Drosophila Eierstock ist ein hervorragendes Modell für Stammzell-Nische Entwicklung zu studieren. Obwohl Methoden für die Larven und adulten Eierstöcke sezieren veröffentlicht wurden, erfordern pupal Eierstock Sezierungen verschiedene Techniken, die nicht im Detail veröffentlicht wurden. Hier beschreiben wir ein Protokoll zum sezieren, Beizen und Montage pupal Eierstöcke.
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Methodenartikel
Präparation und Färbung von Drosophila Pupal Eierstöcke
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Im Gegensatz zu Erwachsenen Drosophila Eierstöcke pupal Eierstöcke sind relativ schwierig zu untersuchen, aufgrund ihrer geringen Größe, Transluzenz und einem pupal Fall umschließt. Die Herausforderung sezieren pupal Eierstöcke liegt auch in ihrem physischen Standort innerhalb der Puppe: die Eierstöcke sind umgeben von Fetten Körperzellen innerhalb der pupal Abdomen, und diese Fettzellen entleert werden, um korrekte Antikörper Färbung zu ermöglichen. Um diesen Herausforderungen zu begegnen, nutzt dieses Protokolls angepasste Pasteur Mehrkanalpipette um Fett Körperzellen vom pupal Abdomen zu extrahieren. Darüber hinaus einer gekammerten Deckglas anstelle von einem Microcentrifuge Schlauch bei der Färbung dient zur Verbesserung der Sichtbarkeit der Puppen. Trotz dieser und andere Vorteile der in diesem Protokoll verwendeten Werkzeuge, kann erfolgreiche Durchführung dieser Techniken noch mehrere Tage der Praxis aufgrund der geringen Größe der pupal Eierstöcke beinhalten. In diesem Protokoll beschriebenen Techniken könnte zur Zeit Kurs Experimente gelten in denen Eierstöcke in verschiedenen Entwicklungsstadien pupal analysiert werden.
Einleitung
Stammzellenforschung mit Drosophila Eierstöcke hat seit der ersten Dokumentation einer Stammzelle Nische1,2,3,4weit ausgebaut. Nach der Entwicklung der Linie Ablaufverfolgung genetische Werkzeuge, Drosophila Eierstock, die Sezierungen häufig verwendet wurden, um die Stammzell-Linien zu studieren und Signalwege, die Stammzell-Wartung, Verbreitung und Schicksal in der Stammzellnische regulieren. Kenntnisse über diese Signalwege kann Einblicke in mögliche Ursachen von Krebserkrankungen hervorbringen, die von aberranten Stammze....
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Protokoll
(1) EggLaying
- Kombinieren Sie etwa zehn männlichen und 15 weiblichen Erwachsenen Drosophila -fliegen des gewünschten Genotyps in ein Fläschchen mit normalen reichen fliegen Lebensmittel mit Hefe ergänzt. Um zu vermeiden, Überbelegung der Durchstechflasche, ermöglichen Sie begatteten Weibchen zur Eiablage nicht länger als 2 – 4 h14.
- Übertragen Sie die Erwachsenen aus dem Fläschchen in ein neues Fläschchen durch Tippen auf das Fläschchen öffnen gegen ein anderes Fläschchen mit fliegen Essen. Lassen Sie die Eiern, Larven bei Raumtemperatur für 3 – 4 Tage zu entwickeln.
2. Auswahl der wei....
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Ergebnisse
Erfolgreiche Ausführung dieser Prozedur sollte führen klar Antikörper Färbung, die die Struktur und die zelluläre Organisation eine Drosophila pupal Eierstock offenbart. Immunohistochemistry dieses Protokolls lässt sich Zelltypen häufig gebeizt in Larven und Erwachsenen Eierstöcke zu identifizieren. Zellen des pupal Stiels abgeleitet Schwarm Zellen18 (beschrieben von Fasciclin III in weiß) sind in Abbildung 3dargestellt. Neben.......
