Summary
Protokollet här beskriver samspelet mellan renat hEAG1 ion kanal protein med liten molekyl lipid ligand fosfatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2). Mätningen visar att BLI kunde vara en potentiell metod för romanen småmolekylär ion kanal ligand screening.
Abstract
Bio-lager interferometry (BLI) analysen är ett värdefullt verktyg för att mäta protein-protein och protein-liten molekyl interaktioner. Här beskriver vi först tillämpningen av denna roman etikett-fri teknik att studera samspelet mellan mänsklig EAG1 (hEAG1) kanal proteiner med liten molekyl PIP2. hEAG1 kanal har erkänts som potentiella terapeutiska mål på grund av dess avvikande överuttryck i cancer och några vinst-av-funktion mutationer i vissa typer av neurologiska sjukdomar. Vi renas hEAG1 kanal proteiner från däggdjur stabilt uttryck system och mätt samspelet med PIP2 av BLI. Framgångsrik mätning av kinetik av bindningen mellan hEAG1 protein och PIP2 visar att BLI-analysen är en potentiell hög genomströmning-metod som används för romanen småmolekylär ligand screening i ion kanal farmakologi.
Introduction
Inriktning cell surface-tillgängliga ion kanal proteinerna med små molekyler erbjuder en enorm potential för ligand screening och biologiska drug discovery1,2,3. Således behövs ett lämpligt verktyg för att studera interaktionen mellan jonkanal och små molekyler och deras motsvarande funktion. Patch-clamp inspelningen har visat sig vara en unik och oersättlig teknik i ion kanal funktionell analys. Men att avgöra huruvida de små molekylerna direkt rikta jonkanaler kräver andra tekniker. Traditionellt användes radioaktivt ligand bindande analysen att iaktta nedbrytnings-och urlakningshastighet bindning mellan små molekyler och dess målproteinet Jonen kanaliserar. Användningen av denna teknik är dock begränsad på grund av dess krav i radioaktiv märkning och identifiering. Dessutom förhindrar det nödvändiga steget att märka små liganden i studien dess hjälp i många typer av jonkanaler utan känd specifik ligand. Några etikett-fri tekniker såsom NMR spektroskopi, röntgendiffraktion, hur provtagningsutrustningen skall thermophoresis (MST)4 och ytan plasmon resonans (SPR) har använts för att mäta de protein-liten molekyl interaktionerna. Men dessa typer av analyser brukar ge inte tillräcklig information på grund av svårigheten att få den fullängds protein, låg upplösning av dynamics, låg genomströmning och hög kostnad5. Till skillnad från dessa tekniker framstår bio-lager Interferometry (BLI) som en roman etikett-fri metod att övervinna dessa nackdelar för att upptäcka protein-liten molekyl interaktioner genom att immobilisera en små mängder protein prov på ytor biosensor och mäta den optiska ändra signaler6,7. Som en lovande biosensor plattform, utförs redan BLI teknik för att observera samspelet mellan små molekyler med naturligt vatten lösliga proteiner såsom en human monoklonal antikropp CR80208 och detaljerad analysförfarandet har rapporterats i en föregående artikel9. Även om nyckelroll som ion kanal protein för nya terapeutiska mål upptäckt har erkänts, har ion kanal protein-liten molekyl interaktion analysen utifrån BLI inte beskrivits.
