Summary
ويصف البروتوكول هنا تفاعلات أيون hEAG1 المنقي قناة البروتين مع جزيء صغير الدهن يجند فوسفاتيديلينوسيتول 4، 5-بيسفوسفاتي (المرحلة2). القياس يوضح أن BLI يمكن أن تكون طريقة محتملة لرواية جزيء صغير أيون قناة يجند الفرز.
Abstract
فحص قياس التداخل (BLI) بيو-طبقة أداة قيمة لقياس البروتين-بروتين والتفاعلات جزيء البروتين-الصغيرة. هنا، نحن أولاً وصف تطبيق هذا الأسلوب رواية خالية من التسمية دراسة التفاعل بين EAG1 البشري البروتينات قناة (hEAG1) مع برنامج تطبيق السلام جزيء صغير2. قد اعترفت قناة hEAG1 كهدف العلاجية المحتملة بسبب أن overexpression الشاذة في الإصابة بالسرطان وبعض الطفرات مكسب للدالة المشاركة في بعض أنواع من الأمراض العصبية. تنقية البروتينات قناة hEAG1 من نظام تعبير مستقرة الثدييات، وقياس التفاعل مع النقطة2 بواسطة BLI. قياس نجاح الحركية للربط بين البروتين hEAG1 والنقطة2 يوضح أن الإنزيم BLI نهجاً الفائق محتمل استخدامها لفحص الرواية جزيء صغير يجند في الصيدلة قناة أيون.
Introduction
استهداف البروتينات قناة أيون قابلة للوصول من سطح الخلية مع الجزيئات الصغيرة إمكانات هائلة ليجند الفرز والعقاقير البيولوجية اكتشاف1،،من23. وبالتالي، هناك حاجة أداة مناسبة لدراسة التفاعل بين قناة أيون والجزيئات الصغيرة ووظيفتها المقابلة. تم تسجيل التصحيح-المشبك أثبت أن تكون تقنية فريدة من نوعها ولا يمكن الاستغناء عنه في قناة أيون المقايسة الوظيفية. ومع ذلك، تحديد ما إذا كانت الجزيئات الصغيرة المستهدفة مباشرة قنوات أيون تتطلب تكنولوجيات أخرى. تقليديا، استخدمت مقايسة ملزم يجند المشعة لمراقبة حركية الربط بين جزيء صغير والبروتين قناة أيون المستهدفة به. استخدام هذا الأسلوب غير محدودة بسبب متطلباتها في وسم المشعة والكشف. وعلاوة على ذلك، يمنع هذه الخطوة شرط أساسي لتسمية يجند الصغيرة في الدراسة استخدام أنواع عديدة من قنوات أيون دون يجند محددة معروفة. وقد استخدمت بعض التقنيات خالية من تسمية مثل مطيافية الرنين المغناطيسي النووي، حيود الأشعة السينية، وعبارة ثيرموفوريسيس (MST)4 والرنين السطحية مأكل مثل الطحين (موارد البرنامج الخاصة) لقياس التفاعلات جزيء البروتين-الصغيرة. ولكن هذه الأنواع من فحوصات عادة لا توفر معلومات كافية بسبب صعوبة الحصول على كامل طول البروتين، دقة منخفضة من الديناميات، والإنتاجية المنخفضة، وارتفاع تكلفة5. على النقيض من هذه التقنيات، تبرز بيو-طبقة "قياس التداخل" (BLI) كمنهجية خالية من تسمية رواية للتغلب على هذه العوائق للكشف عن التفاعلات جزيء البروتين-الصغيرة بشل حركة كميات صغيرة من البروتين عينة على أسطح بيوسينسور وقياس التغير الضوئية إشارات6،7. كمنصة biosensor واعدة، تتم تقنية BLI الفعل لمراقبة تفاعل الجزيئات الصغيرة مع المياه الطبيعية البروتينات القابلة للذوبان مثل جسم [مونوكلونل] بشرية CR80208 وقد تم الإبلاغ عن إجراء تحليل مفصل في السابقة من المادة9. على الرغم من أن قد تم الاعتراف بالدور الرئيسي للبروتين قناة أيون لاكتشاف الأهداف العلاجية الجديدة، أيون قناة جزيء صغير البروتين التفاعل المقايسة استناداً إلى BLI لا يوصف.
