Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

إنزيم TET2 انقسام هندسيا للحمض النووي الكيميائية إيندوسيبلي هيدروكسيميثيليشن ويعيد البناء جينية

Published: December 18, 2017 doi: 10.3791/56858
Automatic Translation
1, 2, 1
1Centre for Epigenetics and Disease Prevention, Department of Molecular and Cellular Medicine, Institute of Biosciences and Technology, College of Medicine, Texas A&M University, 2Centre for Translational Cancer Research, Department of Medical Physiology, Institute of Biosciences and Technology, College of Medicine, Texas A&M University

Summary

وترد بروتوكولات مفصلة لإدخال إنزيم هندسيا سبليت-TET2 (عصير التفاح) في خلايا الثدييات هيدروكسيميثيليشن الحمض النووي إيندوسيبلي الكيميائية وإعادة عرض جينية.

Abstract

مثلايشن الحمض النووي هو تعديل جينية الموروثة ومستقر في الجينوم الثدييات وهو يشارك في تنظيم التعبير الجيني للتحكم في الوظائف الخلوية. عكس مثلايشن الحمض النووي، أو ديميثيليشن الحمض النووي، هو توسط إزفاء (TET) أحد عشر-عشرة عائلة البروتين ديوكسيجيناسيس. على الرغم من أن قيل على نطاق واسع أن الشاذة مثلايشن الحمض النووي و demethylation المرتبطة بعيوب التنموية والسرطان، كيف هذه التغيرات جينية تسهم مباشرة في التعديلات اللاحقة في تطور التعبير أو المرض الجيني لا تزال غير واضحة، إلى حد كبير نظراً لعدم وجود أدوات موثوق بها لدقة إضافة أو إزالة التعديلات الدنا في الجينوم بدقة زمنية ومكانية محددة. للتغلب على هذه العقبة، صممنا إنزيم سبليت-TET2 لتمكين التحكم الزمني للأكسدة 5-ميثيلسيتوسيني (5mC) ويعيد البناء اللاحقة للدول جينية في خلايا الثدييات ببساطة إضافة المواد الكيميائية. هنا، يمكننا وصف طرق لإدخال أداة يعيد epigenome كيميائية إيندوسيبلي (عصير التفاح)، استناداً إلى إنزيم هندسيا سبليت--TET2، في خلايا الثدييات، والتحديد الكمي لإنتاج المواد الكيميائية إيندوسيبلي 5-هيدروكسيميثيلسيتوسيني (5hmC) مع إيمونوستاينينج، والتدفق الخلوي أو مقايسة دوت-وصمة عار. سوف تجد هذه الأداة epigenome الكيميائية إيندوسيبلي يعيد استخدام واسع النطاق في استجواب النظم الخلوية دون تغيير الشفرة الجينية، وكذلك في استكشاف العلاقات epigenotype−phenotype في مختلف النظم البيولوجية.

Introduction

مثلايشن الحمض النووي، معظمها يشير إلى إضافة مجموعة الميثيل بموقف السيتوزين الكربون 5 لتشكيل 5-ميثيلسيتوسيني (5mC)، وهو تحفزها الحمض النووي الميثيل-ترانسفيراسيس (دنمتس). 5mC بمثابة علامة جينية رئيسية في الجينوم الثدييات التي غالباً ما إشارات للقمع النسخي والمنظمة X-chromosome ينقول إسكات1. عكس مثلايشن الحمض النووي هو توسط الأسرة البروتين إزفاء (TET) 10-الجان. الإنزيمات التيت تنتمي للحديد (II) و 2-أوكسوجلوتاراتي ديوكسيجيناسيس تعتمد الذي حفز الأكسدة المتعاقبة من 5mC إلى 5-هيدروكسيميثيلسيتوسيني (5hmC)، 5-فورميلسيتوسيني (إف سي 5) و 5-كاربوكسيسيتوسيني (5caC). ويفرض أكسدة 5mC تيت بوساطة طبقة إضافية من سيطرة جينية على الجينوم الثدييات. وقد آثار اكتشاف تيت اهتماما مكثفا في مجال جينية لكشف النقاب عن الوظائف البيولوجية للبروتينات تيت وبهم 5hmC المنتج الحافز الرئيسي. 5hmC ليس فقط كمادة وسيطة خلال تيت بوساطة نشطة الحمض النووي ديميثيليشن2،4من3،، ولكن أيضا علامة الأفعال كدولة مستقرة جينية5،،من67،8 . على الرغم من أن هيدروكسيميثيليشن الحمض النووي الغاية مرتبطة بالتعبير الجيني والشاذ تغييرات في الحمض النووي هيدروكسيميثيليشن المرتبطة ببعض الاضطرابات البشرية9،،من1011، العلاقات السببية بين تعديلات جينية في الحمض النووي، وتعمل غالباً ما تظل تحديا إنشاء، والتي يمكن أن تعزى جزئيا إلى عدم وجود أداة موثوقة لدقة إضافة أو إزالة التعديلات الدنا في الجينوم في تعريف الزماني والمكاني القرار.