Mänskligt eter à go-go kanaler (hEAG1) uttrycks i olika typer av cancerceller och centrala nervsystemet som gör kanal a potentiella terapeutiska mål för många cancerformer och neuronala sjukdomar10,11, 12,13,14. Den elektrofysiologiska studien i vårt labb har bekräftat den hämmande effekten av fosfatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2) på hEAG1 kanal15. Baserat på våra resultat, testa PIP2 direkt interaktion med hEAG1 med hjälp av BLI teknik kan vara som en modell för andra typer av ion kanal protein-liten molekyl sammansatt samspel särskilt för de kanaler som saknas specifika ligander. Enligt instruktionerna BLI analys, vi förberedda biotinylerade hEAG1 proteiner och orörlig dem på ytan av streptividin (SA) biosensor tips följt av interaktion dem till PIP2 lösningar att observera deras direkta bindning mellan de protein och lipid. Efter fastsättning av PIP2 till hEAG1 protein belagda ytan och tjockleken på lagret på ytan ökar, vilket direkt korrelerar de spektrala skiftet och kan mätas i realtid16. Bindande kinetiken kan bestämmas på grund av en positiv förändring i föreningen steg och en negativ förändring i dissociation steg. Enligt denna princip, vi renat det funktionella hEAG1 ion kanal proteinet från HEK-239T stabilt uttryck systemet med hjälp av affinitet reningsmetod att in vitro- funktionella tillståndet, sedan mätt kineticsen av bindningen av olik koncentration PIP2, och gett en semblable kinetiska data som observerats i elektrofysiologiska mätningar15. Nära korrespondensen mellan resultaten från BLI och elektrofysiologiska mätningar visar för första gången BLI lämplighet som ett lämpligt analytiska verktyg för ion kanal membran protein-liten molekyl interaktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Obs: HEK-293T cell raden kontinuerligt uttrycker flagg-märkta hEAG1 kanal protein är konstruerad av transfecting en pCDH lentiviral plasmid som innehåller DNA sekvensen av hEAG1 med en flagga på distala C-terminus i HEK-293T celler följt av den puromycin-resistenta urval beskrivs som tidigare15.
1. affinitet rening av flagg-märkta hEAG1 kanal Protein från HEK-293T celler
- Tina celler som stabilt uttrycker hEAG1 kanaler från flytande kväve in i det varma vattnet (37 ° C) snabbt. Kärna ur cellerna (ca 5 x 106 frysta celler) i en 10 cm skål. Växer cellen övernattning i Dulbeccos modifierade Eagle's (DMEM) medium kompletteras med 8 mL 10% fetalt bovint serum (FBS), 100 enheter/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 4 mM L-glutamin och förändrat mediet nästa dag.
- Kontrollera GFP fluorescensen av dessa HEK-293T celler med ett fluorescerande Mikroskop se till den höga andelen celler stabilt express hEAG1 kanaler i culturing systemet. Trypsinize exponentiellt växande cellerna med 1 mL av 0,25% trypsin för 1 min i rumstemperatur och thenadd 2 mL serum som innehåller kultur vätska att avsluta matsmältningen. Överföra 400 μl cellsuspension till en 15 cm maträtt innehållande 15 mL komplett DMEM medium. Förbereda fyra 15 cm rätter totalt.
-
Skörda dessa celler efter 2 – 3 dagar kultur när cellerna når ca 90% konfluens.
- Ta bort odlingsmedium från cellerna och tvätta dem två gånger med 4 mL fosfatbuffrad koksaltlösning (1 x PBS, pH = 7.4).
- Kassera PBS efter tvätt.
- Skrapa cellerna i 2 mL 1 x PBS för varje maträtt med hjälp av cell skrapa och överföring skrapade cellerna med 1 mL Pipettera till en 15 mL tub.
- Centrifugera cellsuspensionen i 5 minuter vid 420 x g vid 4 ° C.
- Dekantera och kasta bort supernatanten.
- Återsuspendera cellpelleten i totalt 4 mL lyseringsbuffert (10 mM HEPES, 1,5 mM MgCl2, 10 mM NaCl, 1% NP-40, pH 7,0, innehöll komplett proteashämmare) i 30 min på is och vortex grundligt den lysate varje 10 min.
- Centrifugera cellen lysate för 10 min vid 12 000 x g vid 4 ° C.
- Överför supernatanten till en 5 mL tub och hålla den på is för omedelbar användning.
-
Förbereda anti-Flag M2 affinitet kådan.
- Grundligt upphäva kådan (levereras som en 50%-suspension i store buffert) genom varsam inversion att se till att flaskan anti-Flag M2 affinitet gel är en homogen suspension gel pärlor.
- Omedelbart överföra 400 μL suspension till en kyld 1,5 mL tub.
- Centrifugera suspensionen för 30 s vid 8, 000 x g vid 4 ° C och kasta bort supernatanten noga att tvätta ur den store buffert.
- Tillsätt 500 μL 1 x PBS till harts och centrifugerade med 1 mL pipett. Sedan Centrifugera suspensionen för 30 s vid 8, 000 x g vid 4 ° C och Kassera supernatanten PBS noggrant. Upprepa dessa TVÄTTNINGSSTEGET att rensa lagrade bufferten.