الإنسان يعبر عن قنوات الاثير à الذهاب (hEAG1) في أنواع مختلفة من الخلايا السرطانية والجهاز العصبي المركزي مما يجعل الهدف قناة العلاجية المحتملة العديد من الأمراض السرطانية والاضطرابات العصبية10،11، 13،،من 1214. وأكدت الدراسة الكهربية في المختبر لدينا تأثير المثبطة فوسفاتيديلينوسيتول 4، 5-بيسفوسفاتي (المرحلة2) على قناة hEAG115. استناداً إلى النتائج، واختبار النقطة2 مباشرة يمكن أن يكون التفاعل مع hEAG1 باستخدام تقنية BLI كنموذج لأنواع أخرى من أيون قناة جزيء صغير البروتين التفاعل مركبة خاصة بالنسبة لتلك القنوات التي تفتقر إلى يغاندس المحددة. وفقا لتعليمات الفحص BLI، أعد بيوتينيلاتيد hEAG1 البروتينات ومعطلة لها على سطح ستريبتافيدين (SA) نصائح biosensor متبوعاً بالتفاعل منهم إلى النقطة2 الحلول للاحتفال الربط المباشر بين الدهن والبروتين. بعد إرفاق النقطة2 للسطح المغلفة البروتين hEAG1، وسمك طبقة على السطح يزيد، الذي مباشرة يرتبط التحول الطيفية ويمكن أن يقاس في الوقت الحقيقي16. يمكن تحديد حركية ملزم بسبب تحولاً إيجابيا في خطوة الرابطة وتحولاً سلبيا في خطوة الانفصال. وفقا لهذا المبدأ، نحن تنقية البروتين قناة أيون hEAG1 الوظيفية من نظام مستقر التعبير HEK-239T باستخدام طريقة تنقية تقارب للحفاظ على حالة وظيفية في المختبر ، ثم قياس الحركية ربط تركيز مختلف النقاط2، وتسفر عن بيانات حركية سيمبلابل كما هو ملاحظ في القياسات الكهربية15. المراسلات الوثيق بين النتائج من BLI والقياسات الكهربية تظهر للمرة الأولى مدى ملاءمة BLI كأداة تحليلية مناسبة لايون قناة غشاء صغير البروتين جزيء التفاعل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: هو تشييد خط الخلية HEK-293T باستمرار التعبير عن البروتين قناة معلم العلم hEAG1 ترانسفيكتينج بكده لينتيفيرال بلازميد يحتوي على تسلسل الحمض النووي hEAG1 مع علم في ج-المحطة البعيدة إلى خلايا HEK 293T تليها اختيار المقاوم بوروميسين كما تم وصفه سابقا15.
1-تقارب تنقية البروتين قناة hEAG1 معلم العلم من الخلايا HEK-293T
- ذوبان الجليد الخلايا ستابلي معربا عن قنوات hEAG1 من النتروجين السائل في الماء الدافئ (37 درجة مئوية) بسرعة. بذور الخلايا (حوالي 5 × 106 تجميد الخلايا) في صحن 10 سم. تنمو الخلية بين عشية وضحاها في "تعديل النسر" دولبيكو (دميم) تستكمل مع 8 مل 10% مصل بقرى الجنين (FBS)، 100 وحدة/مل البنسلين، 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين، 4 مم L-الجلوتامين المتوسطة وتغير في المتوسط في اليوم التالي.
- تحقق من الأسفار بروتينات فلورية خضراء من هذه الخلايا HEK-293T باستخدام مجهر فلوري إلى التأكد من وجود نسبة عالية من الخلايا ستابلي التعبير عن قنوات hEAG1 في نظام تثقيف. آسيه تريبسينيزي الخلايا المتنامية مع 1 مل التربسين 0.25% لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وزند 2 مل من ثقافة السوائل المحتوية على مصل إنهاء عملية الهضم. نقل 400 ميكروليتر من تعليق خلية لطبق 15 سم يحتوي على 15 مل من إكمال دميم المتوسطة. إعداد أربعة أطباق 15 سم في المجموع.
-
حصاد هذه الخلايا بعد 2-3 أيام الثقافة عند الوصول إلى الخلايا في حوالي 90% كونفلوينسي.
- إزالة متوسط النمو من الخلايا وغسلها مرتين مع 4 مل فوسفات مخزنة المالحة (1 x PBS، pH = 7.4).
- تجاهل برنامج تلفزيوني بعد الغسيل.
- كشط الخلايا في برنامج تلفزيوني 1 x 2 مل لكل طبق باستخدام الخردة الخلية ونقل الخلايا كشط مع 1 مل "الماصة؛" في أنبوب 15 مل.
- الطرد المركزي من تعليق خلية لمدة 5 دقائق في 420 ز x عند 4 درجة مئوية.
- صب وتجاهل المادة طافية.
- ريسوسبيند بيليه الخلية في مجموع مل 4 تحلل المخزن المؤقت (10 ملم حبيس، 1.5 مم مجكل2، 10 مم كلوريد الصوديوم، 1% NP-40، ودرجة الحموضة 7.0، مثبط البروتياز كاملة الواردة) لمدة 30 دقيقة على الجليد، ودوامه جيدا كل 10 دقيقة.
- الطرد المركزي الخلية لمدة 10 دقيقة في 12,000 س ز في 4 درجات مئوية.
- نقل المادة طافية إلى أنبوب 5 مل وإبقائه على الجليد للاستخدام الفوري.
-
تحضير الراتنج تقارب M2 المضادة العلم.
- دقة تعليق الراتنج (المقدمة كتعليق 50% في المخزن المؤقت لتخزين) بانعكاس لطيف للتأكد من زجاجة جل تقارب M2 المضادة العلم تعليق الخرز جل موحدة.
- نقل ميكروليتر 400 تعليق على الفور إلى أنبوب مبردة 1.5 مل.
- الطرد المركزي من تعليق 30 ثانية في 8, g 000 x عند 4 درجة مئوية وتجاهل المادة طافية بعناية لتغسل المخزن المؤقت مخزن.
