Summary
Dit verslag beschrijft een protocol voor het meten van de absolute niveaus van plasma miRNA, kwantitatieve real-time omgekeerde transcriptie PCR gebruiken met of zonder voorafgaande versterking. Dit protocol biedt een beter begrip van de hoeveelheid plasma miRNAs en laat de kwalitatieve beoordeling van de bijbehorende gegevens uit verschillende studies of laboratoria.
Abstract
RT-qPCR is een van de meest voorkomende methoden voor de beoordeling van de individuele doelstelling miRNAs. MiRNAs over het algemeen gemeten ten opzichte van een referentie-exemplaar. Deze aanpak is geschikt voor de behandeling van fysiologische veranderingen in gen expressie streefniveau. Absolute kwantificering met behulp van betere statistische analyse is echter een uitgebreide beoordeling van gen expressie niveau de voorkeur verdient. Absolute kwantificering is nog steeds niet gemeen gebruiken. Dit verslag beschrijft een protocol voor het meten van de absolute niveaus van plasma miRNA, met behulp van RT-qPCR met of zonder voorafgaande versterking.
Een vast volume (200 µL) van de EDTA-plasma bereid was uit het bloed verkregen van de femorale ader van bewuste cynomolgus apen (n = 50). Totaal RNA is geëxtraheerd met behulp van commercieel verkrijgbare systeem. Plasma miRNAs werden gekwantificeerd door de sonde gebaseerde RT-qPCR testen waarin miRNA-specifieke vooruit-/ achteruitspoelen PCR primers en sonde. Standaard curven voor absolute kwantificering werden gegenereerd met behulp van commercieel verkrijgbare synthetische oligonucleotides van RNA. Een synthetische cel-miR-238 werd gebruikt als een externe regelfunctie voor normalisatie en kwaliteit beoordeling. De miRNAs die kwantificering cyclus (Cq) waarden boven 35 toonde waren vooraf versterkte voorafgaand aan de qPCR stap.
Onder de 8 miRNAs onderzocht, waren miR-122, miR-133a en miR-192 detecteerbare zonder voorafgaande versterking, terwijl miR-1, miR-206 en miR-499a pre amplificatie vanwege hun lage expressie niveaus vereiste. MiR-208bis en miR-208b waren niet aantoonbaar zelfs na pre versterking. Monster verwerking efficiëntie werd beoordeeld door de Cq-waarden van de puntige cel-miR-238. Bij deze methode assay technische variatie werd geschat op minder dan 3-voudig en de ondergrens van kwantificering (Ondergrens) was 102 kopie/µL, voor de meeste van de onderzochte miRNAs.
Dit protocol biedt een betere schatting van de hoeveelheid plasma miRNAs, en kwaliteitsbeoordeling van de overeenkomstige gegevens van verschillende studies. Gelet op dat het geringe aantal miRNAs in lichaamsvloeistoffen, pre versterking is nuttig ter verbetering van de opsporing van slecht uitgedrukt miRNAs.
Introduction
Een toenemend aantal studies zijn het verkennen van microRNAs (miRNAs) als biomarkers voor de diagnose en prognose van kanker, of controle en opsporen van andere ziekten in nonclinical en klinische studies1,2,3 . Kwantitatieve real-time omgekeerde transcriptie PCR (RT-qPCR) is één van de meest voorkomende methoden gebruikt ter beoordeling van de individuele doelstelling miRNAs, omdat deze techniek gevoeliger is dan microarray4 en RNA sequencing platformen5 gebaseerde. In het algemeen, wordt miRNA expressie gemeten ten opzichte van een referentie-exemplaar met behulp van de ΔCq methode6. Deze aanpak is geschikt voor het onderzoek van fysiologische veranderingen in gen expressie streefniveau. Relatieve kwantificering van de circulerende miRNAs heeft echter hulpprogramma beperkte vanwege hun kleine hoeveelheden. Daarnaast, maakt technische variatie het moeilijk te vergelijken van de resultaten van verschillende studies, omdat verschillende laboratoria de RT-qPCR experimentele protocollen anders aanpassen, wat leidt tot een inconsistente of zelfs tegenstrijdige van resultaten verschillende studies7.
Met het oog op de hierboven genoemde bezorgdheid, wellicht absolute kwantificering meer geschikt voor de beoordeling van de kleine hoeveelheden miRNAs in lichaamsvloeistoffen. De absolute kwantificering methode gebruikt een standaard curve gegenereerd op basis van bekende concentraties van synthetische oligonucleotides van RNA die identiek in volgorde aan de bijbehorende doelstelling miRNA8 zijn. De gezondheid en het milieu Sciences Institute (HESI) technisch comité op Genomics onlangs uitgevoerde uitgebreide studies te vergelijken van de resultaten van absolute metingen van plasma miRNAs, op meerdere test sites. De resultaten toonden aan dat met behulp van een standaardprotocol voor de absolute kwantificatie van miRNAs vergelijkbare resultaten opgeleverd in de test op meerdere sites9. De RT-qPCR assay methode beschreven in de huidige studie is vrijwel identiek aan het standaard protocol van de HESI, waaronder multiplexed analyse van meerdere miRNA doelen en pre versterking op de steun van de opsporing van lage expressie miRNAs.