- Tillsätt 500 μl protein extract supernatanten beredd vid steg 1.3.8 till harts pelleten centrifugerade och överför till en ny kyld 5 mL tub. Upprepa detta steg igen för att se till att ingen gel-pärlor kvar. Lägg vänster protein extraktet till blandningen.
- Inkubera i blandningen över natten på en shaker vid 8 rpm vid 4 ° C att fånga flaggan fusion proteinet.
- Centrifugera blandningen efter 12 h inkubation i 10 min vid 1, 000 x g vid 4 ° C.
- Avlägsna supernatanten och tvätta pelleten tre gånger med 500 μL 1 x PBS. Hålla den på is för omedelbar användning.
-
Eluering av flaggan hEAG1 protein med 3 x flagga peptid.
- Förbered 3 X FLAG eluering lösning. Lös upp 3 X FLAG peptid i 500 μL stamlösning (0,5 M Tris-HCl, 1 M NaCl, pH = 7.5) vid en koncentration på 8 μg/μL.
- Tillsätt 10 μL 3 x flagga eluering lösning till 390 μL av PBS en 200 ng/μl slutkoncentration lösning.
- Tillsätt 400 μL i 3 x flagga eluering lösning gel pärlorna beredd vid steg 1,8.
- Inkubera provet vid shaker vid 8 rpm för 2 h vid 4 ° C.
- Centrifugera kådan för 30 s vid 8, 000 x g.
- Överför supernatanten till en fräsch 1,5 mL tub och lagra den på 4 ° C för omedelbar användning.
2. koncentration Assay och bekräftelse av renat flagga Fusion hEAG1 av BCA Protein Assay Kit och Western Blotting
- Bestämma koncentrationen av renat protein med hjälp av BCA protein assay kit enligt tillverkarens anvisning.
- Använd 30 μL prov för västra analys för att bekräfta intresse proteinet hade renats genom att använda en anti-Flag antikropp som tidigare beskrivits15.
3. märkning proteinet renad kanal med Biotin för BLI analysen
- Förbereda 5 mg/mL biotin stamlösning i PBS. För varje test (två biosensorer), lägga till en 3-faldig molar överskott av biotin 20 μg renat protein att uppnå en bättre N-terminala biotinylation av renat protein i PBS.
- Inkubera provet i mörkret på isen i minst 30 min.
- Förbereda den prov-förtunningsbuffert (SD): PBS med 0,02% polysorbat 20 och 0,1% bovint serumalbumin (BSA, pH 7,4).
- Utföra ultrafiltrering ändra bufferten av proteinet renad kanal till SD buffert. Ta bort den obundna biotin med hjälp av ultrafiltrering enhet med molekylvikt cutoff av 30 kDa, lägga till SD bufferten och centrifugering provet vid 12 000 x g under 10 minuter vid 4 ° C.
- Bort ultrafiltrat från centrifugröret av ultrafiltrering enhet, tillsätt 200 μl SD buffert i enhetens filter och centrifugering provet vid 12 000 x g under 10 minuter vid 4° C. Upprepa åtgärden minst tre gånger.
- För att samla in den buffert som utbyts prov, omvänd infoga filter enheten i en 1,5 mL tub och centrifugering dem vid 2000 x g, för 5 min vid 4 ° C. Förvara provet på is för omedelbar användning.
4. beredning av PIP2 lösning för analys
- Förbereda stamlösning av PIP2 (1 mM) i avjoniserat H2O av sonicating i 30 min på is som tidigare beskrivna17. Förvara lösningen i glasampuller vid-20 ° C och späd det till de slutliga koncentrationerna omedelbart före experiment av kraftig skakning.
5. BLI Assay
- Slå på utrustning och kontrollera fönstret ”instrumentstatus” för att bekräfta maskinen är ”klar” till prewarm utrustningen minst 30 min innan i BLI-undersökningen.
- Kontrollera att dörren till instrumentet är stängd innan du öppnar programvaran datainsamling och välja ”ny kinetik Experiment” i guiden Experiment.
