Summary
Protokollen her beskriver samspillet renset hEAG1 ion kanal protein med små molekyl lipid ligand phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2). Målingen viser at BLI kan være en potensiell metode for romanen lite molekyl ion kanal ligand screening.
Abstract
Bio-lags interferometry (BLI) analysen er et verdifullt verktøy for måling av protein-protein og protein-små molekyl interaksjoner. Her beskriver vi først anvendelsen av denne etiketten-fri teknikken å studere samspillet av menneskelig EAG1 (hEAG1) kanal proteiner med små molekyl PIP2. hEAG1 kanal har vært anerkjent som potensielle terapeutiske mål på grunn av sin avvikende overuttrykte kreft og noen få-av-funksjon mutasjoner involvert i enkelte typer nevrologiske sykdommer. Vi renset hEAG1 kanal proteiner fra et pattedyr stabil uttrykk og målt samspillet med PIP2 BLI. Vellykket måling av the kinetics av binding mellom hEAG1 protein og PIP2 viser at BLI analysen er en potensiell høy gjennomstrømming tilnærming brukes for romanen lite molekyl ligand screening i ion kanal farmakologi.
Introduction
Målretting cellen overflaten tilgjengelig ion kanal proteiner med små molekyler tilbyr et enormt potensial for ligand screening og biologiske stoffet funnet1,2,3. Dermed er et velegnet verktøy nødvendig for å studere samspillet mellom ion kanal og små molekyler og deres tilhørende funksjon. Patch-klemme innspillingen har vist seg for å være en unik og uerstattelig metode i ion kanal funksjonelle analysen. Imidlertid bestemme om de små molekylene direkte målrette ionekanaler krever andre teknologier. Tradisjonelt ble radioaktivt ligand binding analysen brukt til å observere kinetics bindingen mellom små molekyl og dens mål ion kanal protein. Bruk av denne teknikken er imidlertid begrenset på grunn av sitt krav i radioaktive merking og gjenkjenning. Videre hindrer forutsetning til å merke små ligand i studien dens mange typer ionekanaler uten kjent bestemt ligand. Noen etikett-gratis teknikker som NMR spektroskopi, røntgen Diffraksjon, Mikroskala thermophoresis (MST)4 og overflate plasmon resonans (SPR) har blitt brukt å måle protein-små molekyl interaksjoner. Men disse typer analyser vanligvis gir ikke tilstrekkelig informasjon på grunn av problemer med å få full lengde protein, lav oppløsning dynamics, lav overføringshastighet og høye kostnader5. Kontrast disse teknikkene, er bio-lags Interferometry (BLI) nye romanen etikett-fri metode å overvinne disse ulempene for å oppdage protein-små molekyl interaksjoner av immobilizing en ørsmå mengder av protein eksempler på overflater av Biosensor og måle optisk endring signaler6,7. Som en lovende biosensor plattform, BLI teknikk er allerede utført for å observere samspillet av små molekyler med naturlig vann løselig proteiner som et menneskelig monoklonalt antistoff CR80208 og detaljert analysen prosedyren har rapportert en forrige artikkel9. Selv om nøkkelrolle ion kanal protein for nye terapeutiske mål funn har vært anerkjent, har ion kanal protein-små molekyl samhandling analysen basert på BLI ikke blitt beskrevet.