In deze studie, een vast volume (200 µL) van de EDTA-plasma bereid uit het bloed verkregen van de femorale ader van bewuste cynomolgus apen (n = 50) gebruikte10was. Het volgende protocol beschrijft de methode voor de bereiding van de monsters van de plasma, winning van miRNA en RT-qPCR, met inbegrip van pre versterking. Wat nog belangrijker is, is aanvullende technische informatie over het protocol opgenomen, zodat de hoeveelheid doel miRNAs in de monsters kan worden gevalideerd in combinatie met een goed opgeleide proces. Eerst was de standaard curve van elke miRNA gevalideerd voor haar individuele registratiebereik, voorafgaand aan de kwantificering in biologische monsters. Ten tweede, de kwaliteit van de huidige methodiek werd uitvoerig geëvalueerd door middel van Cq waarden van een externe regelfunctie (cel-miR-238). Daarom levert dit platform meer informatieve en betrouwbare gegevens voor het vergelijken van de resultaten van verschillende studies of laboratoria.
De profielen van de 8 miRNAs in dit verslag zijn opgenomen als representatieve resultaten van de hier beschreven methode voor de bepaling. Deze miRNAs hebben voorgesteld als potentiële veiligheid biomarkers met weefsel schade aan de lever (miR-122 en miR-192), hart (miR-1, miR-208bis miR-208b en miR-499a), en skeletspieren (miR-133a en miR-206) in knaagdieren en de mens3geassocieerde, 11,12,13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten werden goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité van Daiichi Sankyo Co., Ltd.
1. de monstervoorbereiding
- Het verzamelen van bloed (ten minste 0,5 mL) van de femorale ader van cynomolgus apen in EDTA 2K-bevattende buizen.
Opmerking: Citraat en heparine zijn niet aanvaardbaar omdat deze anticoagulantia latere PCR14,15 remmen. - Leg de verzamelde monsters onmiddellijk op ijs en proces voor plasma isolatie binnen 2 uur van collectie.
- Centrifugeer de monsters bij 10.000 x g bij 4 ° C gedurende 5 minuten.
- Breng de bovendrijvende substantie in een 2 mL microtube, gevolgd door centrifugatie bij 16.000 x g bij 4 ° C voor 5 min om cel puin en residuele bloedplaatjes te verwijderen.
Opmerking: Kwantificering van miRNAs kan aanzienlijk beïnvloed worden door bloedplaatjes besmetting16. - Plaats 200 µL aliquots van het supernatans dat in vers 2 mL-slangen en bewaren bij-80 ° C tot gebruik.
Opmerking: Een vast volume van elk monster wordt gebruikt voor RNA extractie; Daarom moet het volume van het afgepipetteerde deel exacte.
2. RNA extractie
- Ontdooi bevroren monsters op ijs (uit stap 1.5).
- Houd monster koud op ijs tijdens de RNA extractie. Chill lysis reagens en chloroform op ijs vóór gebruik.
- Voeg 5 volumes (1000 µL) van lysis reagens, met monofasische oplossing van fenol en guanidine isothiocyanaat, aan het monster (200 µL), en meng krachtig door vortexing voor 1 min.
- Voeg 5 µL van 5 nM synthetische Caenorhabditis elegans miRNA (Syn-cel-miR-238-3 p).
- Voeg 1 deel (200 µL) chloroform, en meng krachtig door de vortexing voor 1 min.
- Houd op ijs gedurende 2 tot 3 minuten, en vervolgens het centrifugeren van de monsters bij 12.000 x g bij 4 ° C gedurende 15 minuten.
- Overbrengen in de waterfase zorgvuldig een nieuwe microtube.
Opmerking: Niet overdragen van de organische fase (rood) of de interfase (wit). Het volume van de waterfase verzameld moet uniform zijn om te voorkomen dat de behandeling van inconsistentie, wat in meer technische variatie resulteert. De gebruikelijke hoeveelheid van de waterfase overgedragen in dit protocol was 650 µL. - Voeg 1,5 volumes (975 µL) van ethanol, en meng goed door pipetteren omhoog en omlaag.
- Breng het monster in een overeenkomstige kolom en adapter, gevolgd door vacuüm drogen gedurende 3 minuten met behulp van vacuüm variëteiten. Herhaal deze stap voor het verwerken van de resterende oplossing als het monstervolume meer dan 700 µL is.
Opmerking: Kolom gebaseerde RNA isolatie is compatibel met vacuüm en centrifugeren methode. - Voeg 200 µL van ethanol naar de kolom, gevolgd door vacuüm drogen voor 1 min.
- Voeg 800 µL van RWT Buffer naar de kolom, gevolgd door vacuüm drogen gedurende 2 minuten.
- Voeg 800 µL van RPE Buffer naar de kolom, gevolgd door vacuüm drogen gedurende 2 minuten.
- Herhaal stap 2.11.
- 300 µL van ethanol toevoegen aan de kolom, gevolgd door vacuüm drogen voor 1 min.
- Plaats van de kolom naar een nieuwe microtube en centrifugeer bij 12.000 x g bij kamertemperatuur (15-25 ° C) voor 1 min.
- De kolom overbrengen naar een nieuwe microtube, en voeg 50 µL nuclease-gratis water.
- Staan bij kamertemperatuur (15-25 ° C) voor de 3 min en centrifugeer bij 8.000 × g bij kamertemperatuur (15-25 ° C) gedurende 1 minuut.
- Opnieuw toepassen als het eluaat naar de kolom.
- Herhaal stap 2.16 en eluaat bij-80 ° C bewaren tot gebruik.
3. cDNA synthese
- Ontdooi bevroren monsters (uit stap 2.18).