- Definiera brunnarna som ska användas på plattan med 96 brunnar av rätt klick för att välja buffert, belastning och provet. För prov brunnar, enheten för koncentration av biotinylerade flagga fusion hEAG1 protein bör matas som molar (10 μg, 0,09 μM).
- Definiera de analysstegen inklusive baslinjen, lastning, association och dissociation. Välja ett test steg och dubbelklicka på kolumnen respektive. En dubblett av assay definition anges för kontroll-sensorer. Som 1.000 rpm. Välj 1 min för baslinjen steg och 5 – 10 min för lastning, association och dissociation, respektive. Utför testet vid rumstemperatur (ca 24 ° C).
Obs: Det finns två huvudsakliga tillvägagångssätt: lastning proteinet biotinylerade kanal till sensorer och testmetoder samspelet med liten molekyl föreningar. De kan fortsättas kontinuerligt (baseline, lastning, baslinjen, association och dissociation). Alternativt kan de fortsättas separat att undvika slöseri med föreningarna som test när den första laddades del misslyckade. - Klicka på kolumner som innehåller sensorer och klicka på ”Fill” för att ange placeringen av sensorer i sensorn facket.
- Granska alla planerade åtgärder för att kontrollera för misstag och gå tillbaka till korrigera dem.
- Ange platsen för datafiler och klicka på ”Go” för att påbörja analysen.
Obs: Sensorerna måste prewetted för minst 10 minuter i SD buffert, om detta steg har gjorts, sedan inställningen ”fördröjd experiment start” ska hoppas över. Om så inte är fallet, ange en 600 s fördröjning innan prewetting sensorer. - Satte en svart 96 brunnar platta i botten av facket och sätt in A1 hörnet av plattan i skåran på facket som sittplats för plattan. För brunnar att ladda sensorerna, tillsätt 200 μl analysbuffert per brunn i 2 brunnar i rad A och 2 brunnar i rad B i plattan med 96 brunnar.
- Förbereda en annan svart plattan med 96 brunnar som provet plattan och fyll brunnarna med 200 μL SD buffert i rad B som kontroll eller biotinylerade hEAG1 protein lösning (10 mikrog) i rad A som tilldelas under programmering i steg 5.3.
Obs: Undvik att införa bubblor. - Öppna dörren till instrumentet och infoga sensorn facket och prova plattan i vänster och höger plåt hållaren, respektive. Kontrollera att sensorn fack och prov plattan är placerade korrekt baseras på formen av vänster skylt hållare och ”A1” markören på det övre högra hörnet av rätt tallrik innehavaren. Stäng dörren och starta analysen.
6. dataanalys
- Öppna programvaran dataanalys och laddar den mapp som innehåller analysen data. Klicka på ”behandling” för att komma till gränssnittet för bearbetning-menyn och vi kan se färgglada raw kinetiska kurvorna.
- Under steg 1: ”urval”, klicka ”Sensor Selection”. På ”Sensor facket #1”, klicka på sensorn brunnarna bara fuktad med SD buffert och rätt klick till ”ändra sensortyp” till ”referens Sensor”. På den ' plattan Exempelmappning ”, utse de alla de icke-specifik bindning brunnarna och rätt klick till” ändra väl typ ”till” referens väl ”.
- Kryssa i rutan före ”subtraktion” i steg 2 och punkt ”dubbel referens”.
- I steg 3: ”justera Y Axis”, Välj ”baslinje” som justering steg. För ”tidsintervall”, ange de senaste 10 s av att baslinjen (dvs. från: 0,1 till: 59,8).
- I Steg4: ”Inter steg korrigering”, Välj ”justera baslinjen” att minimera signal förskjutningar mellan föreningen och dissociation.
- I steg 5: ”processen”, Välj Savitzky-Golay filtreringsfunktion i de flesta fall och fortsätta ”bearbeta Data”.
- Spara Raw-Data för ytterligare analys av data med ett annat program i steg 7: ”Spara resultat”.
-
Klicka på ”analys | Kurva montering ”.
- För ”steg att analysera”, välja ”Association | Dissociation ”. För ”modell”, Välj 1:1.