هنا نحن تقرير استخدام epigenome الكيميائية إيندوسيبلي إعادة عرض أداة (عصير التفاح) للتغلب على العقبة التي تواجه دراسات عن العلاقات السببية بين النسخ هيدروكسيميثيليشن والجينات الحمض النووي. التصميم يستند إلى الافتراض بأن المجال الحفاز من TET2 (TET2CD) يمكن تقسيمها إلى اثنين الشظايا غير نشط عند المعرب عنها في خلايا الثدييات، ويمكن استعادة وظيفتها الانزيمية باتخاذ نهج ثنائي إيندوسيبلي كيميائيا ( الشكل 1A). لإنشاء نظام لتقسيم TET2CD، اخترنا ستة مواقع في TET2CD، تتألف من منطقة Cys غنية وإضعاف مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل β-اللولب (دسبه)، على أساس هيكل كريستال المبلغ عنها من مجمع TET2-الحمض النووي الذي يفتقر إلى منطقة تعقيد منخفض12. جينات اصطناعية ترميز ثنائي ربمسن إيندوسيبلي الوحدة النمطية FK506 ملزمة البروتين 12 (FKBP12) وفكبب ربمسن ملزمة المجال (FRB) الهدف الثدييات ربمسن14،15، جنبا إلى جنب مع ببتيد كليفينج الذاتي T2A وأدرج ببتيد تسلسل16،17، منفردة في مواقع مختارة انقسام داخل TET2CD. ويستند اختيار TET2 هدفنا الهندسة الاعتبارات التالية. كثيرا ما يلاحظ الطفرات الجسدية، والأولى في TET2 مع ما يصاحب ذلك انخفاض في هيدروكسيميثيليشن الحمض النووي في الاضطرابات البشرية بما في ذلك الاضطرابات النقوي والسرطان10، الذي يوفر معلومات مفيدة عن المواقع الحساسة التي ينبغي تجنبها الإدراج. ثانيا، جزء كبير من المجال TET2 الحفاز، لا سيما منطقة قليلة التعقيد، لا يمكن الاستغناء عنها للدالة الانزيمية12، مما يمكن لنا أن نصوغ سبليت-TET2 مصغر لتعديلات جينية إيندوسيبلي. بعد فرز أكثر من 15 بنيات، اختارت بناء معارضها استعادة نشاطها الأنزيمي ربمسن إيندوسيبلي أعلى في النظام الثدييات وعينت عصير التفاح18. نحن تصف هذه الوثيقة استخدام المعلمة متشيري عصير التفاح لتحقيق إيندوسيبلي الحمض النووي هيدروكسيميثيليشن ويعيد البناء جينية مع ربمسن، ويقدم ثلاثة أساليب للتحقق من إنتاج عصير التفاح بوساطة 5hmC في نظام الهاتف خلوي لنموذج HEK293T.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-الخلية الثقافة، تعداء بلازميد والحث الكيميائي