-
Bereiden bekende concentratie van synthetische oligonucleotides van RNA die met doel miRNAs corresponderen.
- Synthetische RNA oligonucleotide gebruiken voor het genereren van een standaard curve in qPCR. Stockoplossing van 1 x 108 kopie/µL concentratie is geprepareerd voor opslag.
- Verdun de stockoplossing 10-fold voor 1 x 107 kopie/µL (niet vooraf versterkte monsters) of 1 x 105 kopie/µL (vooraf versterkte monsters) werkende oplossing als de hoogste concentratie voor de bouw van de standaard curve. In het algemeen, is een voorgestelde bereik voor de standaard curve concentraties 1 x 10,7 tot en met 1 x 102 kopie/µL (niet vooraf versterkte monsters) of 1 x 10,5 tot en met 1 x 100 kopie/µL (vooraf versterkte monsters).
- Bereid multiplex RT primer zwembad door het mengen van gelijke hoeveelheid 20 x RT inleidingen voor doel miRNAs.
Nota: Zoals afgebeeld in Figuur 2, een zwembad met maximaal 4 doel miRNAs kan worden gemaakt door het mengen van de 20 x RT inleidingen van elk van de miRNAs in het zwembad. Cel-miR-238 (externe controle) moet worden opgenomen als een van de target miRNAs in elke buis. In geval van minder dan 4 doel miRNAs, toevoegen gelijke hoeveelheden van 1/10 TE buffer in plaats van 20 x RT primer. - RT reactie mix bereiden: 3 µL RT primer bundelen (uit stap 3.3), 0,15 µL van 100 mM dNTPs met dTTP, 1 µL van reverse-transcriptase (50 U/µL), 1.5 µL 10 x RT buffer, 0,19 µL van RNase remmer (20 U/µL) en 4.16 µL van nuclease-vrij water.
- Mix 10 µL van RT reactie meng met 5 µL van RNA monster (uit stap 3.1) of oligonucleotides (uit stap 3.2) door pipetteren, en broeden op het ijs gedurende 5 minuten.
- Uitvoeren van omgekeerde transcriptie op een thermische cycler apparaat: 16 ° C gedurende 30 min, 42 ° C gedurende 30 minuten, gevolgd door een laatste reverse-transcriptase inactivatie stap bij 85 ° C gedurende 5 min. winkel omgekeerde getranscribeerde monsters bij-80 ° C tot gebruik.
4. preamplification (optioneel)
Opmerking: De miRNAs die Cq waarden boven 35 of meer in de daaropvolgende qPCR tonen worden vooraf versterkte.
- Ontdooi bevroren monsters (uit stap 3.6).
- Maken 10-fold seriële verdunningen van RT product uit synthetische oligonucleotides voor RNA; 1 x 10,5 tot en met 1 x 100 kopie/µL voor het genereren van standaard curve.
- Voorbereiden op multiplex assay primer zwembad door het mengen van gelijke hoeveelheden (5 µL) van 20 x assay inleidingen doel miRNAs met de eindconcentratie van elke assay primer 200-fold wordt verdund door TE buffer in een eindvolume van 1.000 µL.
Opmerking: De assay inleidingen wiens doel miRNAs in latere qPCR zonder voorafgaande versterking, en die voor de cel-miR-238 (externe controle) worden opgespoord kan worden zijn niet opgenomen in de primer zwembad. - Bereiden van pre amplificatie reactie mix: 12,5 µL van 2 x 6,25 µL van nuclease-gratis water, kant-en-klare preamplification reagens en 3,75 µL van assay primer pool (uit stap 4.3).
- Mix-22,5 µL van pre amplificatie reactie meng met 2.5 µL van omgekeerde getranscribeerde monster (uit stap 4.1) of oligonucleotides (uit stap 4.2) door pipetteren, en broeden op het ijs gedurende 5 minuten.
- Reactie op een thermische cycler apparaat uitvoeren: 95 ° C gedurende 10 minuten; gevolgd door 12 cycli van 95 ° C voor 15 s en 60 ° C gedurende 4 minuten vooraf versterkte monsters bij-80 ° C tot gebruik bewaren.
5. kwantitatieve PCR in real time (qPCR)
- Ontdooi bevroren monsters (vanaf stap 3.6 of stap 4.6).
- De monsters 5-voudig verdunnen met steriel water.
- Maak 10-fold seriële verdunningen van de RT-product dat is afgeleid van synthetische oligonucleotides voor RNA; 1 x 10,7 tot en met 1 x 102 kopie/µL (niet vooraf versterkte monsters) of 1 x 10,5 tot en met 1 x 100 kopie/µL (vooraf versterkte monsters) voor het genereren van standaard curven.
- QPCR reactie mix voorbereiden: 10 µL van 2 x kant-en-klare amplificatie reagens, 1 µL van 20 x assay reagens, met vooruit-/ achteruitspoelen PCR primers en sonde overeenkomt met het doel de miRNA, en 7 µL van nuclease-gratis water.
- 18 µL van de qPCR reactie mix overbrengen naar de reactie van snelle optische 96-wells-platen, en voeg 2 µL van de verdunde monsters (vanaf stap 5.2 of stap 5.3) in de putjes.
Opmerking: Monsters en -normen voor qPCR zijn ingesteld in de duplicaten. - Afdichting van de plaat met zelfklevende film en kort centrifugeren.