Menneskelige Eter à go-go kanaler (hEAG1) er uttrykt i ulike typer av kreftceller og sentralnervesystemet som gjør kanal en potensielle terapeutiske mål for mange kreft og neuronal lidelser10,11, 12,13,14. Elektrofysiologiske studien i vår lab har bekreftet den hemmende effekten av phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2) på hEAG1 kanal15. Basert på resultatene, testing PIP2 direkte interaksjon med hEAG1 ved hjelp av BLI teknikk kan være som en modell for andre typer ion kanal protein-små molekyl sammensatte samhandling spesielt for kanalene mangler spesifikke ligander. I henhold til instruksjonene BLI analysen, vi forberedt biotinylated hEAG1 proteiner og immobilisert dem på overflaten av streptavidin (SA) biosensor tips etterfulgt av samhandling dem til PIP2 løsninger å observere deres direkte binding mellom de protein og lipid. Etter feste PIP2 til hEAG1 protein belagt overflaten, tykkelsen på lag på overflaten øker, som direkte korrelerer spectral Skift og kan måles i sanntid16. Bindende kinetics kan fastsettes en positiv endring i foreningen trinn og en negativ endring i dissosiasjon trinn. Etter dette prinsippet, vi renset funksjonelle hEAG1 ion kanal protein fra HEK-239T stabile uttrykk system med affinitet rensing metoden for å opprettholde i vitro funksjonelle staten, deretter målt the kinetics av binding av ulike konsentrasjon PIP2, og gitt en semblable kinetic data som observert i elektrofysiologiske målinger15. Lukk korrespondanse mellom resultatene fra BLI og elektrofysiologiske målinger viser for første gang hensiktsmessigheten av BLI et riktig analytiske verktøy for ion kanal membran protein-små molekyl interaksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: HEK-293T celle linjen kontinuerlig uttrykke flagg-merket hEAG1 kanal protein er konstruert av transfecting en pCDH lentiviral plasmider inneholder DNA sekvensen av hEAG1 med et flagg på distale C-terminus i HEK-293T celler etterfulgt av den puromycin-resistente utvalg som tidligere beskrevet15.
1. affinitet rensing av flagg-merket hEAG1 kanal Protein fra HEK-293T celler
- Tine celler stabilt uttrykke hEAG1 kanaler fra flytende nitrogen i det varme vannet (37 ° C) raskt. Frø cellene (ca 5 x 106 frosne celler) i 10 cm parabol. Vokse cellen overnatter i Dulbeccos endret Eagle's (DMEM) medium supplert med 8 mL 10% fosterets bovin serum (FBS), 100 enheter/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 4 mM L-glutamin og endret mediet neste dag.
- Sjekk GFP fluorescens av disse HEK-293T-celler med fluorescerende mikroskop for å sikre høy andel av celler uttrykke stabilt hEAG1 kanaler i culturing systemet. Eksponentielt trypsinize voksende cellene med 1 mL av 0,25% trypsin i 1 min i romtemperatur og thenadd 2 mL serum inneholder kultur væske å avslutte fordøyelsen. Overføre 400 μL celle suspensjon til en 15 cm rett som inneholder 15 mL av komplett DMEM medium. Tilberede fire 15 cm retter totalt.
-
Høste disse cellene etter 2-3 dager kultur når cellene på ca 90% confluency.
- Fjerne vekstmediet fra cellene og vask dem to ganger med 4 mL fosfat bufret saltvann (1 x PBS, pH = 7.4).
- Kast PBS etter vask.
- Skrape cellene til 2 mL 1 x PBS for hver rett ved hjelp av cellen skrape og overføre skrapte cellene med 1 mL Pipetter i en 15 mL tube.
- Sentrifuge celle suspensjon i 5 min 420 x g på 4 ° C.
- Dekanter og kast nedbryting.
- Resuspend celle pellet i totalt 4 mL lyseringsbuffer (10 mM HEPES, 1, 5 mM MgCl2, 10 mM NaCl, 1% NP-40, pH 7.0, inneholdt komplett protease hemmer) i 30 min på is og vortex grundig i lysate hvert 10 min.
- Sentrifuge cellen lysate i 10 min 12 000 x g på 4 ° C.
- Overføre nedbryting slik 5 mL og holde det på is for omgående bruk.
-
Forberede anti-flagg M2 affinitet harpiks.
- Grundig suspendere harpiks (leveres som en 50% suspensjon i butikken buffer) av mild inversjon sørge flaske anti-flagg M2 affinitet gel er en ensartet suspensjon av gel perler.
- Øyeblikkelig overføre 400 μL suspensjon slik kjølt 1,5 mL.
- Sentrifuge suspensjon for 30 s 8 000 x g ved 4 ° C og kast nedbryting nøye for å vaske ut store bufferen.
- Legge til 500 μL 1 x PBS harpiks og utsette pellets med 1 mL pipette. Deretter sentrifuge suspensjon for 30 s 8 000 x g ved 4 ° C og kast supernatant PBS nøye. Gjenta disse wash trinn å fjerne lagrede bufferen.
