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Immunology and Infection

इमेजिंग रिपोर्टर एंजाइम प्रतिदीप्ति के साथ चूहों में माइकोबैक्टीरियम तपेदिक

Published: February 26, 2018 doi: 10.3791/56801
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&M Health Science Center, 2Tuberculosis Research Section, Laboratory of Clinical Infectious Diseases, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health
* These authors contributed equally

Summary

हम रिपोर्टर एंजाइम प्रतिदीप्ति (रेफरी) का उपयोग माइकोबैक्टीरियम तपेदिक (एम. तपेदिक) से संक्रमित चूहों के ऑप्टिकल इमेजिंग का वर्णन । इस प्रोटोकॉल रोगजनन, चिकित्सकीय और वैक्सीन अनुसंधान के लिए पूर्व नैदानिक पशु मॉडलों में एम. तपेदिक के संवेदनशील और विशिष्ट पता लगाने की सुविधा ।

Abstract

रिपोर्टर एंजाइम प्रतिदीप्ति (REF) प्रतिदीप्ति या bioluminescence द्वारा इमेजिंग या पता लगाने के लिए ब्याज की लक्ष्य जीवों में मौजूद एंजाइमों के लिए विशिष्ट हैं कि सब्सट्रेट का उपयोग करता है. हम BlaC, एक एंजाइम सभी एम. तपेदिक उपभेदों द्वारा constitutively व्यक्त का उपयोग । रेफरी संक्रमित चूहों के फेफड़ों में बैक्टीरिया की तेजी से ठहराव की अनुमति देता है । चूहों के एक ही समूह कई समय बिंदुओं पर imaged किया जा सकता है, बहुत लागत को कम करने, बैक्टीरिया और अधिक तेजी से गणना, मेजबान में उपंयास टिप्पणियों-रोगज़नक़ बातचीत की अनुमति है, और बढ़ती सांख्यिकीय शक्ति, के बाद से अधिक जानवरों के समूह के प्रति आसानी से बनाए रखा है . रेफरी अत्यंत BlaC एंजाइमी रिपोर्टर और कस्टम flourescence अनुनाद ऊर्जा स्थानांतरण (झल्लाहट) या fluorogenic इस्तेमाल किया सब्सट्रेट के कारण विशिष्ट के उत्प्रेरक प्रकृति के कारण संवेदनशील है । रेफरी रिकॉमबिनेंट उपभेदों की आवश्यकता नहीं है, सामांय मेजबान-रोगज़नक़ बातचीत सुनिश्चित करने । हम ८०० एनएम में अधिक से अधिक उत्सर्जन के साथ एक झल्लाहट सब्सट्रेट का उपयोग कर एम. तपेदिक संक्रमण के इमेजिंग का वर्णन । सब्सट्रेट के तरंग दैर्ध्य संवेदनशील स्तनधारियों में गहरी ऊतक इमेजिंग की अनुमति देता है । हम M. तपेदिक, चूहों के संज्ञाहरण, रेफरी सब्सट्रेट के प्रशासन, और ऑप्टिकल इमेजिंग के साथ चूहों के एयरोसोल संक्रमण की रूपरेखा होगी । इस विधि का मूल्यांकन करने के लिए सफलतापूर्वक लागू किया गया है-रोगज़नक़ बातचीत और एंटीबायोटिक दवाओं की प्रभावकारिता एम. तपेदिकलक्ष्यीकरण ।

Introduction

एम. क्षयरोग की धीमी वृद्धि दर तपेदिक1,2,3के तेजी से निदान में एक प्रमुख अंधी गली है । जबकि संस्कृति आधारित निदान सप्ताह के परिणाम का उत्पादन करने के लिए लेता है, एसिड-तेजी धब्बा4 बच्चों में नैदानिक सीमाएं हैं5 और रोगियों सह मानव इम्यूनो वायरस6,7के साथ संक्रमित. ऑप्टिकल इमेजिंग प्रौद्योगिकियों को हाल ही में तपेदिक8,9के लिए पारंपरिक नैदानिक तरीकों के लिए एक विकल्प के रूप में मांयता प्राप्त किया गया है । प्रतिदीप्ति और bioluminescence ऑप्टिकली छवि के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है एम वास्तविक समय में जीवित पशुओं में तपेदिक 10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19. ऑप्टिकल इमेजिंग एम. तपेदिक20,21,22के साथ एक संक्रमण के एक तेजी से और विशिष्ट आकलन का लाभ है ।