  1. ثقافة خلية ملتصقة خط (مثلاً، البشرية الجنينية الكلي خلية HEK293T) في المتوسطة تعديل النسر دولبيكو (دميم)، تستكمل مع إبطال الحرارة 10% الجنين المصل البقري، 100 البنسلين يو/مليلتر وستربتوميسين عند 37 درجة مئوية مع 5% CO2.
  2. ترانسفيكت الخلايا مع بلازميد عصير التفاح.
    1. على الأقل 18 ح قبل تعداء، البذور 0.3 × 106 خلايا في 2.5 مل دميم المناسبة الواحدة في لوحة 6-جيدا واحتضان خلايا في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها يصل إلى 60-80% كونفلوينسي.
    2. قبل حارة الكاشف تعداء إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستعمال.
    3. مكان 250 ميليلتر من المتوسط خالية من المصل في أنبوب عقيم.
      ملاحظة: هذا المبلغ هو مصممة خصيصا للوحة 6-جيدا مع كونفلوينسي 80%. إذا لزم الأمر، التناسب ضبط كميات متوسطة وفقا للأحجام لوحات أو أرقام الخلية.
    4. إضافة 2.5 ميكروغرام من بلازميد ترميز عصير التفاح18 أو المجال الحفاز من TET2 (TET2CD كمراقبة إيجابية)12،13 في المتوسط خالية من المصل ولطف مزيج من بيبيتينج.
    5. إضافة 7.5 ميليلتر من تعداء الكاشف إلى خليط الحمض المخفف وتخلط بلطف بيبيتينج.
    6. احتضان هذا الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 20-30 دقيقة.
    7. تغيير الوسائط المعالجون مسبقاً وإضافة الخليط دروبويسي للآبار، وتهز بلطف لوحة الثقافة الخلية توزيعها بالتساوي كاشف تعداء وخليط الحمض النووي.
    8. احتضان خلايا وخليط بين عشية وضحاها، ثم قم باستبدال الكاشف تعداء التي تحتوي على وسائط الإعلام مع 2 مل دميم كاملة جديدة.
  3. التعريف الكيميائي
    1. 2 مم تمييع ربمسن المخزون (حله في [دمس]) بتركيز من 20 ميكرومتر في المتوسط كاملة المناسبة.
    2. إضافة 20 ميليلتر من ربمسن المخفف إلى transfected الخلايا تحتفظ في متوسطة 2 مل للوصول إلى تركيز نهائي من 200 نانومتر.
      ملاحظة: بعد حضانة ح 48، الخلايا على استعداد للتحديد الكمي لجيل 5hmC أو أي تطبيقات أخرى المتلقين للمعلومات. إذا لزم الأمر، يمكن رصدها بإخراج الخلايا كل ح 3 لزيادة 5hmC الكمي كما هو موضح أدناه كفاءة الحث وهو مبين في الشكل 1.
    3. أفضل تقدير الكفاءة التعريفي 5hmC، فصل البذور الآبار لرصد خلايا كل 3 ساعات.