- Reactie op een real-time thermische cycler uitgevoerd: 95 ° C gedurende 20 s, gevolgd door 45 cycles van 95 ° C voor 1 s en 60 ° C gedurende 20 s.
6. de gegevensanalyse
- Berekenen van de ruwe exemplaaraantal van elk monster met behulp van data-analysesoftware die met bijbehorende real-time thermische cycler werkt.
Opmerking: Drempel lijn ligt handmatig "1.0" in alle platen in de studie, om te bevestigen de reproduceerbaarheid ten opzichte van hun vales Cq. Niveau van de licht-donkerscheiding is ingesteld op Cq > 40 cycli. - Het gemiddelde berekenen van de ruwe exemplaaraantal van elk monster van duplicaten.
- De correctiefactor berekenen door een aantal van de kopie van cel-miR-238 in elk monster te delen door het gemiddelde van exemplaaraantal van cel-miR-238 van alle monsters in een overeenkomstige buis.
Opmerking: Zoals afgebeeld in Figuur 2, elke buis bevat tot 4 doel miRNAs met inbegrip van cel-miR-238 (externe controle). Daarom wordt correctiefactor berekend voor elke buis met behulp van de overeenkomstige waarde van de cel-miR-238. - Bereken de gecorrigeerde exemplaaraantal door het verdelen van de gemiddelde ruwe exemplaaraantal van elk monster (uit stap 6.2) door de correctiefactor (uit stap 6.3) voor elk monster.
- De absolute exemplaaraantal berekenen door het aantal aangepaste onbewerkte kopie van elk monster (uit stap 6.4) vermenigvuldigen door de de verdunningsfactor voor elk monster.
Opmerking: De verdunningsfactor is "5" in dit protocol, die wordt afgeleid uit stap 5.2. - Berekenen van de efficiëntie van PCR versterking van de helling van het perceel van de Cq-waarden voor elke seriële verdunning tegen log cDNA concentratie.
Opmerking: Formule voor het berekenen van de efficiëntie; E = (10(-1/helling) -1) x 100%. - Berekenen van de technische variatie met behulp van de Cq-waarden van cel-miR-238 van alle monsters met behulp van de formule E = (2 x amplificatie werkzaamheid)ΔCt(Max(Cq)-Min(Cq)).
Opmerking: Stappen 6.5 en 6.7 worden gebruikt voor de kwaliteitsbeoordeling van de procedure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Workflow van miRNA assay door RT-qPCR en kwaliteit assessment
Figuur 1 toont de workflow van miRNA assay van bloedmonsters die met behulp van qPCR10. De kwaliteit van de experimenten kan worden geverifieerd door het opnemen van cel-miR-238 als een externe controle. Dit zal onthullen technische variaties in RNA extractie en de daaropvolgende RT-qPCR verwerkt. In deze studie was de gemiddelde ± SD van de Cq-waarden berekend op basis van 50 monsters 21.0 ± 0,4 (tabel 1). Als de cel-miR-238 was vanwege de versterking van de pre-stap verdund, was de waarde Cq 24.2 ± 0,4 (tabel 1). In de hier beschreven test methode, werd de omvang van de technische variatie geschat op minder dan 3-voudig gebaseerd op het verschil in de waarden van de Cq. De mate van variatie bleef consistent, zelfs wanneer extra pre amplificatie stap moest worden opgenomen. Deze waarden zijn compatibel met die voor andere monsters van verschillende diersoorten, zoals muizen, ratten en mensen uitgevoerd in dit laboratorium (gegevens niet worden weergegeven).
Detecteerbare variëren van standaard curve voor doel miRNA
Geen pre versterking van de monsters
Het omgekeerde getranscribeerde (RT) product uit synthetische oligonucleotides van RNA in concentraties van 1 x 107 kopie/µL was serieel verdund voorafgaand aan de latere qPCR. Deze serie werden gebruikt voor het genereren van standaard curve die consistent dekking van alle biologische monsters die aantoonbaar zonder voorafgaande versterking stap werden gewaarborgd. De Cq-waarden van het standaardmonster in 1 x 102 kopie/µL concentratie waren over het algemeen dicht bij de afgesneden niveaus voor elk doel miRNA. Daarom werd de detectiegrens geschat op 1 x 102 kopie/µL (Figuur 3).
Vooraf versterkte monsters
Om te bepalen van de detecteerbare aantal monsters waarvoor pre amplificatie, werden twee verschillende series van verdunde monsters vergeleken, zoals geïllustreerd in Figuur 4. Voor het genereren van standaard curve A, werden seriële verdunningen van het RT product voorafgaand aan pre amplificatie stap voorbereid. De reeks van vooraf versterkte normen werden vervolgens gebruikt voor latere qPCR. Voor het genereren van standaard curve B, werd de eerste verdunning gemaakt van vooraf versterkte monsters tot een concentratie van 1 x 105 kopie/µL. Deze standaard curven bleek blijkbaar verschillende detectiegrenzen (Figuur 5). Hoewel de standaard curve B toonde lineaire reeks verhoging tot 1 kopie/µL, standaard curve A niet kan worden gebruikt voor specifieke waarbij bij concentraties van minder dan 102 of 103 kopie/µL (Figuur 5). Dit resultaat stelde dat zeer kleine hoeveelheden miRNAs zelfs met pre amplificatie stap kunnen niet worden beoordeeld. Bovendien, de vooraf versterkte monsters moeten worden geïnterpreteerd zorgvuldig wanneer de Cq-waarden zijn > 30, omdat de detectiegrenzen van de vooraf versterkte monsters waren dicht bij deze waarde. Daarom, als regel, werd standaard curve B gebruikt in de methode beschreven hier, na het bepalen van de detecteerbare bereik, alleen om te voorkomen dat met behulp van onvoldoende aantal standaard Staanplaatsen.