हम रेफरी का उपयोग लाइव चूहों में एम. तपेदिक की ऑप्टिकल इमेजिंग के लिए विवरण रूपरेखा । इस विधि बहुत विशिष्ट है और संवेदनशील23,24 और, अंय ऑप्टिकल तरीकों के समान, तपेदिक (टीबी) इमेजिंग25, गणना टोमोग्राफी सहित (सीटी)26, चुंबकीय के अंय तरीकों की तुलना में कम खर्चीला है अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई)27, और f-fluorodeoxyglucose पोजीट्रान उत्सर्जन टोमोग्राफी/सीटी (एफ FDG पीईटी/सीटी)28। रेफरी कस्टम फ्लोरोसेंट या bioluminescent सब्सट्रेट का उपयोग करता है कि एक जीवाणु एंजाइम द्वारा दरार पर, एक फ्लोरोसेंट उत्पाद8,29का उत्पादन । इसलिए, यह एक रिकॉमबिनेंट माइक्रोबैक्टीरियल रिपोर्टर तनाव30,31की आवश्यकता नहीं के लाभ है । झल्लाहट सब्सट्रेट वर्णित एक fluorochrome और एक β-लस्टम अंगूठी है कि BlaC द्वारा hydrolyzed (β-lactamase) द्वारा जुड़ा एक शमन, स्वाभाविक रूप से तपेदिक द्वारा व्यक्त constitutively-परिसर माइकोबैक्टीरियम8के शामिल है, ३२. बैक्टीरिया सीधे रेफरी उत्प्रेरक गतिविधि है कि परिमाण के कई आदेशों और एम. तपेदिकके प्रति संवेदनशील का पता लगाने के प्रवर्धन की अनुमति देता है के कारण संकेत उत्पंन करते हैं ।

इस अध्ययन में इस्तेमाल किया रेफरी सब्सट्रेट रहते जानवरों में उत्कृष्ट ऊतक पैठ है और अपनी लंबी तरंग दैर्ध्य के कारण कम पृष्ठभूमि. के साथ इस लंबी तरंग दैर्ध्य सब्सट्रेट यह के लिए पता लगाने की एक दहलीज को प्राप्त करने के लिए संभव है लगभग १०० कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFU) इन विट्रो में और < 1000 CFU vivo में चूहों के फेफड़ों में (पूरे पशु)8, ३३. रेफरी थूक के लिए एक नैदानिक उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, नैदानिक सामग्री और भी सीधे माइक्रो इंडोस्कोपिक सिस्टम के साथ रोगियों में16,३२,३३,३४ कारण अपनी उच्च संवेदनशीलता और विशिष्टता । रेफरी किसी भी तपेदिक नैदानिक तनाव को लागू किया जा सकता है, क्योंकि यह एक स्वाभाविक रूप से उत्पादित बैक्टीरियल एंजाइम, BlaC का उपयोग करता है, सभी उपभेदों में मौजूद पता लगाने के लिए । इन विशेषताओं रेफरी इमेजिंग पूर्व में एक मूल्यवान उपकरण नैदानिक तपेदिक अनुसंधान सामांय में चिकित्सीय और वैक्सीन मूल्यांकन की सुविधा के रूप में के रूप में अच्छी तरह से रोगजनन का विश्लेषण करना है, लेकिन यह भी अंततः तपेदिक में निदान के लिए लागू किया जा सकता है मरीज.

Protocol

पशु अध्ययन दिशानिर्देश और विनियमों के अनुसार संस्थागत पशु देखभाल और टेक्सास के एक और एम विश्वविद्यालय के उपयोग समिति द्वारा निर्धारित किया गया । अपने संस्थान में किसी एक जोखिम सुरक्षा अधिकारी या समिति से समीक्षा और अनुमोदन की आवश्यकता हो सकती है ।

चेतावनी: सभी प्रक्रियाओं BSL3 रोकथाम की आवश्यकता होती है । कर्मियों को हर समय व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरण पहनना जरूरी होता है । सभी जोड़तोड़ के अंदर किया जाता है-सुरक्षा कैबिनेट (बीएससी) और सभी sharps sharps कंटेनरों में निपटारा कर रहे हैं । काम सतहों और बीएससी काम शुरू करने और काम के बाद से पहले buffered phenol और ७०% इथेनॉल के साथ साफ कर रहे हैं । प्रक्रियाओं आम तौर पर माइकोबैक्टीरियम तपेदिकके साथ सुरक्षा 3 स्तर पर किया जाएगा, लेकिन चित्रण और फिल्मांकन प्रयोजनों के लिए, लेखकों कम विषमय बैक्टीरिया के साथ सुरक्षा स्तर 2 पर इन प्रक्रियाओं का प्रदर्शन ।

1. उपभेदों और संस्कृति की स्थिति

नोट: एम. क्षयरोग तनाव CDC1551 का प्रयोग इस अध्ययन में किया जाता है, लेकिन किसी भी एम. तपेदिक तनाव का उपयोग इसी तरीके से किया जा सकता है.

