠颈部背部横向切开皮肤，然后在耳朵和眼睛之间的颅骨中线处纵向切开皮肤。随后可将皮肤和组织从枕大池区域拉开并移开。
5. 在解剖显微镜下观察，使用镊子小心地剥离颅底上方最后的薄层肌肉，并将这些肌肉层移至一侧，远离目标区域。若有出血，使用棉签清除并帮助止血。
6. 暴露小脑延髓池处的硬脑膜后（呈三角形，通常有1-2条较大的血管穿过该区域；毛细管插入及脑脊液采集的最佳位置位于血管的任一侧或两血管之间）， 图2B），用湿润的棉签擦拭膜以清洁，然后用干燥的棉签将该区域擦干。

图 2. 小鼠及解剖装置示意图，显示用于脑脊液采集的毛细管插入代表性图像。 准备进行脑脊液提取的小鼠装置，其中（A）头部已剃毛并固定，准备解剖；（B）小脑延髓池硬脑膜覆盖区域的详细图像（10倍视野），虚线箭头显示穿过该区域的血管，实线箭头显示毛细管插入的最佳位置。详细图像（10倍视野）显示：（C）玻璃毛细管锐利尖端对准小脑延髓池硬脑膜；（D）毛细管即将刺穿硬脑膜的瞬间，此时硬脑膜产生一定阻力；（E）毛细管尖端轻敲穿过硬脑膜以采集脑脊液。脑脊液应为透明液体，收集于玻璃毛细管内（点状箭头所示）。每张显微图像右下角的比例尺均代表 100 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

3. 从麻醉小鼠收集脑脊液

1. 将玻璃毛细管对准小鼠头部后方，使尖端刚好位于膜后方，呈约 30–45 °角（图 2C）。
2. 快速推注注射器一次或数次，并将注射器回抽约 100–200 µL（以确保无污染物，并在玻璃毛细管内形成负压）。
3. 使用显微操作器，将毛细管尖端缓慢靠近膜，直至观察到阻力，但不刺破膜（图 2D）。
4. 当毛细管尖端与膜之间出现阻力时，轻敲显微操作器控制装置，使毛细管轻轻穿过膜。通过显微镜观察，可见毛细管尖端刺入小脑延髓池。一旦穿刺成功，脑脊液（CSF）应自动被吸入毛细管内（图 2E）。
5. 让毛细管缓慢收集脑脊液。若脑脊液停止流出，可缓慢回抽注射器少量体积（约 50 µL），以在毛细管内产生更大的负压，促进脑脊液的提取。
   注意：也可使用精细的显微操作器控制装置，缓慢、轻柔地将毛细管从脑组织中拔出，使脑脊液再次流入毛细管。通常收集约 10–15 µL 脑脊液（在毛细管中约 3–4 cm），耗时约 10–30 分钟，偶尔可收集到 20 µL 或更多。虽然并非绝对必要，但建议在脑脊液采集过程中使用加热垫。脑脊液采集在室温（约 23 °C）下进行。
6. 当收集到所需量的脑脊液后，通过旋转三通阀至关闭位置，关闭管路（以停止继续吸取脑脊液）。
7. 取下连接管路的注射器，打开后再关闭管路（以使毛细管、管路及毛细管外部区域的压力达到平衡）。重新将注射器连接至三通阀，但不要推注注射器。
8. 使用显微操作器轻柔地将玻璃毛细管从小鼠体内取出。
9. 将收集管（含 1 µL 20 倍蛋白酶抑制剂的 1.5 mL 微量离心管）置于玻璃毛细管的尖端下方。
10. 打开管路并轻柔推注注射器：脑脊液应从毛细管流出并进入收集管。
11. 采集完成后，立即对脑脊液样本进行短暂离心（使用小型离心机，最大转速脉冲离心 5 秒），使样本与收集管底部的蛋白酶抑制剂充分混合。
    注意：脑脊液样本可分装后于 -80 °C 保存，用于后续分析。其余小鼠组织可继续解剖，用于获取脑和脊髓等其他组织。此时小鼠仍存活，如有需要，也可采集血液。

结果

按照此处所述步骤（图1 和 图2），毛细管中立即采集的脑脊液应为无色透明（图2E），不应呈粉红色或红色。若毛细管中收集的液体出现粉红色至红色，则提示存在血液污染。

作为应用本方法采集的脑脊液（CSF）样本的一个示例，采用ELISA法检测了蛋白淀粉样β（Aβ）的水平。在阿尔茨海默病研究中，通常会检测CSF中Aβ的含量⁷。CSF几乎不含蛋白质。在阿尔茨海默病小鼠模型（APP/PS1小鼠）中，由于这些小鼠过表达人源APP，其CSF中人源Aβ₄₂的水平显著升高。使用本方法采集12月龄小鼠的CSF样本可观察到这一差异（野生型（WT）小鼠CSF中为0 pg/mL，而APP/PS1小鼠CSF中为1,303 pg/mL，<...

讨论

本方案详细描述了一种改进现有脑脊液（CSF）采集方法的技术¹⁰，旨在最大限度减少血液污染，并实现从小鼠中大量采集脑脊液（平均可获得约 10–15 µL）。在折断毛细管尖端时，其尖端 不宜过小（否则脑脊液提取速度会非常缓慢），也不宜过大（否则无法精细采集脑脊液，且组织可能堵塞毛细管）。进行脑脊液采集区域的解剖时应格外小心：任何出血都应予以止住，并用 dH₂O 将玻璃毛细管插入区域的血液清洗干净，以避免样本污染。每只小鼠的解剖结构存在差异，但大多数小鼠在毛细管需插入的区域均有一至两条主要血管穿过。选择正确的插入位置至关重要，若插入位置过于靠近主要血管，则会导致脑脊液被血液污染。如图2所示，应优先选择无血管区域（例如主要血管之间或两侧）进行毛细管插入，以避免污染。若脑脊液未能持续稳定流出并在一段时间后停止，可轻微回抽注射器（约 50 µL）以帮助恢复脑脊液流入毛细管。或者，也可使用显微操作仪缓慢、轻柔地将毛细管略微进出移动，以重新启动脑脊液的提取流程。执行这些操作时必须谨慎，以防血液流入毛细管内。该技术之...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
水合氯醛（用作麻醉剂）	国药集团化学试剂有限公司	30037517	CAS 编号 302-17-0。
解剖剪	66 视界科技	54002
解剖弯头镊	66 视界科技	53072
解剖直头镊	66 视界科技	53070
小鼠适配器（带耳杆）	自制。	N/A	World Precision Instruments 公司提供类似设备。
解剖显微镜	Meiji Labax	型号 15381
显微操作器	World Precision Instruments	M3301
显微操作器磁力底座	Kanetec	MB-K
玻璃毛细管	World Precision Instruments	1B100-4
微量移液器拉制仪	Sutter Instruments	型号 P-1000
注射器（1 ml）	Tansoole	02024692	适用于 1 ml。
微量离心管（1.5 ml）	Axygen	MCT-150-C
蛋白酶抑制剂混合物 III（无 EDTA）	Calbiochem	539134
人 Aβ42 ELISA 试剂盒	Invitrogen	KHB3441
管道（聚四氟乙烯管）	World Precision Instruments	MMP-KIT	取自显微注射套件，并连接至毛细管固定器和注射器。
小型离心机	天根生化科技	OSE-MC8
棉签	可从任意日用品商店或药店获取。	N/A