Bijgevolg was de ondergrens van kwantificering (Ondergrens) 102 kopie/µL voor de meeste van de miRNAs (Figuur 3 en Figuur 5). Alleen miR-1 een hogere Ondergrens toonde (103 kopie/µL) (Figuur 5). De efficiëntie van de versterking van de gemiddelde was ongeveer 90%, met de correlatiecoëfficiënt (R2) van de standaard curven, variërend van 0.998 tot 1.000. De kenmerken van een nauwkeurige bepaling van de RT-qPCR worden beschouwd als een lineaire R2 gelijk is aan of groter dan 0,98 en een PCR versterking efficiëntie van 90 tot 110%17. Dus, de kwaliteit van de standaard curven in de analyse werd gecontroleerd.
Effecten voor pre-amplificatie voor kleine hoeveelheden miRNAs
De miRNAs die Cq waarden boven 35 of hoger in de daaropvolgende qPCR toonde waren vooraf versterkte. Deze procedure verbeterd de opsporing van kleine hoeveelheden miRNAs. Bijvoorbeeld, was de Cq-waarden (gemiddelde ± SD) van niet-pre-versterkte miR-206 37.9 ± 1.9, terwijl die van vooraf versterkte miR-206 daalde tot 27.0 ± 2,2. Significante verschillen tussen dubbele meting paren werden waargenomen in niet-pre-versterkte monsters op hoge Cq waarden (Figuur 6). Daarentegen toonde vooraf versterkte monsters bijna gelijke waarden in duplicaten (Figuur 6). Deze resultaten aangegeven dat pre versterking zou doeltreffend zijn voor het verstrekken van meer nauwkeurige en betrouwbare gegevens in geval van kleine hoeveelheden van monsters.
Profilering van plasma miRNAs in cynomolgus apen
Met behulp van de gevestigde assay-platform, plasma niveaus van 8 miRNAs (miR-1, miR-122, miR-133a, miR-192, miR-206, miR-208bis, miR-208b en miR-499a) van 50 cynomolgus apen waren geanalyseerd (Figuur 7)10. In deze test waren miR-122, miR-133a en miR-192 detecteerbare zonder voorafgaande versterking, terwijl miR-1, miR-206 en miR-499a pre amplificatie vanwege hun lage expressie niveaus vereiste. MiR-208bis noch miR-208b was echter aantoonbaar zelfs met pre versterking. De gegevens werden niet normaal verdeeld; Daarom is een logaritmische transformatie werd uitgevoerd voor het berekenen van hun gemiddelde en de standaardafwijking. Onder de miRNAs onderzocht, miR-122 toonde de hoogste gemiddelde plasma (5,71 x 104 kopie/µL), met een kleine dynamisch bereik (20-fold). Daarentegen grote dynamische bereiken werden waargenomen voor miR-1 (581-fold), miR-133a (971-fold), en miR-206 (426-fold).
Figuur 1 : Schematische workflow van miRNA assay door RT-qPCR. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Schematische workflow van omgekeerde transcriptie van miRNA assay. Een zwembad met maximaal 4 doel miRNAs kan worden gemaakt door het mengen van de 20 x RT inleidingen van elk van de miRNAs in het zwembad. Cel-miR-238 (externe controle) moet worden opgenomen als een van de target miRNAs in elke buis. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| miR-238 gegevensanalyse | ||
| Zonder Pre versterking |
Met Pre versterking |
|
| N | 50 | 50 |
| Gemiddelde | 21.0 | 24.2 |
| SD | 0.4 | 0.4 |
| Max Cq | 21,8 | 25.3 |
| Min Cq | 20.3 | 23,5 |
| Mediaan | 21.0 | 24.2 |
| Max-Min | 1.3 | 1.8 |
| Versterking werkzaamheid | 89 | 89 |
| Variatie | 2.4 | 2.8 |
Tabel 1: beoordeling van de kwaliteit met behulp van kwantificering cyclus (Cq) waarden voor cel-miR-238. Technische varianten werden geëvalueerd van de Cq-waarden van miR-238 in elke test. Vijftig monsters werden verdeeld over twee groepen correspondeert met (rechts) of zonder (links) de pre amplificatie stap. Variatie was berekend met de formule E = (2 x amplificatie werkzaamheid)ΔCt(Max(Cq)-Min(Cq)). De werkzaamheid van de amplificatie werd berekend op basis van de helling van de standaard curve. De monsters die pre amplificatie stap waren verdund tijdens de pre amplificatie stap (miR-238 zelf was niet vooraf versterkte). Dit cijfer is gewijzigd van ons verslag10.