  1. एम-OADC-TW (7H9 शोरबा ०.५% ग्लिसरॉल, ओलिक के बिना 10% डेक्सट्रोज एसिड catalase परिसर के साथ पूरक, और ०.०५% के बीच-८०) के माध्यम से ३७ ° c में खड़े बैक्टीरिया के बढ़ने के एक आयुध डिपो ६०० के एक ओडी०.५ (~ ०.२ x 107 CFU) ।
  2. M-OADC-TW (जीवाणुओं की 1:10 कमजोर पड़ने की श्रृंखला) में संस्कृति को पतला करना । प्लेट जीवाणुओं के कमजोर पड़ने (105, 106, 107, 108) तपसिल में चयनात्मक 7H11 प्लेटों पर CFU के निर्धारण की अनुमति देने के लिए.
  3. ३७ डिग्री सेल्सियस पर चार सप्ताह के लिए प्लेटें या जब तक कालोनियों सही गिना जा सकता है ।
  4. एक गोली प्राप्त करने के लिए 5 मिनट के लिए ८,५३४ x g पर बैक्टीरियल इनोक्युलम केंद्रापसारक । खारा (०.९% NaCl) के 10 मिलीलीटर के साथ एक बार गोली धोने और खारा के 15 मिलीलीटर (०.९% NaCl) में गोली फिर से निलंबित ।

2. एक मैडिसन चैंबर का उपयोग कर चूहों के एयरोसोल संक्रमण

  1. चूहों को एक सप्ताह के लिए नए परिवेश को acclimate की अनुमति दें ।
  2. उंहें चैंबर में लोड करने से पहले चूहों तौलना ।
  3. बिजली पट्टी में तीन रस्सियों प्लग: मुख्य चैंबर शक्ति, वैक्यूम पंप, और हवा कंप्रेसर, उस क्रम में ।
  4. ध्यान से ग्लास जार unपंगा लेना । इस सुरक्षा कैबिनेट के लिए ग्लास जार लाओ और चैलेंज इनोक्युलम खारा (०.९% NaCl) के 15 मिलीलीटर में निलंबित जोड़ने के लिए ~ 104 -फेफड़ों में बैक्टीरिया की 106 CFU प्राप्त करने के लिए ।
  5. बंद करो, के लिए सुरक्षा कैबिनेट में ग्लास जार के ढक्कन । छिटकानेवाला इकाई को जार संलग्न करें और ऊर्ध्वाधर स्टेनलेस स्टील ट्यूब को समायोजित करें ताकि कम (सेवन) अंत जार में द्रव के स्तर के नीचे एक इंच के एक चौथाई के बारे में है ।
  6. प्रयोग के लिए आवश्यक सभी जानवरों को लोड (चैंबर ९० चूहों को पकड़ कर सकते हैं) कक्ष में और दरवाजे पर सभी कुंडों को बंद करें ।
  7. मुख्य (कक्ष) हवा का प्रवाह मीटर की जांच करें । यह सुनिश्चित करें कि फ्लोट (गेंद) के केंद्र के बारे में ५० L/मिनट रन के रूप में छोड़ दिया पर पैमाने पर मापा ।
  8. चैंबर के नियंत्रण कक्ष पर प्रारंभ बटन दबाएँ. कंप्रेसर एयर फ्लो मीटर के माध्यम से airflow दर सेट (बाएं में छोटे मीटर) पैमाने पर के रूप में 4 एल/ नेत्रहीनों को यह सुनिश्चित करने के लिए जांचें कि चैलेंज इनोक्युलम nebulized किया जा रहा है ।
  9. 15 मिनट के बाद, जब नियंत्रण कक्ष के मोर्चे पर लाल बत्ती प्रकट होती है और एक श्रव्य संकेत रन के अंत को इंगित करता है, टाइमर रीसेट करने के लिए नियंत्रण कक्ष के निचले दाएँ कोने पर रीसेट बटन दबाएँ.
  10. चैंबर के दरवाजे पर छोटे लाल बटन नीचे पकड़ो वैक्यूम जारी करने के लिए ।
  11. चैंबर का दरवाजा खोलो और जानवरों को हटा दें । चूहों को वापस अपने पिंजरों में रखें ।
  12. एक सील, रिसाव प्रूफ परिवहन कंटेनर में ग्लास छिटकानेवाला जार और जगह निकालें । कंटेनर को बायो-सेफ्टी कैबिनेट के अंदर रखें और चैलेंज सस्पेंशन को नामित अपशिष्ट कंटेनर में छोड़ें ।
  13. एक खतरा बैग के अंदर इस्तेमाल किया छिटकानेवाला जार प्लेस और आटोक्लेव के लिए परिवहन के लिए बैग सील ।
  14. संक्रमण की प्रक्रिया के अंत में, बफर phenol और ७०% इथेनॉल के साथ चैंबर के अंदर स्प्रे और चैंबर 10 मिनट के लिए बैठने के लिए अनुमति देते हैं ।
  15. फिर, सभी सुलभ इंटीरियर सतहों बहुत अच्छी तरह से पोंछ । सभी दूषित कागज तौलिए के निपटान, आदि। में है । आटोक्लेव कचरा, अपशिष्ट कंटेनर और इस्तेमाल छिटकानेवाला जार ।
  16. इमेजिंग समय-बिंदु तक पशुओं को संस्थापन कक्ष में वापस रखें ।
  17. इमेजिंग के दिन, एक द्वितीयक कंटेनर में जानवरों को इमेजिंग कमरे में स्थानांतरित ।