- Legg til 500 μL protein ekstrakt nedbryting forberedt på trinn 1.3.8 til harpiks pellet suspendere pellet og overføre suspensjon til en ny kjølt 5 mL tube. Gjenta dette trinnet igjen for å sikre at ingen gel perler venstre. Legg ekstraktet venstre protein til blandingen.
- Inkuber blandingen over natten i en shaker på 8 rpm på 4 ° C å fange FLAGGET fusion protein.
- Sentrifuge blandingen etter 12t inkubasjonstiden for 10 min på 1 000 x g på 4 ° C.
- Forkaste nedbryting og vask pellet tre ganger med 500 μL 1 x PBS. Hold det på is for omgående bruk.
-
Elueringsrør flagg hEAG1 protein med 3 x flagg peptid.
- Forberede 3 X flagg elueringsrør løsning. Oppløse 3 X flagg peptid i 500 μL lagerløsning (0,5 M Tris-HCl, 1 M NaCl, pH = 7.5) i en konsentrasjon av 8 μg/μL.
- Tilsett 10 μL 3 x flagg elueringsrør løsning 390 μL PBS skal være en 200 ng/μL siste konsentrasjon løsning.
- Legge til 400 μL 3 x flagg elueringsrør løsning gel perlene forberedt på trinn 1.8.
- Inkuber prøven på shaker 8 RPM 2 h på 4 ° C.
- Sentrifuge harpiks for 30 s på 8 000 x g.
- Overføre nedbryting til en frisk 1,5 mL tube og lagre den på 4 ° C for omgående bruk.
2. konsentrasjon analysen og bekreftelse av renset flagg Fusion hEAG1 av BCA Protein analysen Kit og Western Blotting
- Bestemme konsentrasjonen av renset protein ved hjelp av BCA protein analysen kit ifølge produsentens instruksjoner.
- Bruke 30 μL utvalg for vestlige analyse for å bekrefte interesse protein hadde blitt renset ved hjelp av en anti-flagg antistoff som beskrevet tidligere15.
3. merking renset kanal Protein med Biotin for BLI analysen
- Forberede 5 mg/mL biotin lagerløsning i PBS. For hver test (to biosensors), legger du til en 3-fold molar overskudd av biotin 20 μg renset protein å oppnå en fordel N-terminal biotinylation av rent protein i PBS.
- Inkuber prøven i mørket på is minst 30 min.
- Forberede prøven fortynning (SD) bufferen: PBS med 0,02% polysorbat 20 og 0,1% bovin serum albumin (BSA, pH 7.4).
- Utføre ultrafiltrasjon for å endre bufferen renset kanal protein til SD buffer. Fjerne den ubundne biotin ved å bruke ultrafiltrasjon enheten med molekylvekt cutoff av 30 kDa, legge til SD bufferen og sentrifugering prøven på 12.000 x g, i 10 minutter på 4 ° C.
- Fjerne ultrafiltrate fra sentrifuge tube ultrafiltrasjon enhet, legge til 200 μL SD buffer i filter enheten og sentrifugering prøven på 12.000 x g, i 10 minutter på 4° C. Gjenta denne operasjonen minst tre ganger.
- For å samle bufferen utvekslet eksempel reversert inn filter enheten en 1,5 mL tube og sentrifugering dem på 2000 x g, etter 5 min på 4 ° C. Holde prøven på is for omgående bruk.
4. forberedelse av PIP2 løsning for analysen
- Klargjør lager løsningen av PIP2 (1 mM) i deionisert H2O ved sonicating i 30 min på is som beskrevet tidligere17. Lagre løsningen i hetteglass på 20 ° C og fortynne det til de endelige konsentrasjonene umiddelbart før eksperimenter av energisk vortexing.
5. BLI analysen
- Slå på utstyret og kontroller vinduet "instrument status" for å bekrefte maskinen er "klar" staten å prewarm utstyret minst i 30 min før BLI studien.
- Kontroller at døren til apparatet er lukket før du åpner datainnsamling og velg "Ny Kinetics eksperimentet" i veiviseren for eksperimentet.