Figuur 3 : Plot van standaard curven voor niet-pre-versterkte monsters. Standaard curven (N = 3, dubbele) werden gegenereerd door het uitzetten van de concentratie van het logboek versus Cq. lineaire regressie-analyse is berekend om te bepalen van de helling, die correspondeert met de efficiëntie van de versterking. Standaard curven voor miR-122 (bovenste), miR-192 (midden) en miR-133a (Neder) toonde lineaire relatie tussen Cq en concentratie op de geteste bereik. In de standaard curven vertegenwoordigen foutbalken één standaarddeviatie uit drie onafhankelijke testen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Procedure voor het genereren van standaard curven voor vooraf versterkte monsters. (Standaard curve A) Een representatieve concentratie van synthetische oligo (1 x 105 kopie/µL) was omgekeerde transcriptie, gevolgd door het opstellen van 10-fold seriële verdunningsreeks van het standaardmonster. Deze vooraf versterkte normen werden gebruikt voor volgende qPCR. (Standaard kromme B) Een representatieve concentratie van synthetische oligo (1 x 105 kopie/µL) was omgekeerde transcribeerde en vooraf versterkt. Vervolgens een 10-fold seriële verdunningsreeks van standaard monsters werden voorbereid voorafgaand aan de latere qPCR. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 : Perceel van standaard curven A en B voor vooraf versterkte monsters. Standaard curve A (n = 1, dubbele) en standaard curve B (n = 3, dubbele) werden gegenereerd door het uitzetten van de concentratie van het logboek versus Cq. lineaire regressie-analyse is berekend om te bepalen van de helling, die correspondeert met de efficiëntie van de versterking. (Bovenste) Standaard curve een (stippellijn) toonde blijkbaar niet-specifieke amplicon op 1 x 102 kopie/µL, overwegende dat de standaard curve B (ononderbroken lijn) toonde lineaire relatie tussen Cq en concentratie op de geteste bereik van miR-1. (Middelste en lager) Standaard curve een (stippellijn) toonde geen amplicon in concentraties van 1 x 102 kopie/µL of lager, overwegende dat de standaard curve B (ononderbroken lijn) toonde lineaire relatie tussen Cq en concentratie op de geteste bereik van miR-499a en miR-206. In de standaard curve B vertegenwoordigen foutbalken één standaarddeviatie uit drie onafhankelijke testen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6 : De plot van de versterking voor niet-pre-versterkte en vooraf versterkte monsters. (Bovenste) amplificatie plot van miR-206 in representatieve monsters (A, B, C) zonder (boven), of met pre versterking (Neder). Metingen werden opgericht in tweevoud. Er waren verschillen tussen de twee monsters opgezet als duplicaten in niet-pre-versterkte monsters, vooral in de hogere Cq monsters (A en B). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 7 : Absolute waarde van plasma microRNAs (miRNAs) in cynomolgus apen. De niveaus van de expressie van het miRNAs worden vertegenwoordigd door dot percelen. Het gemiddelde, en de waarde voor twee standaarddeviaties onder en boven het gemiddelde (getoond in het grijze vak), werden vastgesteld na een logaritmische transformatie. Dit cijfer is gewijzigd van ons verslag10. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Onze uitgebreide beoordeling verstrekt een strengere statistische analyse van de omvang van het dynamisch bereik, die duidelijk aangegeven dat de omvang van variatie tussen de afzonderlijke monsters uiterst verschillende onder de miRNAs getest was. Hoewel deze variaties mogelijk toe te schrijven aan hun kleine hoeveelheden in lichaamsvloeistoffen, opgemerkt moet worden dat deze gegevens niet alleen biologische variaties, maar ook technische variaties weerspiegelen. Allermeest naar de technische variatie kan worden beoordeeld door middel van Cq waarden van de externe controle (cel-miR-238), die wordt gebruikt in andere assay platformen18. Sinds er geen gestandaardiseerde interne controles in miRNA analyse, moet de informatie over technische variatie worden opgenomen in de analyse, voor het bepalen van de kwaliteit van de test19. Technische variatie werd geschat op minder dan 3-voudig in de methode die in dit verslag beschreven. Hoewel het is niet mogelijk om te bepalen van het kwaliteitsniveau voor deze procedure vanwege het ontbreken van vergelijkbare technische informatie in ander onderzoek, met inbegrip van dergelijke informatie draagt bij tot de verbetering van de betrouwbaarheid en zorgt voor compatibiliteit tussen verschillende studies.
Een aantal recente artikels hebben gemeld dat verschillende vooraf analytische variabelen zoals monster behandeling, opslagcondities, en duur van de opslag vóór de verwerking kunnen invloed hebben op de betrouwbaarheid en de reproduceerbaarheid van de circulerende miRNA metingen20 , 21. Hoewel deze studie heeft geen rekening gehouden met de effecten van vooraf analytische variabelen, de volgende stappen zorgvuldig werden gevolgd tijdens de bereiding van de monsters te minimaliseren variaties. Eerst werd plasma verwerkt zo snel mogelijk (binnen 2 uur na collectie) om te minimaliseren van het effect van de stabiliteit van de miRNAs in plasma8,22. Hoewel miRNAs worden beschouwd als stabiel bij kamertemperatuur (15-25 ° C), is het nog onduidelijk of het interval tussen bloed verzameling en verwerking van plasma of serum beïnvloedt miRNA niveaus. Elk plasma monster werd tweede, visueel geïnspecteerd om te elimineren analytische bias die voortvloeien uit besmetting met hemolyzed rode bloedcellen, die één van de storende factoren die van invloed kunnen zijn op de niveaus vertegenwoordigt van circulerende miRNAs23.