3. पशु संज्ञाहरण

  1. एक स्वनिर्धारित गैस संज्ञाहरण प्रणाली का उपयोग isoflurane के साथ चूहों Anesthetize ।
  2. संज्ञाहरण इकाई के शीर्ष पर स्थित दो चारकोल फिल्टर कनस्तर के प्रत्येक वजन ।
  3. एक नए कनस्तर के साथ बदलें अगर वजन ५० ग्राम प्रारंभिक वजन से ऊपर है ।
  4. प्रक्रिया के लिए पर्याप्त isoflurane सुनिश्चित करने के लिए vaporizer इकाई की जांच करें ।
  5. नाक कोन धारक को इमेजिंग चैंबर के अंदर रखें । प्रक्रिया के लिए आवश्यक नाक शंकु की संख्या प्लेस और नाक शंकु ब्लॉकर्स के साथ शेष उद्घाटन सील ।
  6. उच्च दबाव सिलेंडर से ऑक्सीजन की आपूर्ति पर बारी और यह ५५ साई पर सेट ।
  7. संज्ञाहरण इकाई के सामने स्थित निकासी पंप पर बारी और 8 एल के लिए निर्धारित/
  8. संज्ञाहरण इकाई के सामने स्थित ऑक्सीजन टॉगल चालू करें ।
  9. संज्ञाहरण प्रेरण चैंबर के लिए गैस के प्रवाह को चालू करने के लिए गैस का प्रवाह निर्धारित करने के लिए १.५ L/गैस का प्रवाह बंद कर दें ।
  10. गैस के प्रवाह को इमेजिंग चैंबर पर चालू करने के लिए ०.२५ L/मिनट पर गैस का प्रवाह निर्धारित करें । गैस का प्रवाह बंद कर दें ।
  11. isoflurane vaporizer पर मुड़ें और इसे 2-२.५% पर सेट करें । संख्या और जानवरों के वजन के अनुसार isoflurane स्तर को समायोजित isoflurane vaporizer पर डायल घूर्णन द्वारा प्रयोग के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है (2-२.५% एक माउस के लिए वजन ~ 20 जी; एक गिनी पिग ३०० ग्राम वजन के लिए 4%) ।
  12. संज्ञाहरण कक्ष में चूहों प्लेस और ढक्कन बंद । संज्ञाहरण प्रेरण चैंबर के लिए गैस के प्रवाह को चालू करें ।
  13. पूरी तरह से anesthetized जब तक 5-10 मिनट के लिए संज्ञाहरण प्रेरण चैंबर में चूहों को छोड़ दें ।
  14. एक बार चूहे anesthetized हैं, आंखों के लिए एक ऑप्टिकल मरहम लागू करने के लिए उंहें बचाने के इमेजिंग जबकि ।
  15. ventral या स्टर्नल recumbency में चूहों इस तरह की है कि उनकी नाक नाक शंकु में रखा गया है इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान चूहों के संज्ञाहरण की सुविधा के लिए जगह है ।

4. रिपोर्टर एंजाइम प्रतिदीप्ति (रेफरी) इमेजिंग

  1. intraperitoneal इंजेक्शन के साथ ही नियंत्रण चूहों में सब्सट्रेट (20 µ m, २.५ µ l/वजन के एल/ चूहे के लिए इमेजिंग चैंबर के अंदर संज्ञाहरण के तहत कर रहे है से कम 1 मिनट ।
  2. इमेजिंग सिस्टम प्रारंभ करें ।
  3. प्रारंभ पर क्लिक करके सिस्टम प्रारंभ करें । रुको जब तक तापमान बार हरे रंग के लिए बदल जाता है ।
    नोट: इमेजिंग चैंबर एक गर्म मंच के होते हैं, जबकि इमेजिंग जानवर के शरीर का तापमान बनाए रखने के लिए ।
  4. इमेजिंग अधिग्रहण सेटिंग के लिए, चुनें फ्लोरोसेंट । पूरे पशु या महामारी-फेफड़ों के ऊतकों, संरचना और अधिग्रहण नियंत्रण कक्ष में ओवरले के लिए रोशनी के लिए ट्रांस-प्रदीप्ति ।
  5. उच्च करने के लिए एकल माउस और लैंप स्तर के लिए बी के लिए दृश्य के क्षेत्र सेट करें ।
  6. ऑटो, मीडियम बिन्नी के लिए जोखिम समय निर्धारित करें, 2-3 के लिए f/stop, और उत्तेजना फ़िल्टर ७४५ एनएम और उत्सर्जन फिल्टर पर ७८० एनएम से ८४० एनएम के लिए ।
  7. अनुक्रम सेटअप के लिए, अनुक्रम सेटअप पर क्लिक करें, फेफड़ों के क्षेत्र में 9-12 ट्रांस-प्रदीप्ति अंक चुनें ।
  8. छवि अधिग्रहण के लिए अधिग्रहण पर क्लिक करें ।
  9. माउस पिंजरे के बाद में वापस प्लेस-इमेजिंग ।
  10. जब तक पूरी तरह से बरामद या CFU को बढ़ाता है, तो एक समय प्रयोग के बिंदु पर इमेजिंग के लिए बलिदान चूहों की निगरानी । अच्छी तरह से चूहों के बाद इमेजिंग की निगरानी करने के लिए एक संशोधित Karnofsky स्कोर निष्पादित करें ।