- Definere brønnene skal brukes på 96-brønns plate av rett falle i staver for å velge buffer, belastning og prøve. For eksempel brønner, av konsentrasjonen av biotinylated flagg fusion hEAG1 protein bør være innspill som molar (10 μg, 0.09 μM).
- Definere analysen trinnene inkludert planlagte, lasting, association og dissosiasjon. Velg et analysen trinn og dobbeltklikk på den respektive kolonnen. En kopi av analysen definisjonen er angitt for kontrollen sensorer. Angi rpm 1000. Velg 1 min for planlagte trinn og 5-10 minutter for lasting, foreningen og dissosiasjon, henholdsvis. Utfør testen ved romtemperatur (ca 24 ° C).
Merk: Det er to viktigste prosedyrer: lasting biotinylated kanal protein mot og assaying samspillet med små molekyl forbindelser. De kan bli fortsatte kontinuerlig (planlagte, lasting, baseline, association og dissosiasjon). Alternativt kan de bli fortsatte separat å unngå å sløse test forbindelser når første lasting del mislykket. - Velg kolonnene som inneholder sensorer og klikk på "Fyll" for å angi plassering av sensorer i sensor skuffen.
- Se alle forslag for å se etter feil og gå tilbake til rette.
- Angi plasseringen av datafilene og klikk "Go" starte analysen.
Merk: Sensorene må prewetted på minst 10 min i SD buffer, hvis dette trinnet er gjort, så skal hoppes over innstillingen "Forsinket eksperiment start". Hvis ikke, setter en 600 s forsinkelse før prewetting sensorer. - Sette en svart 96-brønns plate i bunnen av skuffen og sett inn A1 hjørnet av platen inn i hakket til sete plate-skuffen. Brønner laste sensorer, 200 μL av analysebuffer per brønn legge inn 2 i raden A og 2 førte i raden B i 96-brønnen platen.
- Forberede en annen svart 96-brønns plate som eksempel platen og fylle brønnene med 200 μL SD buffer i rad B som kontroll eller biotinylated hEAG1 protein løsning (10 μg) i raden A som tildelt under programmering i trinn 5.3.
Merk: Unngå å innføre bobler. - Åpne døren til apparatet og sett inn sensor skuffen og prøve platen til venstre og høyre plate innehaveren, henholdsvis. Kontroller at sensoren skuffen og prøve platen plasseres riktig basert på formen på venstre plate holderen og "A1" markøren til høyre rett plate holderen for. Lukk døren og starte analysen.
6. dataanalyse
- Åpne dataanalyse programvare og laste mappen som inneholder datatypen analysen. Klikk "Behandling" for å få inn i behandling menyen grensesnittet og vi kan se fargerike rå kinetic kurvene.
- Under trinn 1: "Data utvalg", klikk "Sensor valg". På "Sensor magasinet #1" Klikk sensoren brønnene bare wetted med SD buffer og rett falle i staver "Endre Sensor type" til "Referanse Sensor". På den "Sample Plate kart", angi alle ikke-spesifikk bindende brønnene og rett falle i staver "Endre godt type" til "Referanse Well".
- Kryss i boksen før "Subtraksjon" i trinn 2, og velg "Dobbel Reference".
- I trinn 3: "Juster Y aksen", velg "Baseline" som justeringen trinn. "Tid Range", angi de siste 10 s av den opprinnelige (dvs. fra: 0,1 til: 59,8).
- I trinn 4: "Mellom trinn korreksjon", velg "justere til Baseline" å minimere signalet skifter mellom association og dissosiasjon trinnene.
- I trinn 5: "Prosessen", Velg Savitzky-Golay filtrering funksjon i de fleste tilfeller og fortsette "prosessdata".
- Lagre rådata for ytterligere dataanalyse bruke annen programvare i trinn 7: "Lagre resultater".
-
Klikk "analyse | Kurven passer".
- "Skritt å analysere", velg "Association | Dissosiasjon". "Modell", velg 1:1.
Merk: vi velger 1:1 modellen fordi det montert på våre opprinnelige data og unngikk at over montering under 1:2 eller 2:1 modell på grunn av sin høye frihet. Men andre alternativer er tilgjengelig her og passende kan velges for andre passende analyse for ulike bindende modeller av analytt. - "Passende", Velg Global (Full). For "Grupper etter", velg "Farge". Velg "Rmax kobling av Sensor" tillate uavhengig montering av maksimal signal svar (Rmax).