- إضافة 500 برنامج تلفزيوني 1 x ميكروليتر إلى الراتنج وتعليق بيليه مع ماصة 1 مل. ثم الطرد المركزي بتعليق 30 ثانية في 8, g 000 x عند 4 درجة مئوية وتجاهل برنامج تلفزيوني طافية بعناية. كرر هذه الخطوة يغسل لمسح المخزن المؤقت المخزنة.
- إضافة 500 ميكروليتر البروتين استخراج المادة طافية إعدادها في الخطوة 1.3.8 لبيليه راتنج تعليق بيليه ونقل التعليق إلى أنبوب مبردة 5 مل جديدة. كرر هذه الخطوة مرة أخرى للتأكد من أن لا الخرز جل اليسار. إضافة استخراج البروتين الأيسر إلى الخليط.
- احتضان هذا الخليط بين عشية وضحاها على شاكر لفة في الدقيقة 8 في 4 درجات مئوية لالتقاط البروتين الانصهار العلم.
- الطرد المركزي الخليط بعد الاحتضان ح 12 دقيقة 10 في 1، ز خ 000 في 4 درجات مئوية.
- تجاهل المادة طافية وتغسل بيليه ثلاث مرات مع 500 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني 1 x. يبقيه على الجليد للاستخدام الفوري.
-
شطف hEAG1 العلم البروتين مع 3 × الببتيد العلم.
- تعد العلامة X 3 شطف الحل. حل الببتيد العلامة X 3 في 500 ميكروليتر الأسهم الحل (0.5 م تريس-HCl، 1 م كلوريد الصوديوم، pH = 7.5) بتركيز 8 ميكروغرام/ميكروليتر.
- إضافة 10 ميكروليتر 3 × العلم شطف الحل إلى 390 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني يكون حل نهائي تركيز 200 نانوغرام/ميكروليتر.
- إضافة ميكروليتر 400 علامة x 3 شطف الحل الخرز جل إعدادها في الخطوة 1.8.
- احتضان العينة في شاكر 8 لفة في الدقيقة ح 2 في 4 درجات مئوية.
- الطرد المركزي الراتنج لمدة 30 ثانية في 8، ز خ 000.
- نقل المادة طافية إلى أنبوب جديد 1.5 مل وتخزينها في 4 درجات مئوية للاستخدام الفوري.
2-hEAG1 تركيز الإنزيم والانصهار "تأكيدا لتنقية العلم" بطقم مقايسة البروتين اتفاق التعاون الأساسي والغربية النشاف
- تحديد تركيز البروتين المنقي استخدام عدة فحص البروتين اتفاق التعاون الأساسي وفقا لتعليمات للتصنيع.
- استخدام 30 ميكروليتر عينة للتحليل الغربي لتأكيد أنه تم تنقية البروتين الفائدة باستخدام جسم المضادة علم كما هو موضح سابقا15.
3-وضع العلامات البروتين المنقي قناة مع البيوتين للمقايسة BLI
- إعداد 5 ملغ/مل الحل البيوتين الأسهم في برنامج تلفزيوني. لكل اختبار (اثنان أجهزة استشعار العوامل البيولوجية)، إضافة فائض مولى 3-fold البيوتين إلى 20 ميكروغرام تنقية البروتين لتحقيق بيوتينيليشن ن--المحطة طرفية أفضل من البروتين المنقي في برنامج تلفزيوني.
- احتضان العينة في الظلام على الجليد لمدة 30 دقيقة على الأقل.
- إعداد المخزن المؤقت تمييع (SD) عينة: برنامج تلفزيوني مع 0.02% بوليسوربيت 20 و 0.1% ألبومين المصل البقري (جيش صرب البوسنة، درجة الحموضة 7.4).
- أداء أولترافيلتريشن لتغيير المخزن مؤقت البروتين المنقي قناة إلى المخزن المؤقت للتنمية المستدامة. إزالة البيوتين غير منضم باستخدام جهاز أولترافيلتريشن مع قطع الوزن الجزيئي من 30 كاتشين وإضافة المخزن المؤقت SD سينتريفوجينج العينة في 12,000 س ز، لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية.
- إزالة أولترافيلتراتي من أنبوب الطرد المركزي من جهاز ultrafiltration، إضافة 200 ميكروليتر SD العازلة في جهاز عامل تصفية وسينتريفوجينج العينة في 12,000 س ز، لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. كرر هذه العملية ثلاث مرات على الأقل.
- لتجمع المخزن المؤقت وتبادل إدراج عينة، عكس الجهاز عامل التصفية في أنبوب 1.5 مل وسينتريفوجينج لهم في س 2,000 ز، لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. الاحتفاظ عينة على الجليد للاستخدام الفوري.
4-إعداد برنامج تطبيق السلام2 الحل للمقايسة
- إعداد الحل الأسهم من النقطة2 (1 مم) في منزوع ح2س من سونيكاتينج لمدة 30 دقيقة على الجليد كما هو موضح سابقا17. تخزين الحل في قنينات زجاجية في-20 درجة مئوية، وتمييع لتركيزات النهائي فورا قبل التجارب التي فورتيكسينج قوية.
5-BLI الإنزيم
- قم بتشغيل المعدات والتحقق من إطار "صك الحالة" للتأكد من أن الجهاز في الدولة "على استعداد" بريوارم المعدات على الأقل لمدة 30 دقيقة قبل دراسة BLI.