Obs: vi väljer 1:1 modell eftersom det monteras på våra ursprungliga data och undviks möjligheten att under montering under 1:2 eller 2:1 modellen på grund av deras höga frihet. Men andra alternativ finns här och kan väljas lämpligt för andra passande analys för olika bindande modeller av analyten. - För ”montering”, välja Global (Full). För ”Group By”, Välj ”färg”. Välj ”Rmax olänkade av Sensor” att tillåta oberoende montering av maximal signal svar (Rmax).
- Klicka på ”Anpassa kurvor”! att starta en icke-linjär regressionsanalys. Hill ekvation och enda exponentialfunktionen användes i vår studie.
- Klicka på ”Exportera Data | Spara rapport ”att spara passande resultat. Eller klicka på ”Exportera Data | Exportera passande resultat ”att spara raw-data för ytterligare grafritande och data med andra program.
- För ”steg att analysera”, välja ”Association | Dissociation ”. För ”modell”, Välj 1:1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi renat proteinet flagga fusion hEAG1 kanal från HEK-293T celler stabilt överuttryckt hEAG1. Funktionen av detta fusionsprotein har påvisats med hjälp av patch-clamp-metoden och kvalitet och specificitet av renat protein bekräftas genom Western blot (figur 1). Renad kanal proteinet är biotinylerade att utföra ett samspel test med lipider (PIP2) med hjälp av realtid BLI analysen. BLI bindande assay konfigurationen visas i figur 2. En typisk bindande kurva mellan hEAG1 och PIP2 visas i figur 3. I detta fall 3 μM PIP2 är upplöst i PBS-bufferten (konfigurationen av PIP2 visas i kompletterande Figur1) och signalen analyseras med en dubbel referens subtraktion protokoll för att subtrahera icke-specifik bindning (den (bindande mellan sensorn och PIP2), bakgrund (interaktionen mellan biotinylerade hEAG1 protein och PBS) och signal drift (bindningen mellan sensorn och PBS) orsakas av sensorn variabilitet. Och bindande tracen är globalt passar och visat en välsittande overlay (kompletterande figur 2). Vi mäter även, nedbrytnings-och urlakningshastighet bindning av PIP2 till kanalen renat hEAG1 komplex av ruvning proteinerna vid olika koncentrationer av PIP2. Efter analys får vi en dissociation konstant (Kd) värde av 0,35 ±0.04 μM, som är liknande till det IC50 värdet som erhålls från de elektrofysiologiska mätningar15. Dessa resultat visade att BLI analysen är lämpliga för kanal membran protein och lipider interaktion jonanalys.
Figur 1: identifiering av uttryck, funktion och specificitet av rekombinant hEAG1 protein från HEK-293T celler av GFP imaging, patch clamp, och western blot, respektive. (A), stabil uttryck hEAG1 HEK-293T systemet har upprättats av monoklonal puromycin-resistenta urval efter transfection med hEAG1-pCDH lentivirus system vilket framgår av GFP uttryck i nästan alla celler. (B) puls protokoll (överst) och ovanpå nuvarande spår från en representativ helhet-cell patch-clamp inspelning från hEAG1 kanaler i en stabil cell i A. Nuvarande framkallas av depolariserande spänningar från jordbruksföretaget spänningen i -80 mV till 70 mV med steg 10 mV följt av repolarisering till -80 mV. Cellerna inkuberas i normala K+ kanalen inspelning lösningar som tidigare beskrivits15. Spänningsberoende utåt kalium strömmarna föreslår att funktionella hEAG1 kanaler mycket uttrycks i HEK293T celler. (C) Western blot hEAG1 kanal protein från renat protein prover. ANTI-Flags antikroppen erkänner ett enda protein band av ~ 110 kDa, visar en fullängds flagg-märkta hEAG1 kanal uttryck. Denna figur 1 c har ändrats från Han et al. 15. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2: en schematisk bild som visar protokollet BLI bindande assay. Fyra sensorer används parallellt i biotinylerade-kanal proteiner eller deras upplöst SD-buffert för att ladda kanal proteinerna och hänvisningar. Efter det överförs dessa fyra sensorer för att assay fas för att upptäcka föreningen och disassociation med fosfolipider eller sin lösning-buffert. Positionerna för kanal proteiner, fosfolipider och buffert är färgad som anges. Den horisontella röda streckade linjen visar två stora stegen i BLI-undersökningen: lastning och interaktion assay fas. Denna figur 2 har ändrats från Han et al. 15. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3: skärmdumpar visar rådata och bearbetade data i en typisk BLI studie. (A) typisk lastning och Jämviktstiden kurvor visar steget Jämviktstiden (60 s) med SD-buffert (baslinje), lastning steget med hEAG1 proteiner (lastning) och referenskurva jämviktas och laddad med hEAG1 proteiner (laddar), samtidiga mätning av två enskilda sensor tips. (B) de vertikala röda linjerna indikerar den överföring av sensorer från lipid lösningen till buffertlösningen under assay drift. (C) ursprungliga optiska signaler på föreningen och dissociation faserna efter bearbetningen dubbel hänvisning subtraktionen att subtrahera icke-specifik bindning signalerna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Resultat från BLI analysen visar hEAG1 kanal protein direkt interagera med PIP2. (A) Screen capture visar rådata av hEAG1 proteinbindning med PIP2 på koncentration-beroende sätt (0,03 – 3 μM). De ackumulerade koncentrationerna av PIP2 betecknas motsvarar den biosensorer data spår. (B) rå behandling visar förändringarna i optiska störningar i olika koncentrationer av PIP2 i en representativ analys. (C) kurva passar med Hill ekvationen erhålls från toppvärdet av optiska störningar signalen mäts vid olika PIP2 koncentrationer för bestämning av equilibriumen dissociation konstanter (Kd) av samspelet mellan hEAG1 kanal protein och PIP2 (n = 3). Av figur 4B och 4 C har ändrats från Han et al. 15. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Kompletterande Figur1: konfigurationen av långkedjiga fosfatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2). Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Kompletterande figur 2: skärmdump av överlägget monterad från kan BLI haltbestämning av figur 3. Data bearbetas och monteras och visas endast Association och Dissociation faser. Bearbetade data kurvan är blå och ickelinjära montering kurvan är röd. Godhet Fit: R2 = 0.984789, X2 = 0.019109. Parametern maximal bindning (Rmax) = 0.2875 nm (± 0,0006). Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Jonkanaler i membranet har verifierats som de primära terapeutiska mål på över 13 procent av för närvarande kända läkemedel för behandling av en mängd olika sjukdomar, däribland hjärt- och neurologiska störningar18. Patch-clamp inspelning, har den gyllengula standarden för att mäta den funktionella av jonkanaler med små molekyler, använts för ion kanal ligander screening. Dock sådan elektrofysiologiska metoder inte kan visa huruvida de små Molekylerna binder till kanalen direkt eller inte19, eftersom den lilla molekylen har kunnat agera på andra proteiner eller intercellulära vägar som samverkar med kanalen. Jämfört med ofta används radioaktiva ligand bindande assay och andra vanliga etikett-fri biosensor metoder, har BLI betydande fördelar genom en relativ enkla arrangemang, obegränsad association fas, hög hela, assay design närmare för att in vivo-systemet och ett behov av liten mängd immobiliserade protein (några μg), och det kan ge detaljerade inblickar i kinetiska data5,6,20.
För att simulera maximally i vivo situationen, vi renas de funktionella hEAG1 kanal proteinerna från däggdjurs stabilt uttryck systemet. Ett enkelt och effektivt protokoll för både rening och identifiering av proteinet överuttryckt ion kanal från vidhäftande däggdjursceller presenteras. Några viktiga tips för framgångsrik rening av membranproteiner är: 1) reningsprocessen kan antingen vara förminskad eller skalas upp enligt uttryck överflödet av intresse proteiner i däggdjur uttryck system; 2) smält vi en flagga tagg på C terminus hEAG1 kanal att underlätta rening av detta protein med anti-Flag affinitet pärlor använda protokollet kommersiella kit och rening. En Elektrofysiologisk mätning visade att fusion flagga har ingen effekt på funktionen av denna kanal15; (3) inkubering av blandningen av anti-Flag pärlor och protein extract övernattning på 4° C med försiktigt skaka är till hjälp för att fånga flaggan fusion proteinet; (4) med hjälp av affinitet rening, vi kan få tillräckligt hEAG1 ion kanal protein från fyra 15 cm rätter med över 90% cell confluency för en gång analys process.