- Klikk "Tilpass Curves!" starte den ikke-lineær regresjonsanalysen. Hill ligningen og enkelt Eksponentialfunksjon ble brukt i vår undersøkelse.
- Klikk "dataeksport | Lagre rapport"lagre passende resultater. Eller klikk "dataeksport | Eksporter passende resultater"lagre rådata til ytterligere grafiske og analyse med annen programvare.
- "Skritt å analysere", velg "Association | Dissosiasjon". "Modell", velg 1:1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi renset flagg fusion hEAG1 kanal protein fra HEK-293T celler stabilt overexpressed hEAG1. Funksjon av dette proteinet blanding har vist ved hjelp av metoden patch-klemme og kvaliteten og spesifisitet renset protein er bekreftet ved Western blot (figur 1). Renset kanal protein er biotinylated å utføre interaksjon analysen med lipider (PIP2) ved hjelp av sanntids BLI analysen. BLI bindende analysen konfigurasjonen er vist i figur 2. En typisk bindende kurve mellom hEAG1 og PIP2 vises i Figur 3. I dette tilfellet 3 μM PIP2 er oppløst i PBS buffer (konfigurasjonen av PIP2 vises i supplerende figur 1), og signalet er analysert ved hjelp av en dobbel referanse subtraksjon protokoll trekke uspesifisert bindingen (de bindende mellom sensoren og PIP2), bakgrunn (samspillet mellom biotinylated hEAG1 protein og PBS), og signalet drift (bindingen mellom sensoren og PBS) forårsaket av sensoren variasjon. Og bindende spor er globalt passer og vist en velsittende overlegg (supplerende figur 2). Også måle vi the kinetics av binding av PIP2 renset hEAG1 kanalen kompleks av rugende proteiner i ulike konsentrasjoner av PIP2. Etter analyse får vi en dissosiasjon konstant (Kd) verdi på 0,35 ±0.04 μM, som ligner på IC50 verdien fra elektrofysiologiske mål15. Disse resultatene viste at BLI analysen er riktig for ion kanal membran proteiner og lipider samhandling analyse.
Figur 1: identifisering av uttrykk, funksjon og spesifisitet av rekombinant hEAG1 protein fra HEK-293T celler av GFP bildebehandling, patch klemme og western blot, henholdsvis. (A) stabil uttrykket hEAG1 HEK-293T systemet er opprettet av monoklonale puromycin-resistente utvalg etter hva med hEAG1-pCDH lentivirus system som gjenspeiles av GFP uttrykk i nesten alle celler. (B) puls protokollen (øverst) og oppå gjeldende spor fra en representant hele celle patch-klemme opptak fra hEAG1 kanaler i en stabil celle i A. Gjeldende er brakt frem av depolarizing spenninger fra holder spenningen av-80 mV til 70 mV trinn 10 mV etterfulgt av repolarisasjon til-80 mV. Cellene er ruges i normal K+ kanalen opptak løsninger som beskrevet tidligere15. Spenning-avhengige utover kalium strøm foreslår at funksjonelle hEAG1 kanaler er svært uttrykt i HEK293T celler. (C) Western blot hEAG1 kanal protein fra renset protein prøver. Anti-flagg antistoffer gjenkjenner en enkelt protein gjeng ~ 110 kDa, demonstrere en full lengde flagg-merket hEAG1 kanal uttrykk. Dette tallet 1 c har blitt endret fra Han et al. 15. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: en skjematisk diagram viser analysen BLI bindingsprotokollen. Fire sensorer brukes parallelt i biotinylated-kanals proteiner eller deres oppløst SD buffer kanal proteiner og referansene. Etter det overføres disse fire sensorer for å analysen fase for å oppdage foreningen og tilknytningene fosfolipider eller løsning bufferen. Plasseringen av kanalen proteiner og fosfolipider bufferen er farget som angitt. Den vannrette røde prikkede linjen angir to hovedtrinnene BLI studie: lasting fase og samhandling analysen fase. Denne figur 2 har blitt endret fra Han et al. 15. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: skjermbilder viser rådata og behandlet i en typisk BLI studie. (A) typisk lasting og balanse kurver viser balanse trinnet (60 s) med SD-buffer (grunnlinje), lessing steg med hEAG1 proteiner (lasting) og referanse kurven equilibrated og lastet med hEAG1 proteiner (lastingen), samtidig måling av to personlige sensor tips. (B) de loddrette røde linjene indikerer overføring av sensorer fra lipid løsningen til buffer løsning under analysen drift. (C) opprinnelige optisk signaler på association og dissosiasjon faser etter behandling dobbel referanse subtraksjon trekke uspesifisert bindende signaler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Resultater fra BLI analysen viser hEAG1 kanal protein direkte samspill med PIP2. (A) skjermbilde viser rådata hEAG1 protein bindingen med PIP2 på konsentrasjon-avhengighet måte (0,03-3 μM). Akkumulert konsentrasjonen av PIP2 merket tilsvarende biosensors' data spor. (B) ømt punkt databehandlingen viser endringen i optiske forstyrrelser i ulike konsentrasjoner av PIP2 i en representant analysen. (C) Kurvetilpasning med Hill ligningen fra toppverdien optiske forstyrrelser signalet måles i ulike PIP2 konsentrasjoner for fastsettelse av likevekt dissosiasjon konstanter (Kd) av interaksjon mellom hEAG1 kanal protein og PIP2 (n = 3). Figur 4B og 4 C har blitt endret fra Han et al. 15. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende figur 1: konfigurasjonen av langkjedede phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2). Klikk her for å laste ned dette tallet.
Supplerende figur 2: skjermen fange av montert overlegget fra BLI analysen av figur 3. Dataene er behandlet og montert og vises bare Association og dissosiasjon. Behandlet kurven er blå og ikke-lineære montering kurve er rød. Godhet av fit: R2 = 0.984789, X2 = 0.019109. Parameteren maksimal binding (Rmax) = 0.2875 nm (± 0.0006). Klikk her for å laste ned dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Membran ionekanaler er bekreftet som primære terapeutiske mål for over 13% av kjente medisiner for behandling av en rekke menneskelige sykdommer, inkludert hjerte og nevrologiske lidelser18. Patch-klemme opptak, har golden standarden for måling av den funksjonelle ion kanaler med små molekyler, vært mye brukt for ion kanal ligander screening. Men kan ikke slike elektrofysiologiske tilnærminger vise om de små molekylene binder til kanal direkte eller ikke19, fordi de små molekylet kan fungere på andre proteiner eller intercellulære trasé som samhandler med kanalen. Sammenlignet med brukte radioaktivt ligand-bindende analysen og andre brukte etikett uten biosensor, har BLI betydelige fordeler i form av relativt enkel ordning, ubegrenset association fase, høy gjennom analysen design nærmere til i vivo systemet og et behov for lite immobilisert protein (noen μg), og det kan gi detaljert innblikk i kinetic data5,6,20.
For å simulere maksimalt i vivo situasjonen, vi renset funksjonelle hEAG1 kanal proteiner fra pattedyr stabilt uttrykk systemet. En enkel og effektiv protokoll for både rensing og identifikasjon av overexpressed ion kanal protein fra tilhenger pattedyrceller presenteres. Noen viktige tips for vellykket rensing av membran proteiner er: 1) en renselsesprosess kan være nedskalert eller skalert opp ifølge uttrykk overflod av interesse proteiner i pattedyr uttrykk systemer; 2) vi smeltet en flagg kode på C endestasjonen til hEAG1 kanal å lette rensing av dette proteinet med anti-flagg affinitet perler med kommersielle kit og rensing protokollen. En elektrofysiologiske målingen viste at fusion flagg har ingen innvirkning på funksjonen til denne kanalen15; 3) inkubering av blandingen av anti-flagg perler og protein ekstra overnatting på 4° C med forsiktig risting er nyttig for å fange FLAGGET fusion protein; 4) bruke affinitet rensing, vi kan få nok hEAG1 ion kanal protein fra fire 15 cm retter med over 90% cellen confluency når analysen prosessen.