Pre versterking is handig om de detectie van zeer kleine hoeveelheden van miRNAs in biofluids zonder een detectie bias24. In de huidige studie toonde de Cq-waarden van de standaard curven gebouwd met behulp van vooraf versterkte synthetische oligonucleotides hoge reproduceerbaarheid over de testen. Hierdoor is absolute kwantificatie met behulp van vooraf versterkte monsters, waardoor de detectie van kleine hoeveelheden miRNAs. Aan de andere kant, vertonen laag kopie nummer normen (1 x 102 of 103 kopie/µL) geen specifieke waarbij, in combinatie met pre versterking. Mestdagh et al. 24 gemeld dat meting van laag kopie nummer miRNAs hogere variatie na pre amplificatie procedure toonde, vergeleken met matige of hoge exemplaar nummer miRNAs, als gevolg van het lage rendement van omgekeerde transcriptie, die zou kunnen het resultaat van miRNA zijn kenmerken van de reeks. Daarom moet het registratiebereik van standaard curven voor elke miRNA vóór kwantificering van biologische monsters, met name voor pre versterkte miRNAs, aan het elimineren van vals-positieve resultaten worden gevalideerd. Nog belangrijker is, moet worden opgemerkt dat de absolute niveaus van anders verwerkte miRNAs zoals vooraf versterkte en niet-pre-versterkte monsters direct niet worden vergeleken omdat de hoeveelheid vooraf versterkte monster niet in elke miRNA opgegeven is.
Dit verslag beschrijft een methode voor de extractie voor absolute miRNA levels in plasma monsters met behulp van RT-qPCR. Sommige miRNAs werden niet gedetecteerd zelfs na pre versterking. U wilt opsporen dergelijke lage expressie miRNAs, kan een andere aanpak moet worden gebruikt. Hoewel het gebruik van een grotere hoeveelheid monster kan het omzeilen van dit probleem als een eenvoudige oplossing, zijn grote hoeveelheden van het monster niet altijd beschikbaar. Tot op heden, heeft technologische vooruitgang de ontwikkeling van verschillende platformen voor miRNA profilering van25,,26. Druppel digitale PCR (ddPCR) onlangs heeft ontwikkeld en biedt een alternatieve methode aan conventionele RT-qPCR voor absolute kwantificering. Deze innovatieve technologie is gemeld als een gevoelige, nauwkeurige en reproduceerbare methode die een doel miRNA op niveaus van 1 exemplaar/µL27,28 detecteren kan. Als ddPCR een lage concentratie van miRNAs zonder een versterking van de pre-stap detecteren kan, zou het een groot voordeel omdat het niveau van meerdere miRNAs kunnen worden vergeleken met elkaar. Wijzigingen in de procedures van de extractie en latere RT-qPCR, moleculaire platform en gebruikte reagentia zal onvermijdelijk variabele resultaten opleveren. Deze variaties kunnen echter opgelost als transparant resultaten van externe controles en absolute niveaus voor individuele miRNAs worden geleverd. Passende beoordeling van de methode is de sleutel tot verbetering van het onderscheidingsvermogen van biologische veranderingen in miRNA profilering van studies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteur heeft geen conflict van belang om te vermelden.
Acknowledgments
Dit onderzoek heeft specifieke subsidies niet ontvangen financieringsinstanties in de openbare, commerciële of not-for-profit sector.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Microtainer tube (K2EDTA) | Becton, Dickinson and Company | 365974 | For blood collection |
| Eppendorf PCR Tubes, 0.2 mL | Eppendorf | 0030124359 | |
| Eppendorf Safe-Lock micro test tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| Eppendorf Safe-Lock micro test tubes 2.0 mL | Eppendorf | 0030120094 | |
| Synthetic oligonucleotide | Hokkaido System Science | - | Individual miRNA (0.2 μmol,HPLC grade) |
| Tris-EDTA Buffer (pH 8.0) | Nippon Gene | 314-90021 | TE buffer |
| Buffer RPE | QIAGEN | - | Contents in miRNeasy mini kit |
| Buffer RWT | QIAGEN | - | Contents in miRNeasy mini kit |
| miRNeasy Mini Kit | QIAGEN | 217004 | |
| Nuclease-Free Water | QIAGEN | 129114 | |
| QIAzol Lysis Reagent | QIAGEN | - | Contents in miRNeasy mini kit |
| Syn-cel-miR-238-3p miScript miRNA Mimic | QIAGEN | 219600 | ID:MSY0000293, 5 nmol |
| SC Adapters | TAIGEN Bioscience Corporation | S0120 | For RNA extraction |
| VacEZor 36 Complete System | TAIGEN Bioscience Corporation | M3610 | For RNA extraction |
| 7900HT Fast Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4351405 | Fast 96-Well Block |
| GeneAmp PCR System 9700 | Thermo Fisher Scientific Inc. | 9700 | |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4346907 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4311971 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4444557 | |
| TaqMan MicroRNA Assays (cel-miR-238-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000248 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-122-5p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002245 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-133a-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002246 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-1-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002222 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-192-5p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000491 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-206) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000510 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208a-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000511 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208b-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002290 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-499a-5p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 001352 |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit |
Thermo Fisher Scientific Inc. | 4366597 | |
| TaqMan PreAmp Master Mix (2×) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4391128 | |
| Chloroform | Wako Pure Chemicals | 035-02616 | |
| Ethanol (99.5) | Wako Pure Chemicals | 057-00456 |
References
- Schöler, N., Langer, C., Döhner, H., Buske, C., Kuchenbauer, F. Serum microRNAs as a novel class of biomarkers: a comprehensive review of the literature. Exp. Hematol. 38, 1126-1130 (2010).
