Procedimientos de fabricación y medidas de birrefringencia para diseñar Ion lantánido magnéticamente sensibles quelantes ensamblajes de fosfolípidos

Summary

Se presentan procedimientos de fabricación para el ion lantánido altamente magnéticamente sensibles quelantes conjuntos polimoleculares. La respuesta magnética se basa en el tamaño de la Asamblea, que se adapta por extrusión a través de membranas nanopore. Las Asambleas alignability magnética y los cambios estructurales inducidos por la temperatura son monitoreados por las mediciones de birrefringencia, una técnica gratuito para resonancia magnética nuclear y dispersión de neutrones de ángulo pequeño.

Abstract

Bicelles son conjuntos polimoleculares de disco ajustables formados de una gran variedad de mezclas de lípidos. Las aplicaciones van desde estudios estructurales de proteínas de membrana por resonancia magnética nuclear (RMN) a desarrollos nanotecnológicos incluyendo la formación de geles ópticamente activos y magnéticamente conmutables. Estas tecnologías requieren un control alto del tamaño de la Asamblea, respuesta magnética y resistencia térmica. Mezclas de 1, 2-dimyristoyl -sn- glycero-3-fosfocolina (DMPC) y sus iones lantánidos (Ln^{3 +}) quelante conjugado de fosfolípidos, 1, 2-dimyristoyl -sn- glycero-3-fosfo-etanolamina-dietilenglicol triaminepentaacetate () DMPE-DTPA), montar en conjuntos altamente magnéticamente sensibles tales como DMPC/DMPE-DTPA/Ln^{3 +} (proporción molar de 4:1:1) bicelles. Introducción de colesterol (Chol-OH) y derivados esteroides en la bicapa resulta en otro conjunto de ensamblados que ofrece propiedades fisico-químicas únicas. Para una composición de lípidos determinado, la alignability magnética es proporcional al tamaño del bicelle. La complejación de Ln^{3 +} resulta en respuestas magnéticas sin precedentes en términos de magnitud y alineación de dirección. El colapso de la termo-reversible del disco-como las estructuras en vesículas al calentarse permite adaptación de dimensiones de las asambleas por extrusión a través de filtros de membrana con tamaño de poro definido. Las bicelles magnética alignable se regeneran por refrigeración a 5 ° C, resultando en conjunto las dimensiones definidas por los precursores de la vesícula. En este documento, se explica este procedimiento de fabricación y el alignability magnético de las Asambleas se cuantifica por mediciones de birrefringencia bajo un campo de magnético 5.5 T. La señal de la birrefringencia, procedente de la bicapa de fosfolípidos, además permite la monitorización de polimoleculares cambios que ocurren en la bicapa. Esta técnica simple es complementaria a los experimentos de NMR que comúnmente se emplean para caracterizar bicelles.

Introduction

Bicelles son conjuntos polimoleculares de disco como de numerosas mezclas de lípidos. ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5} son ampliamente utilizados para la caracterización estructural de biomoléculas de membrana por espectroscopia de RMN. ^{6 , 7} sin embargo, los esfuerzos recientes tienen por objeto ampliar el campo de posibles aplicaciones. ^{5 , 8 , 9} el sistema de bicelle m....

Protocol

1. procedimiento fabricación de DMPC/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (proporción molar de 4:1:1) y DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (fracción molar 16:4:5:5) conjuntos polimoleculares

1. Preparaciones preliminares
   1. Lave toda la cristalería por lavado una vez con etanol estabilizado cloroformo (> 99% cloroformo) y seque con aire comprimido.
   2. Producir 2 distintas 10 mg/mL soluciones de DMPC y DMPE-DTPA en cloroformo estabilizado con etanol (> cloroformo 99%), una solución stock de 10 mM de Chol-OH en cloroformo estabilizado con etanol (> cloroformo 99%) y una solución 10 mM de TmCl₃ en metanol.
   3. Preparar un 50 mM de tam....

Results

La señal de la birrefringencia de una no sacó DMPC/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (proporción molar de 4:1:1) muestra fue supervisada en un campo de magnético 5.5 T durante un calentamiento y enfriamiento ciclo de 5 a 40 ° C y a una velocidad de 1 ° C/min (figura 6). Los resultados de birrefringencia confirman alineaciones magnéticas alta a 5 ° C con un valor de 1.5 x 10^-5, dos veces tan fuerte en cuanto a los sistemas de extrusión divulgados.