- تأكد من إغلاق باب الصك قبل فتح البرنامج "الحصول على البيانات" واختر "التجربة الحركية الجديدة" في "معالج تجربة".
- تحديد الآبار لاستخدامها على لوحة 96-جيدا بحق انقر لاختيار المخزن المؤقت، والتحميل، وعينه. للآبار عينة، ينبغي إدخال وحدة تركيز بيوتينيلاتيد علم الانصهار hEAG1 البروتين المولى (10 ميكروغرام، 0.09 ميكرومتر).
- تحدد الخطوات المقايسة بما في ذلك خط الأساس، تحميل، الرابطة والانفصال. اختر خطوة مقايسة وانقر نقراً مزدوجاً فوق العمود الخاصة بكل منها. يتم تعيين نسخة مكررة تعريف الفحص لمراقبة أجهزة الاستشعار. تعيين دورة في الدقيقة إلى 1000. اختر 1 دقيقة لخطوة أساسية و 5 – 10 دقيقة للتحميل وتكوين الجمعيات، والانفصال، على التوالي. إجراء الاختبار في درجة حرارة الغرفة (حوالي 24 درجة مئوية).
ملاحظة: هناك إجراءان الرئيسية: تحميل البروتين قناة بيوتينيلاتيد لأجهزة الاستشعار والمعايرة بالتفاعل مع المركبات جزيء صغير. يمكن أن تكون وشرعوا باستمرار (خط الأساس، تحميل، الأساس، الرابطة والانفصال). بدلاً من ذلك، يمكن أن تكون وشرعوا في كل على حدة لتجنب إضاعة المركبات الاختبار عند تحميل أول جزء غير ناجحة. - انقر فوق الأعمدة التي تحتوي على أجهزة الاستشعار، وانقر فوق "تعبئة" للإشارة إلى المواقع من أجهزة الاستشعار في علبة جهاز استشعار.
- استعراض جميع الخطوات التحقق من الأخطاء والعودة إلى تصحيحها.
- تعيين موقع ملفات البيانات وانقر فوق "الانتقال" إلى البدء الفحص.
ملاحظة: أجهزة الاستشعار بحاجة إلى بريويتيد لمدة 10 دقائق على الأقل في المخزن المؤقت للتنمية المستدامة، إذا كان قد تم القيام بهذه الخطوة، ثم يجب أن يتم تخطي الإعداد "تأخر بدء التجربة". إذا لم يكن الأمر كذلك، تعيين تأخير s 600 قبل بريويتينج أجهزة الاستشعار. - وضع لوحة 96-بئر أسود في أسفل الدرج وإدراج الركن A1 من اللوحة في الشق في علبة لمقعد اللوحة. للآبار لتحميل أجهزة الاستشعار، إضافة 200 ميكروليتر من المخزن المؤقت لفحص كل بئر في الآبار 2 في الصف A والآبار 2 في صف ب لوحة 96-جيدا.
- إعداد لوحة 96-بئر أسود آخر كلوحة عينة وملء الآبار مع 200 ميكروليتر SD العازلة في صف ب كعنصر التحكم أو بيوتينيلاتيد hEAG1 البروتين الحل (10 ميكروغرام) في الصف بحيث يتم تعيينها أثناء البرمجة في الخطوة 5، 3.
ملاحظة: تجنب إدخال الفقاعات. - فتح الباب للصك وإدراج علبة الاستشعار ونموذج لوحة في حامل اللوحة اليمنى واليسرى، على التوالي. تحقق من أن لوحة صينية وعينه استشعار متوضعة بشكل صحيح استناداً إلى شكل حامل اللوحة اليسرى وعلامة "A1" في الزاوية اليمنى العليا من حامل اللوحة اليمنى. أغلق الباب والبدء الفحص.
6-بيانات التحليل
- فتح برنامج "تحليل البيانات" وتحميل المجلد الذي يحتوي على البيانات المقايسة. انقر فوق "تجهيز" للوصول إلى واجهة قائمة التجهيز، ويمكننا أن نرى منحنيات الحركية الخام الملونة.
- في الخطوة 1: "اختيار البيانات"، انقر فوق "اختيار أجهزة الاستشعار". على "استشعار علبة #1"، انقر فوق الآبار استشعار فقط ترطب مع المخزن المؤقت للتنمية المستدامة، وفوق الحق في "تغيير نوع جهاز استشعار" إلى "مرجع الاستشعار". على 'نموذج لمخطط لوحة"وتعيين جميع الآبار غير محددة ملزمة وفوق الحق في"تغيير جيدا نوع"إلى"إشارة جيدة".
- ضع علامة في المربع قبل "الطرح" في الخطوة 2 ونقطة "إشارة مزدوجة".
- في الخطوة 3: "محاذاة المحور Y"، حدد "خط الأساس" كخطوة المحاذاة. بالنسبة "النطاق الزمني"، أدخل 10 آخر ق من أن خط الأساس (أي من: 0.1 إلى: 59.8).
- في الخطوة 4: "تصحيح الخطوة بين الوكالات"، حدد "محاذاة لخط الأساس" للتقليل من تحولات إشارة بين الخطوات الرابطة والانفصال.
- في الخطوة 5: "عملية"، حدد دالة التصفية Savitzky غولي في معظم الحالات، والمضي قدما "معالجة البيانات".