- Viereck, J., Thum, T. Circulating Noncoding RNAs as Biomarkers of Cardiovascular Disease and Injury. Circ. Res. 120 (2), 381-399 (2017).
- D'Alessandra, Y., et al. Circulating microRNAs are new and sensitive biomarkers of myocardial infarction. Eur Heart J. 31 (22), 2765-2773 (2010).
- Chen, Y., Gelfond, J. A., McManus, L. M., Shireman, P. K. Reproducibility of quantitative RT-PCR array in miRNA expression profiling and comparison with microarray analysis. BMC Genomics. 10, 407 (2009).
- Nassirpour, R., et al. Identification of tubular injury microRNA biomarkers in urine: comparison of next-generation sequencing and qPCR-based profiling platforms. BMC Genomics. 15, 485 (2014).
- Derveaux, S., Vandesompele, J., Hellemans, J. How to do successful gene expression analysis using real-time PCR. Methods. 50 (4), 227-230 (2010).
- Bustin, S. A. Why the need for qPCR publication guidelines?--The case for MIQE. Methods. 50 (4), 217-226 (2010).
- Kroh, E. M., Parkin, R. K., Mitchell, P. S., Tewari, M. Analysis of circulating microRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR). Methods. 50 (4), 298-301 (2010).
- Thompson, K. L., et al. Absolute Measurement of Cardiac Injury-Induced microRNAs in Biofluids across Multiple Test Sites. Toxicol Sci. 154 (1), 115-125 (2016).
- Iguchi, T., Niino, N., Tamai, S., Sakurai, K., Mori, K. Comprehensive Analysis of Circulating microRNA Specific to the Liver, Heart, and Skeletal Muscle of Cynomolgus Monkeys. Int. J. Toxicol. 36 (3), 220-228 (2017).
- Matsuzaka, Y., et al. Three novel serum biomarkers, miR-1, miR-133a, and miR-206 for Limb-girdle muscular dystrophy, Facioscapulohumeral muscular dystrophy, and Becker muscular dystrophy. Environ. Health. Prev. Med. 19 (6), 452-458 (2014).
- Starkey Lewis, P. J., et al. Circulating microRNAs as potential markers of human drug-induced liver injury. Hepatology. 54 (5), 1767-1776 (2011).
- Wang, K., et al. Circulating microRNAs, potential biomarkers for drug-induced liver injury. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (11), 4402-4407 (2009).
- Moldovan, L., Batte, K., Wang, Y., Wisler, J., Piper, M. Analyzing the Circulating MicroRNAs in Exosomes/Extracellular Vesicles from Serum or Plasma by qRT-PCR. Methods Mol. Biol. 1024, 129-145 (2013).
- Li, S., Chen, H., Song, J., Lee, C., Geng, Q. Avoiding heparin inhibition in circulating MicroRNAs amplification. Int. J. Cardiol. 207, 92-93 (2016).
- Cheng, H. H., et al. Plasma processing conditions substantially influence circulating microRNA biomarker levels. PLoS One. 8 (6), e64795 (2013).
- Serafin, A., et al. Identification of a set of endogenous reference genes for miRNA expression studies in Parkinson's disease blood samples. BMC Res. Notes. 7, 715 (2014).
- Akiyama, H., et al. A set of external reference controls/probes that enable quality assurance between different microarray platforms. Anal. Biochem. 472, 75-83 (2015).
- Kirschner, M. B., van Zandwijk, N., Reid, G. Cell-free microRNAs: potential biomarkers in need of standardized reporting. Front Genet. 4, 56 (2013).
- Malentacchi, F., et al. SPIDIA-RNA: second external quality assessment for the pre-analytical phase of blood samples used for RNA based analyses. PLoS One. 9 (11), e112293 (2014).
- Sourvinou, I. S., Markou, A., Lianidou, E. S. Quantification of circulating miRNAs in plasma: effect of preanalytical and analytical parameters on their isolation and stability. J Mol Diagn. 15 (6), 827-834 (2013).
- Yamaura, Y., Nakajima, M., Takagi, S., Fukami, T., Tsuneyama, K., Yokoi, T. Plasma microRNA profiles in rat models of hepatocellular injury, cholestasis, and steatosis. PLoS One. 7 (2), e30250 (2012).
- Kirschner, M. B., Edelman, J. J., Kao, S. C., Vallely, M. P., van Zandwijk, N., Reid, G. The Impact of Hemolysis on Cell-Free microRNA Biomarkers. Front Genet. 4, 94 (2013).
- Mestdagh, P., et al. High-throughput stem-loop RT-qPCR miRNA expression profiling using minute amounts of input RNA. Nucleic Acids Res. 36 (21), e143 (2008).
- Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. MicroRNA profiling: approaches and considerations. Nat. Rev. Genet. 13 (5), 358-369 (2012).
- Moldovan, L., Batte, K. E., Trgovcich, J., Wisler, J., Marsh, C. B., Piper, M. Methodological challenges in utilizing miRNAs as circulating biomarkers. J. Cell. Mol. Med. 18 (3), 371-390 (2014).
- Mangolini, A., et al. Diagnostic and prognostic microRNAs in the serum of breast cancer patients measured by droplet digital PCR. Biomark. Res. 3, 12 (2015).
- Miotto, E., Saccenti, E., Lupini, L., Callegari, E., Negrini, M., Ferracin, M. Quantification of circulating miRNAs by droplet digital PCR: comparison of EvaGreen- and TaqMan-based chemistries. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 23 (12), 2638-2642 (2014).