5. रेफरी इमेजिंग का विश्लेषण

  1. इमेजिंग सॉफ़्टवेयर खोलें ।
  2. ब्राउज़ करें आइकन पर क्लिक करके छवि फ़ाइलें लोड ।
  3. वर्णक्रमीय मिश्रण के लिए, उपकरण पैलेट में वर्णक्रमीय ununmix पर क्लिक करें और स्पेक्ट्रा के लिए आवश्यक क्लिक करें । शुरू में मिश्रण पर क्लिक करें ।
  4. ऑप्टिकल सतह पुनर्निर्माण के लिए, सतह स्थलाकृति पर क्लिक करें ।
  5. पृष्ठ के लिए ओरिएंटेशन का चयन करें, फर माउस के अधीन है और, सतह उत्पंन क्लिक करें ।
  6. फसल छवि ड्रा और ब्याज के एक क्षेत्र के लिए सीमा छवि सेट करें । पूर्ण क्लिक करें ।
  7. अंग पंजीकरण के लिए, 3 डी ऑप्टिकल उपकरण ड्रॉपडाउन मेनू में पंजीकरण टैब पर जाएं ।
  8. एक अंग एटलस में ब्याज के अंगों रजिस्टर ।
  9. /बंद पैनल पंजीकरण उपकरण पर स्थित रूपांतरण उपकरण का उपयोग कर उत्पन्न सतह स्थलाकृति के लिए अंग आकार या स्थान को समायोजित करें ।
  10. फ्लोरोसेंट टोमोग्राफी (फ्लिट) 3 डी पुनर्निर्माण के लिए जाओ, और का चयन करें विश्लेषण टैब । विश्लेषण, छवि प्रकार के लिए सामान्यीकृत संचरण प्रतिदीप्ति (NTF) दक्षता, क्लिक करें प्रारंभ करने के लिए शामिल किया जा करने के लिए छवियों का चयन ।
  11. सभी का चयन करें और डेटा पूर्वावलोकन टैब में पुनर्निर्मित करें पर जांचें ।
  12. प्रतिदीप्ति ठहराव के लिए, ब्याज के क्षेत्र में जाएं (roi) टूल, ROI क्यूब को रुचि के अंग में जोड़ें और रुचि के अंग को कवर करने के लिए क्यूब आकार को समायोजित करें. मापने 3d ROIs पर क्लिक करें ।
  13. रॉय माप विंडो में, 3 डी roi माप पर जाएँ, स्रोत voxels और माप इकाई के लिए डेटा प्रकार का चयन करें pmolM-1cm-1.
  14. एक आंकड़ा या डेटा फ़ाइल में फ्लिट 3d पुनर्निर्माण विश्लेषण के परिणाम को सहेजें और/

6. CFU द्वारा जीवाणुओं का ठहराव

  1. ०.१ एमएल pentobarbital सोडियम (३९० मिलीग्राम/एमएल) के intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा चूहों को Euthanize ।
  2. कोई पलटा प्रतिक्रिया सुनिश्चित करने के लिए चूहों के पैरों के पैड निचोड़ द्वारा पेडल पलटा के लिए जाँच करें ।
  3. Explant बाँझ संदंश और कैंची का उपयोग चूहों से फेफड़ों के ऊतकों को. Homogenize 1 मिलीलीटर में फेफड़ों के ऊतकों को 1x फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) ।
  4. बाँझ 1x पंजाब में फेफड़ों homogenate के 10 गुना धारावाहिक कमजोर पड़ने बनाओ ।
  5. चढ़ाना, के लिए स्पॉट तीन aliquots की 20 µ l प्रत्येक पर संबंधित कमजोर पड़ने की थाली आगर ।
  6. ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में प्लेटें मशीन और बैक्टीरियल विकास के लिए निगरानी ।
  7. मात्रा और कमजोर पड़ने के लिए निंनलिखित समीकरण का उपयोग करके CFU/एमएल के रूप में व्यक्त की मशीन समय और एक्सप्रेस के बाद प्रत्येक स्थान में कालोनियों गिनती:
    CFU/एमएल = (सी/वी) एक्स एम
    जहां सी = कॉलोनी मायने रखता है प्रति स्थान, V = प्रत्येक प्लेट (एमएल) पर नमूना inoculated की मात्रा, और एम = गुणा फैक्टर (इस्तेमाल कमजोर पड़ने के पारस्परिक) ।
    नोट: यदि 11 कालोनियों में एक नमूना मात्रा के लिए एक स्थान में गिना जाता है ०.००२ एमएल के एक नमूना कमजोर पड़ने पर 10-4, समीकरण का उपयोग कर, कॉलोनी गिनती के रूप में गणना की जाएगी
    (11/0.02) x 104 = ५.५ x 106 CFU/एमएल