Renade hEAG1 kanal proteinerna är biotinylerade med hjälp av överskjutande biotin (3-10 gånger) och utbyta lösning bufferten med SD buffert för ytterligare BLI analysen. Den överskjutande biotin kan maximally ändra membran kanal proteinet för att effektivisera bestruket på ytan av biosensor tips och den SD analysbuffert innehållande låga koncentrationer av BSA och polysorbat 20 kan minimera ospecifik bindning9. Trots fortsätter dessa nyckelåtgärder, de icke-ideala interaktionerna fortfarande skulle existera särskilt när du utför en bindande studie med hög koncentration av liten molekyl, som kunde icke-specifikt bundet till ytan av SA sensorer och resultatet i falskt positiva interaktion som cyanin kurvan visas i figur 4A. Således en dubbel referens subtraktion protokoll är fortfarande nödvändigt att få tillförlitliga resultat genom att subtrahera de ospecifika bindningar inklusive samspelet mellan sensorn och liten molekyl, biotinylerade hEAG1 protein med liten molekyl lösning, och sensorerna med liten molekyl. Denna dubbel hänvisning subtraktion behöver fyra biosensorer för en gångs skull assay. Två biosensorer kommer vara belagd med biotinylerade membranproteiner och fortsätter interaktionen assay med liten molekyl och dess buffert. De andra två sensorerna kommer vätas med SD buffert och interagera med liten molekyl och dess buffert. Endast växelverkan av membranprotein orörlig biosensor och liten molekyl visar den positiva signalen och resten av tre interaktion signaler arbete som kontroller (figur 2). Med denna procedur, som visas i figur 3 och figur 4, våra resultat tydligt visar den starka växelverkan mellan hEAG1 kanal proteiner och PIP2 och visa en koncentration-beroende profil. Det måste påpekas att det finns flera begränsningar i vår mätning. Exempelvis finns det vissa andra membran lipider som kunde binda till proteinet renad kanal. Också, det är fortfarande inte klart att om det förankrade renat proteinet håller sin ursprungliga konformation och aktivitet. Det är mycket svårt att mäta de verkliga konfigurationerna av liten molekyl lipider när de interagerar med protein. Även om detaljerade processer är okänd, vår studie visar att bindande kineticsen av BLI är förenligt med de härrör av elektrofysiologiska inspelning, vilket gör romanen BLI ansökan om ion kanal protein-liten molekyl interaktion i en kompletterande sätt.
Sammanfattningsvis bekräftar vår studie att det är en tillförlitlig strategi genom att rena det funktionella membran proteinet från däggdjur uttryck systemet att upptäcka direkt interaktion med dess ligander. En framgångsrik tillämpning av BLI för membran protein-liten molekyl interaktion kommer att underlätta småmolekylära screening och mekanism utforskandet av ion kanal läkemedelsutveckling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av Bio-ID Center och SJTU tvärvetenskapliga forskningsfond i medicin och teknik (YG2016QN66), National Natural Science Foundation Kina (31271217) och nationella grundläggande forskning Program i Kina (2014CB910304).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/High Glucose Medium | HyClone | SH30243.01 | |
| Phosphate Buffered Saline (1x) | HyClone | SH30256.01 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 1697550 | |
| Cell Culture Dish | Corning | 430599 | 150 mm X 25 mm |
| Nonidet P-40 Substitute | Amresco | E109 | |
| Sodium chloride | BBI Life Sciences | A610476 | |
| Potassium chloride | BBI Life Sciences | A610440 | |
| Bovine Serum Albumin | BBI Life Sciences | A600332 | |
| Polyoxyethylene-20-Sorbitan Monolaurate | BBI Life Sciences | A600560 | |
| ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma | A2220 | |
| 3x FLAG peptide | Sigma | F4799 | |
| Octet-RED96 | Pall/FortéBio | 30-5048 | |
| Data Acquisition software | Pall/FortéBio | Version 7.1 | |
| Data Analysis software | Pall/FortéBio | Version 7.1 | |
| Biosensor/Streptavidin | Pall/FortéBio | 18-5019 | |
| Microtiter plate | Greiner Bio-one | 655209 | |
| Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin | ThermoFisher | 21338 | |
| Centrifugal Machine | ThermoFisher | 75004250 | |
| PageRuler Prestained Protein Ladder | ThermoScientific | 318120 | |
| Ultrafiltration device | MILLIPORE | UFC503008 | NMWL of 30 kDa |
| phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2) | Sigma | P9763 | |
| Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody | Sigma | F1804 | 1:2000 dilution |
| goat anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | 1:5000 dilution |
| Enhanced BCA Protein Assay Kit | Beyotime | P0010 | |
| Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 04693159001 | |
| Amersham Imager 600 Imaging System | GE Healthcare Bio-Sciences | ||
| Western blot system | BIO-RAD |
References
- Peetla, C., Stine, A., Labhasetwar, V. Biophysical Interactions with Model Lipid Membranes: Applications in Drug Discovery and Drug Delivery. Mol. Pharm. 6 (5), 1264-1276 (2009).