Renset hEAG1 kanal proteiner er biotinylated ved hjelp av overflødig biotin (3-10 brett) og utveksle løsning bufferen med SD buffer for videre BLI analysen. Den overskytende biotin kan maksimalt endre membran kanal protein for å effektivisere belegg på overflaten av biosensor tips og SD analysebuffer med lave konsentrasjoner av BSA og polysorbat 20 kan minimere uspesifikke bindende9. Til tross for fortsetter disse nøkkeloperasjoner, ikke-ideelle samhandlingene fortsatt kunne eksistere særlig når utføre en bindende studie med høy konsentrasjon av små molekyl, som kunne nonspecifically bundet til overflaten av SA sensorer og resultatet av falske positive samhandling som cyanine kurven vises i figur 4A. Dermed en dobbel referanse subtraksjon protokoll er fortsatt nødvendig for å få pålitelige resultater ved å trekke uspesifisert bindingene inkludert samspillet mellom sensoren og små molekyl, biotinylated hEAG1 protein med små molekyl løsning, og sensorene med små molekyl. Denne doble referanse subtraksjon operasjonen trenger fire biosensors for en analysen. To biosensors vil være belagt med biotinylated membran proteiner og fortsetter samspillet analysen med små molekyl og bufferen. De andre to sensorene vil være fuktet med SD buffer og samspill med små molekyl og bufferen. Bare samspillet membran protein immobilisert biosensor og små molekyl viser positive signalet og resten av tre samhandling signaler arbeid som kontrollene (figur 2). Ved hjelp av denne prosedyren, som vist i Figur 3 og Figur 4resultatene tydelig demonstrere den sterke vekselvirkningen mellom hEAG1 kanal proteiner og PIP2 og viser en konsentrasjon-avhengighet-profil. Det må påpekes at det er flere begrensninger ved våre mål. For eksempel, er det noen andre membran lipider som kan binde til renset kanal protein. Det er også ennå ikke klart om forankret renset protein at deres opprinnelige conformation og aktivitet. Det er svært vanskelig å måle virkelige konfigurasjoner av små molekyl lipider når de samhandler med protein. Selv om detaljert prosesser er ukjent, vår studie viser at bindingen kinetics av BLI er konsistent avledet av elektrofysiologiske innspillingen gjør romanen BLI programmet for ion kanal protein-små molekyl samhandling i en utfyllende måte.
Oppsummert bekrefter våre studien at det er en pålitelig strategi ved rensing funksjonelle membran protein fra pattedyr uttrykk systemet å oppdage den direkte interaksjonen med sin ligander. Bruk av BLI membran protein-små molekyl interaksjon vil lette lite molekyl screening og mekanisme leting i ion kanal stoffet funnet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Bio-ID Center og SJTU tverrfaglig forskning fondet i medisin og Engineering (YG2016QN66), National Natural Science Foundation i Kina (31271217) og National grunnleggende forskning Program i Kina (2014CB910304).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/High Glucose Medium | HyClone | SH30243.01 | |
| Phosphate Buffered Saline (1x) | HyClone | SH30256.01 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 1697550 | |
| Cell Culture Dish | Corning | 430599 | 150 mm X 25 mm |
| Nonidet P-40 Substitute | Amresco | E109 | |
| Sodium chloride | BBI Life Sciences | A610476 | |
| Potassium chloride | BBI Life Sciences | A610440 | |
| Bovine Serum Albumin | BBI Life Sciences | A600332 | |
| Polyoxyethylene-20-Sorbitan Monolaurate | BBI Life Sciences | A600560 | |
| ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma | A2220 | |
| 3x FLAG peptide | Sigma | F4799 | |
| Octet-RED96 | Pall/FortéBio | 30-5048 | |
| Data Acquisition software | Pall/FortéBio | Version 7.1 | |
| Data Analysis software | Pall/FortéBio | Version 7.1 | |
| Biosensor/Streptavidin | Pall/FortéBio | 18-5019 | |
| Microtiter plate | Greiner Bio-one | 655209 | |
| Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin | ThermoFisher | 21338 | |
| Centrifugal Machine | ThermoFisher | 75004250 | |
| PageRuler Prestained Protein Ladder | ThermoScientific | 318120 | |
| Ultrafiltration device | MILLIPORE | UFC503008 | NMWL of 30 kDa |
| phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2) | Sigma | P9763 | |
| Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody | Sigma | F1804 | 1:2000 dilution |
| goat anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | 1:5000 dilution |
| Enhanced BCA Protein Assay Kit | Beyotime | P0010 | |
| Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 04693159001 | |
| Amersham Imager 600 Imaging System | GE Healthcare Bio-Sciences | ||
| Western blot system | BIO-RAD |
References
- Peetla, C., Stine, A., Labhasetwar, V. Biophysical Interactions with Model Lipid Membranes: Applications in Drug Discovery and Drug Delivery. Mol. Pharm. 6 (5), 1264-1276 (2009).