Representative Results

के साथ संक्रमित चूहों के रेफरी इमेजिंग एम. तपेदिक संक्रमित नियंत्रण माउस के साथ साथ चित्रा 1एमें दिखाए जाते हैं । संक्रमित चूहों एक महत्वपूर्ण उत्पादन (पी = ०.००५७) फेफड़ों से अधिक प्रतिदीप्ति संकेत 6 सप्ताह के बाद में संक्रमण सब्सट्रेट प्रशासन पर नियंत्रण की तुलना में. एक विशिष्ट समय पाठ्यक्रम के खिलाफ चिकित्सीय प्रभावकारिता का अध्ययन करने के लिए एम. तपेदिक रेफरी का उपयोग कर इमेजिंग हो सकता है सप्ताह में 1, 2, 4, 6, 15, 24 के बाद संक्रमण । प्रतिदीप्ति तीव्रता फेफड़े के ऊतकों (चित्रा 1बी) के लिए महामारी-रोशनी का उपयोग कर quantified है । 2 सप्ताह से लगातार बढ़ती संकेत संक्रमित चूहों के फेफड़ों में 6 सप्ताह के लिए पता चलता है कि रेफरी सफलतापूर्वक vivo में एम. तपेदिकका पता लगाने में सक्षम है । एक बाद में समय बिंदु पर नियंत्रण चूहों की पृष्ठभूमि संकेत में एक बूंद (चित्रा 1बी) के शरीर में वृद्धि के लिए जिंमेदार ठहराया जा सकता है और चूहों की मात्रा में 6 सप्ताह की अवधि से अधिक इस प्रकार उत्तेजना तरंग दैर्ध्य पैठ को कम करने । M. तपेदिक से संक्रमित चूहों में प्रतिदीप्ति स्रोतों के 3d फ्लिट पुनर्निर्माण चित्रा 2एमें प्रतिनिधित्व किया है । छवि दृश्यों एकाधिक ट्रांस में प्राप्त कर रहे है-दीप्ति अंक माउस में एक ही उत्तेजना और उत्सर्जन फिल्टर की श्रृंखला का उपयोग कर । ये छवि दृश्यों तो पशु विषय के भीतर फ्लोरोसेंट स्रोत वितरण के लिए 3 डी फ्लिट पुनर्निर्माण के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं । चित्र 2 A-D फेफड़ों के अंग पंजीकरण के साथ माउस टोमोग्राफी के विभिंन दिशाओं (राज्याभिषेक, sagittal और transaxial) को दर्शाता है । पुनर्निर्माण की गुणवत्ता की जांच के लिए NTF दक्षता नक्शे चित्रा 2ईमें प्रतिनिधित्व कर रहे हैं । NTF तटस्थ घनत्व फिल्टर के साथ कब्जा कर लिया एक अतिरिक्त छवि के माध्यम से ट्रांस विदीप्ति छवियों से पृष्ठभूमि प्रकाश रिसाव को घटाकर अनुमति देता है । विशिष्ट उत्तेजना फ़िल्टर के साथ लिया छवि (चित्रा 2ई मापा) संचरण छवि के लिए सामान्यीकृत है एक ही उत्सर्जन फिल्टर और एक खुला उत्तेजना फिल्टर (चित्रा 2ई नकली) के साथ मापा देने के लिए सब्सट्रेट अकेले द्वारा उत्पादित संकेत. दोनों क्षैतिज (चित्रा 2एफ) और ऊर्ध्वाधर (चित्रा 2जी) प्रोफाइल में लगभग 0% प्रतिशत त्रुटि (चित्रा 2ई-% त्रुटि) के साथ समान मापा और नकली NTF दक्षता प्रोफ़ाइल कम कलाकृतियों और बेहतर संकेत स्थानीयकरण और संवेदनशीलता के साथ एक अच्छी गुणवत्ता 3 डी पुनर्निर्माण का सबूत प्रदान करता है ।