Discussion

Un relato detallado de cómo las mediciones de la birrefringencia se usaron en combinación con SANS experimentos para evaluar los métodos de generación altamente magnéticamente sensibles Ln^{3 +} quelantes fosfolípidos asambleas es de Isabettini et al. ²³ los protocolos de fabricación propuesto también son aplicables para asambleas compuestas de los fosfolípidos más de DPPC y DPPE-DTPA o para aquellos que contienen derivados esteroides químicamente modificados en su bicapa.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dimiristoyl-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC)	Avanti Lípidos Polares	850345P	>99%
1,2-dimiristoyl-sn-glicero-3-fosfo-etanolamina-dietilenopentaacetato sal de hexammonio ácido (DMPE-DTPA)	Avanti Polar Lipids	790535P	>99%
Cloruro de tulio (III)	Sigma-Aldrich 439649		anhidro, polvo, 99,9% base de metales traza
Cloruro de disprosio (III)	Sigma-Aldrich	325546	anhidro, polvo, base de metales traza 99,9%
Cloruro de iterbio (III)	Sigma-Aldrich	439614	anhidro, polvo, base de metales traza 99,9%
Cloroformo	Sigma-Aldrich	319988	contiene etanol como estabilizador, reactivo ACS, ≥ 99.8%
Metanol	Sigma-Aldrich	34860	≥ 99,9%
Colesterol	Amresco	433	D2O de grado ultrapuro
	ARMAR chemicals	1410	99,8 átomo % D
Agua ultrapura	Millipore		Synergy pak2 (SYPK0SIX2), Millipack GP (MPGP02001)
medidor de pH electrónico	Metrohm	17440010
Whatmann Nuclepore 25 mm 100nm filtro de membrana	VWR	515-2028
Filtro de membrana Whatmann Nuclepore 25 mm 200nm	VWR	515-2029
Whatmann Nuclepore 25 mm 400nm filtro de membrana	VWR	515-2030
Whatmann Nuclepore 25 mm 800nm filtro de membrana	VWR	515-2032
Whatmann Papel de filtro	VWR	230600
Matraz de fondo redondo de 25 ml	VWR	201-1352	14/23 NS
Vaso de vidrio de 3 ml	VWR	548-0554	ND18, 18x30mm
Jeringa de vidrio de 2,5 ml	Hamilton
Dihidrógeno de sodio fosfato dihidratado	Merk	1.06342	Sal utilizada para hacer tampón de fosfato
di-Fosfato de hidrógeno de sodio	Merk	1.06586	Sal utilizada para hacer tampón de fosfato
Carbagas	de nitrógeno líquido	-
Gas nitrógeno presurizado	Carbagas-Botella	de	200 bar
Extrusora de lípidos 10 ml	Lipex-Totalmente		equipado con termobarril
Tubo de PVC de alta presión	GR NETUM-debe		resistir más de 4 MPa
Adaptadores Serto Sertot-Guantes
nitrilo	VWR-2
ml pipetas de vidrio	VWR	612-1702 Láser de	230 mm de largo
	Newport	LPM635-25C
DSP Amplificador de bloqueo bifásico	SRS	SRS SR830
Detector de fotodiodos	Silonex Inc.	SLSD-71N5	5mm2, Silicio, fotoconductor
5.5 T Criogénico Magnético Criogénico	/Oerlikon AG-12		bar He-enfriado. Compresor RW4000/6000, cabezal criogénico RGD 5/100 TA Filtro de
paso bajo de segundo orden	de		alimentación lineal 24 V CC, segundo orden, llave Sallen, frecuencia de corte 360 Hz, +/- 12 V, máx. 10 mA
Modulador fotoelástico	Hinds instruments	PEM-90
Glan-Thompson Polarizador de calcita	Newport	10GT04	25,4 mm de diámetro
	Hellma	165-10-40	Célula con control de temperatura, 0,8 ml, longitud de paso de 10 mm
Sonda de temperatura		Thermocontrol-Tipo	K, 0,5 mm de diámetro, Thermocoax
Espejos no polarizantes	Newport	50326-1002	de 25,4 mm
	National Instruments	189284-02	Para conectar al puerto RS-232 en la parte frontal de los controladores FieldPoint compactos
BNC 50 y Omega; Cables y conectores	National Instruments	763389-01
cFP-AI-110	National Instruments	777318-110	Módulo de entrada analógico de voltaje y corriente de 8 canales para FieldPoint compacto
cFP-CB-1	National Instruments	778618-01 Bloque de	conectores integrado para cableado para E/S compactas de FieldPoint
cFP-CB-3	National Instruments	778618-03	Bloque de conectores isotérmicos integrado para cablear termopares al módulo cFP-TC-120
cFP-TC-120	National Instruments	777318-120 Módulo de	entrada de termopar de 8 canales para FieldPoint compacto
cFP-1804	National Instruments	779490-01	Interfaz Ethernet/Serial para NI Compact FieldPoint
LabView 2010	National	Instruments-Potencia
industrial suministro	Traco Power	TCL 060-124	100-240V AC
Baño de agua	Julabo	FP40-HE	Circulador refrigerado/calefactor