- van de Waterbeemd, H., Smith, D. A., Beaumont, K., Walker, D. K. Property-based design: Optimization of drug absorption and pharmacokinetics. J. Med. Chem. 44 (9), 1313-1333 (2001).
- Papo, N., Shai, Y. Exploring peptide membrane interaction using surface plasmon resonance: Differentiation between pore formation versus membrane disruption by lytic peptides. Biochemistry. 42 (2), 458-466 (2003).
- Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis. Nat. Commun. 1, 100-106 (2010).
- Fechner, P., et al. Size does matter! Label-free detection of small molecule-protein interaction. Anal. Bioanal. Chem. 406 (17), 4033-4051 (2014).
- Wallner, J., Lhota, G., Jeschek, D., Mader, A., Vorauer-Uhl, K. Application of Bio-Layer Interferometry for the analysis of protein/liposome interactions. J. Pharm. Biomed. Anal. 72, 150-154 (2013).
- Wartchow, C. A., et al. Biosensor-based small molecule fragment screening with biolayer interferometry. J. Comput. Aided Mol. Des. 25 (7), 669-676 (2011).
- Ekiert, D. C., et al. A Highly Conserved Neutralizing Epitope on Group 2 Influenza A Viruses. Science. 333 (6044), 843-850 (2011).
- Shah, N. B., Duncan, T. M. Bio-layer Interferometry for Measuring Kinetics of Protein-protein Interactions and Allosteric Ligand Effects. J. Vis. Exp. (84), e51383 (2014).
- Occhiodoro, T., et al. Cloning of a human ether-a-go-go potassium channel expressed in myoblasts at the onset of fusion. Febs Lett. 434 (1-2), 177-182 (1988).
- Pardo, L. A., Stuhmer, W. Eag1: An emerging oncological target. Cancer. Res. 68 (6), 1611-1613 (2008).
- Simons, C., et al. Mutations in the voltage-gated potassium channel gene KCNH1 cause Temple-Baraitser syndrome and epilepsy. Nat. Genet. 47 (1), 73-77 (2015).
- Kortum, F., et al. Mutations in KCNH1 and ATP6V1B2 cause Zimmermann-Laband syndrome. Nat. Genet. 47 (6), 661-667 (2015).
- Han, B., Tokay, T., Zhang, G. M., Sun, P., Hou, S. Eag1 K+ Channel: Endogenous Regulation and Functions in Nervous System. Oxid. Med. Cell. Longev. 2017, (2017).
- Han, B., et al. Human EAG channels are directly modulated by PIP2 as revealed by electrophysiological and optical interference investigations. Sci. Rep. 6, (2016).
- Do, T., et al. A rapid method for determining dynamic binding capacity of resins for the purification of proteins. PREP. 60 (2), 147-150 (2008).
- Rohacs, T., Chen, J., Prestwich, G. D., Logothetis, D. E. Distinct specificities of inwardly rectifying K+ channels for phosphoinositides. J. Biol. Chem. 274 (51), 36065-36072 (1999).
- Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. How many drug targets are there? Nat. Rev. Drug Discov. 5 (12), 993-996 (2006).
- Suh, B. C., Hille, B. PIP2 is a necessary cofactor for ion channel function: How and why? Annu. Rev. Biophys. 37, 175-195 (2008).
- Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms. J. Vis. Exp. (122), e55659 (2017).