- حفظ "البيانات الخام" لمواصلة تحليل البيانات باستخدام برامج أخرى في الخطوة 7: "حفظ النتائج".
-
انقر فوق "تحليل | المنحنى المناسب ".
- اختر ل "الخطوة إلى تحليل"، "رابطة | الانفصال ". "نموذج"، حدد 1:1.
ملاحظة: أننا نختار نموذج 1:1 لأنها مجهزة جيدا على البيانات الأصلية وتجنب إمكانية أكثر ملائمة تحت 1:2 أو النموذج 2:1 بسبب حرية عالية. ولكن خيارات أخرى متوفرة هنا، ويمكن أن يكون اختيار مناسب لأخرى التحليل المناسب لربط مختلف نماذج أكثر. - من أجل "المناسب"، اختر العالمي (كامل). بالنسبة "تجميع حسب"، حدد "لون". حدد "رماكس غير مرتبط باستشعار" للسماح بتركيب مستقل الاستجابة إشارة القصوى (رماكس).
- انقر فوق "احتواء المنحنيات!" لبدء تحليل الانحدار غير الخطية. واستخدمت معادلة هيل والدالة الأسية واحد في دراستنا.
- انقر فوق "تصدير البيانات | حفظ تقرير "لحفظ تركيب النتائج. أو انقر فوق "تصدير البيانات | تصدير النتائج الملائمة "لحفظ البيانات الخام لزيادة الرسوم البيانية وتحليل البيانات مع البرامج الأخرى.
- اختر ل "الخطوة إلى تحليل"، "رابطة | الانفصال ". "نموذج"، حدد 1:1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
نحن تنقية البروتين قناة hEAG1 الانصهار العلم من HEK 293T الخلايا overexpressed ستابلي hEAG1. وقد ثبت أن وظيفة هذا البروتين الانصهار باستخدام أسلوب التصحيح-المشبك والجودة والنوعية للبروتين المنقي تؤكدها لطخة غربية (الشكل 1). البروتين المنقي قناة بيوتينيلاتيد للقيام تحليل تفاعل مع الدهون (المرحلة2) باستخدام مقايسة BLI في الوقت الحقيقي. ويرد في الشكل 2تكوين مقايسة الربط BLI. منحنى نموذجي ملزم بين hEAG1 والنقطة2 يرد في الشكل 3. في هذه الحالة، يتم حل 3 ميكرومتر النقطة2 في برنامج تلفزيوني المخزن المؤقت (تكوين النواة2 هو مبين في تكميلية الشكل 1)، والإشارة يتم تحليل استخدام بروتوكول طرح إشارة مزدوجة إلى طرح الربط غير محددة ( الربط بين أجهزة الاستشعار والنقطة2)، الخلفية (التفاعل بين البروتين hEAG1 بيوتينيلاتيد وبرنامج تلفزيوني)، والإشارات العائمة (الربط بين أجهزة الاستشعار وبرنامج تلفزيوني) الناجمة عن تقلب الاستشعار. وتتبع ملزمة عالمياً يصلح وسيظهر على تراكب جيدا مناسب (تكميلية الشكل 2). أيضا، نحن قياس حركية ملزمة من النقطة2 للقناة hEAG1 المنقي المعقدة التي تفرخ البروتينات بتركيزات مختلفة من النقطة2. بعد التحليل، نحصل على قيمة (كد) ثابت تفكك من 0.35 ميكرومترات ±0.04، ومماثلة لقيمة50 IC التي تم الحصول عليها من القياسات الكهربية15. هذه النتائج تبين أن الإنزيم BLI المناسبة لايون قناة غشاء البروتين والدهون تحليل التفاعل.
رقم 1: تحديد التعبير والدالة، وخصوصية من البروتين hEAG1 المؤتلف من الخلايا HEK 293T بالتصوير التجارة والنقل، وتصحيح المشبك، ولطخة غربية، على التوالي. (أ) نظام HEK 293T hEAG1 التعبير مستقرة بنجاح يحددها التحديد بوروميسين المقاوم [مونوكلونل] بعد تعداء مع نظام لينتيفيروس hEAG1-بكده كما يتضح من التعبير بروتينات فلورية خضراء في تقريبا كافة الخلايا. نبض (ب) البروتوكول (أعلى) وفرضه آثار الحالية من ممثل كامل الخلية تصحيح المشبك تسجيل من القنوات hEAG1 في خلية مستقرة في ألف. الحالي هو أثارت قبل ديبولاريزينج الفولتية من الجهد عقد من-80 أم إلى 70 mV في الخطوة 10 mV متبوعاً ريبولاريزيشن إلى-80 أم. هي الخلايا المحتضنة في قناة ك+ العادي تسجيل الحلول كما هو موضح مسبقاً من15. التيارات البوتاسيوم إلى الخارج تعتمد على الجهد تشير إلى أن القنوات hEAG1 الوظيفية يتم التعبير عن درجة عالية في الخلايا HEK293T. (ج) لطخة غربية hEAG1 قناة البروتين من عينات البروتين المنقي. تسلم جسم العلم لمكافحة عصابة بروتين وحيد من كاتشين ~ 110، مما يدل كامل طول التعبير قناة hEAG1 معلم العلم. وقد تم تعديل هذا الرقم 1 من هان et al. 15- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: رسم تخطيطي عرض البروتوكول مقايسة الربط BLI. وتستخدم أربعة أجهزة استشعار بالتوازي في البروتينات بيوتينيلاتيد-قناة أو على المخزن المؤقت SD المذاب تحميل قناة البروتينات والمراجع. بعد ذلك، يتم نقل هذه المجسات الأربعة الاعتداء المرحلة للكشف عن الرابطة وعدم اقتران مع فوسفوليبيدات أو المخزن المؤقت الخاص به الحل. يتم تلوين مواقف البروتينات القناة وشكلها والمخزن المؤقت كما هو مبين. خط منقط أحمر أفقي يشير إلى خطوتين رئيسيتين لدراسة BLI: تحميل مرحلة التحليل والتفاعل. وقد تم تعديل هذا الرقم 2 من هان et al. 15- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: يلتقط الشاشة تظهر البيانات الأولية والبيانات المجهزة في دراسة BLI نموذجية- (أ) منحنيات التحميل والموازنة النموذجية عرض الخطوة الموازنة (60 s) مع SD-العازلة (الأساس)، خطوة التحميل مع البروتينات hEAG1 (تحميل) ومنحني إشارة اكويليبراتيد ومحملة بالبروتينات hEAG1 (تحميل)، متزامنة قياس نصائح اثنين من أجهزة الاستشعار الفردية. (ب) الخطوط الحمراء الرأسية تشير إلى نقل أجهزة الاستشعار من دهن الحل إلى الحل المخزن المؤقت أثناء عملية الفحص. (ج) الأصلي البصرية الإشارات في مراحل الرابطة والانفصال بعد معالجة الطرح إشارة مزدوجة طرح الإشارات غير محددة ملزمة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: ينتج عن الإنزيم BLI عرض hEAG1 قناة البروتين التفاعل مباشرة مع النقطة2- التقاط الشاشة (A) تظهر البيانات الأولية من hEAG1 البروتين ملزمة مع النقطة2 في طريقة الاعتماد على التركيز (0.03-3 ميكرومتر). يرمز التركيزات المتراكمة من النقطة2 تناظر آثار البيانات أجهزة استشعار العوامل البيولوجية. (ب) تجهيز البيانات الأولية تبين التغييرات في التدخل الضوئية بتركيزات مختلفة من النقطة2 في مقايسة ممثل. (ج) منحنى تتناسب مع هيل المعادلة التي تم الحصول عليها من قيمة الذروة من الإشارة الضوئية تدخل قياس تركيزات مختلفة النقطة2 لتحديد ثوابت التفكك التوازن (كد) التفاعل بين hEAG1 قناة البروتين والنقطة2 (n = 3). تم تعديل الشكل 4 باء و جيم 4 من هان et al. 15- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
التكميلية الرقم 1: تكوين سلسلة طويلة فوسفاتيديلينوسيتول 4، 5-بيسفوسفاتي (المرحلة2)- اضغط هنا لتحميل هذا الرقم-
التكميلية الرقم 2: شاشة التقاط التراكب المجهزة من الإنزيم BLI للرقم 3. معالجة البيانات وتركيبها وفقط أظهرت مراحل الرابطة والانفصال. منحنى البيانات المجهزة باللون الأزرق والأحمر المنحنى المناسب غير الخطية. الخير لصالح: ص2 = 0.984789 ×2 = 0.019109. المعلمة ملزمة القصوى (رماكس) = 0.2875 نيوتن متر (± 0.0006)- اضغط هنا لتحميل هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تم التحقق من غشاء أيون قنوات الأهداف العلاجية الأساسية لما يزيد على 13 في المائة عقاقير المعروفة حاليا لمعالجة مجموعة متنوعة من الأمراض التي تصيب الإنسان، بما في ذلك18من اضطرابات القلب والأوعية الدموية والجهاز العصبي. التصحيح المشبك تسجيل، المعيار الذهبي لقياس الوظيفية لقنوات أيون مع جزيئات صغيرة، قد استخدمت على نطاق واسع لايون قناة يغاندس الفرز. لا يمكن إثبات هذه النهج الكهربية بيد عما إذا كانت الجزيئات الصغيرة بربط قناة مباشرة أو لا19، لأن الجزيئات الصغيرة يمكن أن تعمل على البروتينات أو الممرات بين الخلايا التي تتفاعل مع القناة أخرى. بالمقارنة مع تستخدم على نطاق واسع المقايسة ملزم يجند المشعة وغيرها من الأساليب استخداماً بيوسينسور خالية من التسمية، BLI له مزايا كبيرة من حيث ترتيب بسيط نسبيا، مرحلة تكوين الجمعيات دون قيود، وعالية في جميع أنحاء، تصميم التحليل أقرب إلى النظام في فيفو وحاجة لكمية صغيرة من البروتين المعطل تداولها (ميكروغرام قليلة)، وأنها يمكن أن توفر أفكاراً تفصيلية في البيانات الحركية5،،من620.