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Diskussion
Der kritische und schwierige Schritt dieses Protokolls beinhaltet die Vorbereitung der pupal Eierstöcke vor der Fixierung. Um sicherzustellen, dass die Eierstöcke, kleine und begraben durch Fett Körperzellen in den pupal Bauch ausreichend mit Antikörpern gefärbt sind, ist es wichtig, nicht nur eine große Öffnung in der abdominalen Plünderung mit der Pinzette zu reißen, sondern auch extrahieren die fetten Körperzellen, die behindern die Eierstöcke aus der Antikörper. Erfolgreiche Durchführung dieses Schritts erfordert die.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.
Danksagungen
Diese Forschung wurde unterstützt durch die National Institutes of Health (RO1 GM079351, DK). Wir danken für ihre hilfreichen Ratschläge auf pupal Eierstock Sezierungen basierend auf ihrem ursprünglichen Protokoll Dorothea Godt. Wir danken auch Amy Reilein für ihre Hilfe und Kommentare auf das Manuskript.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Dumont #5 Pinzette, Biologie | Feine wissenschaftliche Werkzeuge | 11252-20 | |
| Nunc Lab-Tek Kammer-Deckglas | Thermo Fisher Scientific | 155383 | |
| Dissektionsmikroskop | Nikon | SMZ-10A | |
| Konfokales Mikroskop | Carl Zeiss | LSM 700 | |
| Analysesoftware | Carl Zeiss | Zen | |
| 9 Depression Glas Spot Platten | Pyrex | 7220-85 | |
| Pasteur Pipette | Fisher Scientific | 13-678-6B | |
| Pasteur Pipettenbirne | Verschiedene Anbieter Bunsenbrenner | ||
| Verschiedene Anbieter | |||
| Fisherfinest Premium Frosted Mikroskop Objektträger | Thermo Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| 22 x 22 mm Glas Deckgläser Nr. 1 | VWR | 48366-067 | |
| Dapi Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Doppelseitiges Klebeband | Scotch | ||
| Nutator | Clay Adams | ||
| Feiner Pinsel #0, #3-#5 | Verschiedene Anbieter | ||
| Gilson Pipetman Starter Kit | Thomas Scientific | F167300 | Enthält p20, p200, p1000 Pipettierer |
| 16% Paraformaldehyd | Elektronenmikroskopie | Sciences 15710 | Verdünnen auf 4% Paraformaldehyd in 1x PBS |
| Triton | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| 10x PBS | Ambion | AM9624 | Verdünnen auf 1x PBS |
| Normales Ziegenserum | Jackson ImmunoResearch | 5000121 | Verdünnen auf 10% Normales Ziegenserum in PBST mit 0,5% Tritonkonzentration |
| Primäre Antikörper (im Protokoll: 7G10 Anti-Fasciclin III verdünnt 1:250, Kaninchen Anti-Phosphohiston H3 verdünnt 1:1000) | Verschiedene Anbieter (im Protokoll: Developmental Studies Hybridoma Bank, Millipore) | Verdünnt in PBST mit 0,5% Tritonkonzentration | |
| Sekundäre Antikörper (im Protokoll: Alexa-546, FITC-konjugiertes Anti-Kaninchen-Serum) | Verschiedene Anbieter (im Protokoll: Molecular Probes, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) | Verdünnung in PBST mit 0,5 % Tritonkonzentration | |
| Fläschchen | Denville Scientific | V9406 | |
| Wattebällchen, für breite Fläschchen | Genesee Scientific | 51-102W | |
| Hefe, Bakers Dried Active | MP Biomedicals | 101400 | |
| Fliegenfutter | Im Labor | hergestelltGemisch aus Wasser, Bierhefe, Maismehl, Melasse, Agar, EtOH, Penicillin, Methyl-4-hydrobenzoat und Propionsäure | |
| Männliche und weibliche Drosophila Fliegen (im Protokoll verwendeter Genotyp: yw; P[Fz3-RFP, w+]/TM2) | Bloomington Drosophila Lager Zentrum |
Referenzen
- Losick, V., Morris, L., Fox, D., Spradling, A. Drosophila Stem Cell Niches: A Decade of Discovery Suggests a United View of Stem Cell Regulation. Dev Cell. 21 (1), 159-171 (2011).
- Kirilly, D., Xie, T. The Drosophila ovary: an active stem cell community. Cell Res. 17 (1), 15-25 (2007).
- Dansereau, D. A., Lasko, P.
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Nachdrucke und Genehmigungen