- van de Waterbeemd, H., Smith, D. A., Beaumont, K., Walker, D. K. Property-based design: Optimization of drug absorption and pharmacokinetics. J. Med. Chem. 44 (9), 1313-1333 (2001).
- Papo, N., Shai, Y. Exploring peptide membrane interaction using surface plasmon resonance: Differentiation between pore formation versus membrane disruption by lytic peptides. Biochemistry. 42 (2), 458-466 (2003).
- Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis. Nat. Commun. 1, 100-106 (2010).
- Fechner, P., et al. Size does matter! Label-free detection of small molecule-protein interaction. Anal. Bioanal. Chem. 406 (17), 4033-4051 (2014).
- Wallner, J., Lhota, G., Jeschek, D., Mader, A., Vorauer-Uhl, K. Application of Bio-Layer Interferometry for the analysis of protein/liposome interactions. J. Pharm. Biomed. Anal. 72, 150-154 (2013).
- Wartchow, C. A., et al. Biosensor-based small molecule fragment screening with biolayer interferometry. J. Comput. Aided Mol. Des. 25 (7), 669-676 (2011).
- Ekiert, D. C., et al. A Highly Conserved Neutralizing Epitope on Group 2 Influenza A Viruses. Science. 333 (6044), 843-850 (2011).
- Shah, N. B., Duncan, T. M. Bio-layer Interferometry for Measuring Kinetics of Protein-protein Interactions and Allosteric Ligand Effects. J. Vis. Exp. (84), e51383 (2014).
- Occhiodoro, T., et al. Cloning of a human ether-a-go-go potassium channel expressed in myoblasts at the onset of fusion. Febs Lett. 434 (1-2), 177-182 (1988).
- Pardo, L. A., Stuhmer, W. Eag1: An emerging oncological target. Cancer. Res. 68 (6), 1611-1613 (2008).
- Simons, C., et al. Mutations in the voltage-gated potassium channel gene KCNH1 cause Temple-Baraitser syndrome and epilepsy. Nat. Genet. 47 (1), 73-77 (2015).
- Kortum, F., et al. Mutations in KCNH1 and ATP6V1B2 cause Zimmermann-Laband syndrome. Nat. Genet. 47 (6), 661-667 (2015).
- Han, B., Tokay, T., Zhang, G. M., Sun, P., Hou, S. Eag1 K+ Channel: Endogenous Regulation and Functions in Nervous System. Oxid. Med. Cell. Longev. 2017, (2017).
- Han, B., et al. Human EAG channels are directly modulated by PIP2 as revealed by electrophysiological and optical interference investigations. Sci. Rep. 6, (2016).
- Do, T., et al. A rapid method for determining dynamic binding capacity of resins for the purification of proteins. PREP. 60 (2), 147-150 (2008).
- Rohacs, T., Chen, J., Prestwich, G. D., Logothetis, D. E. Distinct specificities of inwardly rectifying K+ channels for phosphoinositides. J. Biol. Chem. 274 (51), 36065-36072 (1999).
- Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. How many drug targets are there? Nat. Rev. Drug Discov. 5 (12), 993-996 (2006).
- Suh, B. C., Hille, B. PIP2 is a necessary cofactor for ion channel function: How and why? Annu. Rev. Biophys. 37, 175-195 (2008).
- Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms. J. Vis. Exp. (122), e55659 (2017).