Figure 1
चित्र 1 . रेफरी के साथ एम. तपेदिक की इमेजिंग । (एक) vivo इमेजिंग में चूहों के संक्रमित और M. तपेदिक से संक्रमित 2, 4, और 6 सप्ताह के बाद संक्रमण । रंग बार कम (पीले) से उच्च (लाल) के लिए प्रति सेकंड प्रति सेमी फोटॉनों में फ्लोरोसेंट संकेत की तीव्रता का प्रतिनिधित्व करता है । (ख) एम. क्षयरोगसे संक्रमित चूहों से प्रतिदीप्ति तीव्रता का ठहराव. दोनों नियंत्रण के लिए प्रतिदीप्ति मूल्यों (काला) और संक्रमित (लाल) प्रत्येक समय बिंदु के लिए मानक त्रुटि के साथ प्रतिनिधित्व कर रहे हैं । परिणामों का महत्व छात्रों द्वारा निर्धारित किया गया था t-परीक्षण, < 0.05 के p मानों को महत्वपूर्ण माना गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 . 3 डी फ्लिट चूहों में प्रतिदीप्ति स्रोतों के पुनर्निर्माण से संक्रमित एम. क्षयरोग. माउस टोमोग्राफी अलग दिशाओं में प्रतिनिधित्व किया; अ) राज्याभिषेक, ब) sagittal, व C) transaxial D) लंग अंग नोंदणी. ब्याज की 3 डी क्षेत्र (रॉय) स्रोत माप के लिए फेफड़ों में एक लाल घन के रूप में प्रतिनिधित्व किया है । (ङ) NTF की दक्षता नक्शे मापा और पुनर्निर्माण की गुणवत्ता की जाँच के लिए नकली. मापा और नकली NTF दक्षता प्रोफ़ाइल की तुलना में, 3 डी पुनर्निर्माण की अच्छी गुणवत्ता प्रदान (समान मापा और नकली NTF दक्षता) था । F) क्षैतिज और छ) ऊर्ध्वाधर संकेत प्रोफाइल मापा (नीला) और नकली (लाल) NTF क्षमता वक्र का प्रतिनिधित्व । क्षैतिज और अनुलंब लाल पट्टियां स्रोत स्थिति का संकेत देती हैं । रंग बार कम (नीले) से उच्च (लाल) के लिए प्रति सेकंड प्रति सेमी फोटॉनों में फ्लोरोसेंट संकेत की तीव्रता का प्रतिनिधित्व करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

जब इमेजिंग तकनीकों, जैसे REF का उपयोग करते हैं, तो महत्वपूर्ण रणनीतियाँ जो मजबूत और संगत डेटा के उत्पादन की अनुमति है । ऑप्टिकल इमेजिंग ऊतकों जो प्रवेश की गहराई को प्रभावित कर सकते में बिखरे हुए प्रकाश पैदा करता है, क्योंकि यह सभी दिशाओं में उत्सर्जित प्रकाश को पकड़ने के लिए मुश्किल है । एक के पास बुनियादी का प्रयोग करें-लाल fluorophore (NIR) सब्सट्रेट रेफरी इमेजिंग के लिए ७०० के Querange में एक उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य होने-९०० एनएम स्तनधारी ऊतकों द्वारा फ्लोरोसेंट संकेत के ंयूनतम अवशोषण की सुविधा । कस्टम डिजाइन सब्सट्रेट एक NIR fluorophore जोड़ने के द्वारा निर्माण किया गया था, एक शमन करने के लिए IRDye 800Cw, IRDye QC-1, एक लस्टम की अनुमति अंगूठी द्वारा प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा स्थानांतरण आधारित शमन. IRDye उत्कृष्ट ऊतक प्रवेश और प्रकाश बिखरने विशेषताओं है और स्तनधारियों पर कोई स्पष्ट हानिकारक प्रभाव नहीं है३६, 24 ज. प्रतिदीप्ति संकेत द्वारा रक्त और अंगों से साफ किया जा रहा है के बाद 4 ज शुरुआत काफी बढ़ जाती है सब्सट्रेट प्रशासन, अधिक से अधिक स्तर तक पहुँचने 6 ज प्रशासन के बाद.

बैक्टीरियल संक्रामक खुराक, संक्रामक खुराक और सब्सट्रेट के प्रशासन की विधा के रूप में अच्छी तरह से समय के रूप में प्रायोगिक अध्ययन प्रदर्शन से इमेजिंग पोस्ट संक्रमण के अंक बड़े, जटिल, प्रयोगों पर तैयार करने से पहले मानकीकृत किया जाना चाहिए. पायलट अध्ययनों से काफी समय और लागत को कम कर सकते हैं, क्योंकि एक मानक प्रक्रिया कुंजी प्रयोग करने से पहले अनुकूलित किया जा सकता है क्योंकि जानवरों की एक बड़ी संख्या इमेजिंग । बैक्टीरियल भार अंगों में निर्धारित किया जाना चाहिए/पूरे शरीर इमेजिंग का उपयोग कर ट्रांस रोशनी और पूर्व vivo फेफड़े इमेजिंग महामारी-रोशनी का उपयोग करने के लिए संकेत के स्रोत को मांय करने और सहसंबंध की गुणवत्ता का निर्धारण के बाद ब्याज की बैक्टीरिया की संख्या के साथ8मौजूद. पायलट अध्ययन पता लगाने की दहलीज, तकनीक के गतिशील रेंज के रूप में के रूप में अच्छी तरह से इमेजिंग के लिए इष्टतम प्रयोगात्मक शर्तों के निर्धारण में अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा ।