أجل أقصى محاكاة الحالة في فيفو ، نحن تنقية البروتينات قناة hEAG1 الوظيفية من الثدييات ستابلي نظام التعبير. ويرد على بروتوكول سهلة وفعالة لتنقية وتحديد الهوية من البروتين قناة أيون أوفيريكسبريسيد من خلايا الثدييات ملتصقة. بعض النصائح الهامة لنجاح تنقية البروتينات الغشاء: 1) عملية تنقية يمكن تقليص أو زيادة حسب وفرة تعبير البروتينات الاهتمام في نظم التعبير الثدييات؛ 2) نحن تنصهر بعلامة علم عند المحطة ج من قناة hEAG1 لتسهيل تنقية هذا البروتين مع الخرز تقارب العلم المناهضة استخدام البروتوكول التجاري كيت وتنقية. مقياس الكهربية أثبتت أن الانصهار العلم له أي تأثير على وظيفة هذه القناة15؛ 3) الحضانة الخليط من حبات المضادة العلم واستخراج البروتين بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية مع الهز برفق مفيد لالتقاط البروتين الانصهار العلم؛ 4) استخدام تنقية تقارب، يمكننا الحصول على ما يكفي من البروتين قناة أيون hEAG1 من أربعة أطباق 15 سم مع أعلى الخلية 90% كونفلوينسي لعملية الفحص مرة واحدة.
البروتينات قناة hEAG1 المنقي بيوتينيلاتيد باستخدام البيوتين الزائدة (3-10 إضعاف) وتبادل المخزن المؤقت الحل مع SD المخزن المؤقت للمقايسة BLI المزيد. البيوتين الزائدة يمكن تعديل شكل أقصى بروتين غشائي القناة لزيادة كفاءة المغلفة على سطح نصائح بيوسينسور، والمقايسة SD المخزن المؤقت التي تحتوي على تركيزات منخفضة من جيش صرب البوسنة وبوليسوربيت 20 يمكن تقليل غير محدد ملزم9. على الرغم من الشروع في هذه العمليات الرئيسية، التفاعلات غير المثالية لا يزال يمكن أن توجد خاصة عند إجراء دراسة ربط مع تركيزات عالية من جزيء الصغيرة، التي يمكن عدم التحديد منضمة إلى السطح من أجهزة الاستشعار SA والنتيجة تفاعل إيجابية كاذبة سينين المنحنى المبين في الشكل 4A. وهكذا، بروتوكول طرح إشارة مزدوجة لا تزال ضرورية للحصول على نتائج يمكن الاعتماد عليها عن طريق طرح الروابط غير محددة بما في ذلك التفاعلات بين أجهزة الاستشعار وجزيء صغير، بيوتينيلاتيد hEAG1 البروتين جزيء صغير للحل، و أجهزة الاستشعار مع حل جزيء صغير. تحتاج هذه العملية الطرح إشارة مزدوجة أربعة أجهزة استشعار العوامل البيولوجية الاعتداء لمرة واحدة. وسوف تكون مغلفة اثنين من أجهزة استشعار العوامل البيولوجية مع بروتينات الغشاء بيوتينيلاتيد ودعوى الاعتداء التفاعل مع جزيء صغير والمخزن المؤقت الخاص به. وسوف يكون آخر اثنين من أجهزة الاستشعار ترطب مع المخزن المؤقت للتنمية المستدامة، والتفاعل مع جزيء صغير والمخزن المؤقت الخاص به. فقط تفاعل بروتين غشائي معطلة بيوسينسور وجزيء صغير يظهر إشارة إيجابية وبقية التفاعل ثلاث إشارات العمل كعناصر تحكم (الشكل 2). باستخدام هذا الإجراء، كما هو موضح في الشكل 3 و 4 الشكل، لدينا نتائج وضوح إثبات تفاعل قوي بين hEAG1 قناة البروتينات والنقطة2 وإظهار الشخصية الاعتماد على تركيز. يجب الإشارة إلى أن هناك العديد من القيود في القياس لدينا. على سبيل المثال، هناك بعض الدهون غشاء الأخرى التي يمكن أن تكون ملزمة للبروتين المنقي قناة. أيضا، لا يزال من غير الواضح ما إذا كان البروتين المنقي مرتبط احتفاظ المطابقة والنشاط الأصلي. من الصعب جداً قياس تكوينات حقيقية من الدهون جزيء صغير عندما تتفاعل مع البروتين. على الرغم من أن عمليات مفصلة غير معروفة، دراستنا تظهر أن حركية ملزم ب BLI متسقة مع تلك المتأتية عن طريق تسجيل الكهربية، مما يجعل تطبيق BLI رواية لايون قناة التفاعل جزيء صغير البروتين في طريقة تكميلية.
باختصار، تؤكد دراستنا أنها استراتيجية موثوقة بتنقية بروتين غشائي الوظيفية من نظام التعبير الثدييات للكشف عن التفاعل المباشر مع ما يغاندس. التطبيق الناجح ل BLI للتفاعل جزيء صغير البروتين غشاء سيسهل استكشاف إليه وفحص جزيء صغير في أيون قناة اكتشاف العقاقير.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.
Acknowledgments
أيد هذا العمل مركز بيو-معرف وسيتو صندوق البحوث المتعددة التخصصات في الطب والهندسة (YG2016QN66) ومؤسسة العلوم الطبيعية الصينية الوطنية (31271217)، والوطنية الأساسية البحث البرنامج من الصين (2014CB910304).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/High Glucose Medium | HyClone | SH30243.01 | |
| Phosphate Buffered Saline (1x) | HyClone | SH30256.01 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 1697550 | |
| Cell Culture Dish | Corning | 430599 | 150 mm X 25 mm |
| Nonidet P-40 Substitute | Amresco | E109 | |
| Sodium chloride | BBI Life Sciences | A610476 | |
| Potassium chloride | BBI Life Sciences | A610440 | |
| Bovine Serum Albumin | BBI Life Sciences | A600332 | |
| Polyoxyethylene-20-Sorbitan Monolaurate | BBI Life Sciences | A600560 | |
| ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma | A2220 | |
| 3x FLAG peptide | Sigma | F4799 | |
| Octet-RED96 | Pall/FortéBio | 30-5048 | |
| Data Acquisition software | Pall/FortéBio | Version 7.1 | |
| Data Analysis software | Pall/FortéBio | Version 7.1 | |
| Biosensor/Streptavidin | Pall/FortéBio | 18-5019 | |
| Microtiter plate | Greiner Bio-one | 655209 | |
| Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin | ThermoFisher | 21338 | |
| Centrifugal Machine | ThermoFisher | 75004250 | |
| PageRuler Prestained Protein Ladder | ThermoScientific | 318120 | |
| Ultrafiltration device | MILLIPORE | UFC503008 | NMWL of 30 kDa |
| phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2) | Sigma | P9763 | |
| Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody | Sigma | F1804 | 1:2000 dilution |
| goat anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | 1:5000 dilution |
| Enhanced BCA Protein Assay Kit | Beyotime | P0010 | |
| Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 04693159001 | |
| Amersham Imager 600 Imaging System | GE Healthcare Bio-Sciences | ||
| Western blot system | BIO-RAD |
References
- Peetla, C., Stine, A., Labhasetwar, V. Biophysical Interactions with Model Lipid Membranes: Applications in Drug Discovery and Drug Delivery. Mol. Pharm. 6 (5), 1264-1276 (2009).
- van de Waterbeemd, H., Smith, D. A., Beaumont, K., Walker, D. K. Property-based design: Optimization of drug absorption and pharmacokinetics. J. Med. Chem. 44 (9), 1313-1333 (2001).
- Papo, N., Shai, Y. Exploring peptide membrane interaction using surface plasmon resonance: Differentiation between pore formation versus membrane disruption by lytic peptides. Biochemistry. 42 (2), 458-466 (2003).
- Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis. Nat. Commun. 1, 100-106 (2010).
- Fechner, P., et al. Size does matter! Label-free detection of small molecule-protein interaction. Anal. Bioanal. Chem. 406 (17), 4033-4051 (2014).
- Wallner, J., Lhota, G., Jeschek, D., Mader, A., Vorauer-Uhl, K. Application of Bio-Layer Interferometry for the analysis of protein/liposome interactions. J. Pharm. Biomed. Anal. 72, 150-154 (2013).
- Wartchow, C. A., et al. Biosensor-based small molecule fragment screening with biolayer interferometry. J. Comput. Aided Mol. Des. 25 (7), 669-676 (2011).
- Ekiert, D. C., et al. A Highly Conserved Neutralizing Epitope on Group 2 Influenza A Viruses. Science. 333 (6044), 843-850 (2011).
- Shah, N. B., Duncan, T. M. Bio-layer Interferometry for Measuring Kinetics of Protein-protein Interactions and Allosteric Ligand Effects. J. Vis. Exp. (84), e51383 (2014).
- Occhiodoro, T., et al. Cloning of a human ether-a-go-go potassium channel expressed in myoblasts at the onset of fusion. Febs Lett. 434 (1-2), 177-182 (1988).
- Pardo, L. A., Stuhmer, W. Eag1: An emerging oncological target. Cancer. Res. 68 (6), 1611-1613 (2008).
- Simons, C., et al. Mutations in the voltage-gated potassium channel gene KCNH1 cause Temple-Baraitser syndrome and epilepsy. Nat. Genet. 47 (1), 73-77 (2015).
- Kortum, F., et al. Mutations in KCNH1 and ATP6V1B2 cause Zimmermann-Laband syndrome. Nat. Genet. 47 (6), 661-667 (2015).
- Han, B., Tokay, T., Zhang, G. M., Sun, P., Hou, S. Eag1 K+ Channel: Endogenous Regulation and Functions in Nervous System. Oxid. Med. Cell. Longev. 2017, (2017).
- Han, B., et al. Human EAG channels are directly modulated by PIP2 as revealed by electrophysiological and optical interference investigations. Sci. Rep. 6, (2016).
- Do, T., et al. A rapid method for determining dynamic binding capacity of resins for the purification of proteins. PREP. 60 (2), 147-150 (2008).
- Rohacs, T., Chen, J., Prestwich, G. D., Logothetis, D. E. Distinct specificities of inwardly rectifying K+ channels for phosphoinositides. J. Biol. Chem. 274 (51), 36065-36072 (1999).
- Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. How many drug targets are there? Nat. Rev. Drug Discov. 5 (12), 993-996 (2006).
- Suh, B. C., Hille, B. PIP2 is a necessary cofactor for ion channel function: How and why? Annu. Rev. Biophys. 37, 175-195 (2008).
- Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms. J. Vis. Exp. (122), e55659 (2017).