के रूप में अंय फ्लोरोसेंट और bioluminescent रणनीतियों की तुलना में रेफरी इमेजिंग का उपयोग करने के प्राथमिक लाभ अपनी उच्च संवेदनशीलता और छवि को प्राकृतिक M. तपेदिक उपभेदों की क्षमता है । रेफरी इमेजिंग उत्प्रेरक मजबूत एंजाइम BlaC है कि सभी एम. तपेदिक नैदानिक अलग और तपेदिक परिसर उपभेदों में संरक्षित है का इस्तेमाल करता है । रेफरी इमेजिंग के महान संवेदनशीलता मेजबान सेल द्वारा सट फ्लोरोसेंट उत्पाद की अवधारण के साथ संयोजन में BlaC के तेजी से उत्प्रेरक दर के कारण है । संकेत लगातार जब तक सब्सट्रेट संक्रमित कोशिकाओं और ऊतकों के भीतर सिग्नल के लगभग असीम निर्माण अप में जिसके परिणामस्वरूप उपलब्ध है के रूप में बढ़ जाती है । इमेजिंग के वैकल्पिक दृष्टिकोण की तुलना में रेफरी इमेजिंग की यह वृद्धि की संवेदनशीलता के रूप में एम. तपेदिक दोनों इन विट्रो में और vivo8,23,24में विशिष्ट पता लगाने की अनुमति देता है, 29.

रेफरी इमेजिंग आनुवंशिक किसी भी संक्रमण मॉडल के लिए अपने सीधे आवेदन को सक्षम करने के संशोधनों के बिना बैक्टीरियल पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, या तो प्रयोगशाला पशु8,३७ या मानव नैदानिक सामग्री29,३८ . रेफरी का पता लगाने और छवि रोगजनकों की एक विस्तृत सरणी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है३९,४०, के बाद से fluorogenic सब्सट्रेट कई एंजाइमी जैसे BlaC के अलावा अंय लक्ष्यों के लिए विकसित किया जा सकता है जैसे कि, kinases, ureases, और β-galactosidases । हालांकि, सावधान सोचा लक्ष्य को दिया जाना चाहिए ताकि यह सुनिश्चित करने के लिए इमेजिंग के लिए इष्टतम विशेषताओं को प्रदर्शित करता है । BlaC विशेषताओं है कि इस रणनीति के सफल आवेदन सुनिश्चित करेगा के लिए एक अच्छा मॉडल एंजाइम का प्रतिनिधित्व करता है । रेफरी इमेजिंग एक तत्काल पढ़ें-जीवाणु लोड फेफड़ों में संक्रमण के दौरान मौजूद है, जो बहुत तपेदिक रोगजनन के अध्ययन में प्रगति गति पर बाहर प्रदान करता है, बैक्टीरियल संख्या के निर्धारण के बाद से सामांय रूप से तीन से छह सप्ताह की आवश्यकता है, लेकिन यहां तक कि अधिक में तेजी से बढ़ रहे जीवों को यह दृष्टिकोण समय की एक बड़ी बात की बचत होगी । रेफरी भी क्षय रोग से भेदभाव कार्सिनोमा के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, रोगियों में गांठदार घावों के निदान में एक प्रमुख समस्या४१,४२। रेफरी एक उपंयास उपकरण के रूप में कार्य करता है के लिए अनुवाद तपेदिक इमेजिंग में तेजी लाने और भी मनुष्यों के लिए लागू किया जा सकता है, संभवतः चिकित्सीय परिणामों की तेजी से भविष्यवाणी की अनुमति ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isoflurane VETONE 501027
CNIR800 Custom synthesized
Fatal Plus solution Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd
7H9 Middlebrook broth BD 271310
OADC Middlebrook enrichment BD 212351
Sporcidin RE-1284F
7H11 Middlebrook Agar BD 212203
Madison Chamber
IVIS Spectrum Perkin Elmer 124262
XGI-8-gas Anesthesia System Perkin Elmer
Living Imaging software Perkin Elmer
Transparent nose cones Perkin Elmer
M. tuberculosis strain CDC1551 ATCC
Female BALB/C mice, 5-7 weeks Jackson Laboratory

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Sharan, R., Yang, H. J., Sule, P.,… More

Sharan, R., Yang, H. J., Sule, P., Cirillo, J. D. Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence. J. Vis. Exp. (132), e56801, doi:10.3791/56801 (2018).

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