2-التحديد الكمي للإنتاج الناجم عن ربمسن 5hmC من إيمونوستينينج

  1. تلوين الفلورة 5hmC
    ملاحظة: إضافة مبالغ كافية لتثبيت الحل، تتألف من 4% بارافورمالدهيد، السطح 0.2% (مثل Triton X-100) في برنامج تلفزيوني مع 3 N HCl، لتغطية كافة الخلايا الموجودة في اللوحة. على سبيل المثال، 500 ميليلتر للحل سيكون كافياً لبئر في لوحة 6-جيدا. تنفيذ كافة الخطوات في درجة حرارة الغرفة.
    1. لإصلاح الخلايا، إضافة بارافورمالدهيد 4% في برنامج تلفزيوني للخلايا المعالجة ربمسن لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. لمجموعة المراقبة، استخدام الخلايا معربا عن مشري-عصير التفاح بدون علاج ربمسن. لا تحرض.
      تنبيه: بارافورمالدهيد السامة. ملابس الحماية المناسبة.
    2. تجاهل حل مثبت. احتضان خلايا ثابتة مع السطح 0.2% في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة بيرميبيليزي غشاء الخلية.
    3. تجاهل بيرميبيليزيشن الحل. إضافة 3 N HCl للخلايا بيرميبيليزيد، واحتضان لمدة 15 دقيقة تؤذي الحمض النووي.
    4. تجاهل HCl. إضافة 100 ملم تريس-HCl العازلة (pH 8.0) إلى الخلايا لمدة 10 دقائق لتحييد الحموضة.
    5. تجاهل جميع الحل. تغسل الخلايا تماما مع برنامج تلفزيوني ل 3-5 مرات. قم بإزالة برنامج تلفزيوني دقيق.
      ملاحظة: إضافة كميات كافية من برنامج تلفزيوني لكل خطوة الغسيل. على سبيل المثال، 1 مل من برنامج تلفزيوني ما يكفي للوحة 6-جيدا.
    6. كتلة الخلايا عن طريق إضافة المخزن المؤقت حظر تتألف من جيش صرب البوسنة 1% و 0.05% من السطح (مثل توين 20) في برنامج تلفزيوني عن ح 1 مع الهز لطيف.
    7. تجاهل حل حظر. إضافة جسم 5hmC المخفف (1: 200) إلى الخلايا واحتضان ح 2 في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
    8. تغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني ثلاث مرات لمدة 15 دقيقة.
    9. إضافة فلوروفوري مخفف (فيتك)-مترافق جسم الثانوي (1: 200) إلى الخلايا واحتضانها ح 1.
    10. تغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني ثلاث مرات على نطاق واسع لإزالة الأجسام المضادة المتبقية.
    11. إضافة 250 نانوغرام/مليلتر من 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) وصمة عار النواة لأدنى 5 إزالة الحل المصبوغة.
    12. جبل الطبق الثقافة الشريحة أو أسفل الزجاج مع الخلايا إيمونوستاينيد لتصوير [كنفوكل]. وأبدى ممثل نتيجة الشكل 1B.
  2. التدفق الخلوي
    ملاحظة: استخدم لوحة أسفل جولة 96-جيدا للإجراء التالي المصبوغة. 150 ميليلتر من الكواشف عادة كافية لكل بئر.
    1. ريسوسبيند الخلايا ترانسفيكتيد والتي يسببها ربمسن في المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية (برنامج تلفزيوني مع جيش صرب البوسنة 1%, 2 مم يدتا). لمجموعة المراقبة، استخدام الخلايا معربا عن عصير التفاح بدون علاج ربمسن.
    2. إصلاح وبيرميبيليزي الخلايا كما هو موضح في "الخطوة 2، 1".
    3. إضافة 2 N HCl في الخلايا لتؤذي الحمض النووي لمدة 10 دقائق.
    4. تجاهل HCl. تحييد وكتلة الخلايا كما هو موضح في "الخطوة 2، 1".
    5. إضافة جسم 5hmC مكافحة مخفف (1: 200) إلى الخلايا واحتضانها ح 1 في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
    6. تغسل الخلايا مع المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية ثلاث مرات. إزالة المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية تماما.
    7. إضافة فلوروفوري مخفف (فيتك)-مترافق جسم الثانوي (1: 400) لخلية تنشيط fluorescence الفرز التحليل (نظام مراقبة الأصول الميدانية)، واحتضان ح 1 في درجة حرارة الغرفة.
    8. تغسل الخلايا مع المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية ثلاث مرات.
    9. نماذج جاهزة لتحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية. وأبدى ممثل نتيجة الرقم 1-د.

3-المبالغ المقايسة دوت-وصمة عار لقياس 5hmC و 5-ميثيلسيتوسيني (5mC)

  1. عزل الحمض النووي من الخلايا ترانسفيكتيد والتي يسببها ربمسن باستخدام مجموعة أدوات استخراج الحمض النووي تجاري. لمجموعة المراقبة، استخدم عصير التفاح transfected الخلايا دون علاج ربمسن.
  2. حرارة الفرن الفراغ إلى 80 درجة مئوية ونقع قبل غشاء النيتروسليلوز في المقطر مزدوجة ح2س ثم في 6 × سترات الصوديوم المالحة (SSC) المخزن المؤقت لمدة 10 دقائق.
  3. تحميل 60 ميليلتر من كميات متساوية من الحمض النووي (ميكروغرام 2 المجموع في المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات) إلى لوحة بكر 96-جيدا. إضافة 30 ميليلتر من المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات (10 ملم تريس-HCl، 1 مم يدتا، pH 8.0) إلى بقية الآبار.
  4. جعل تخفيف المسلسل شقين عمودياً على اللوحة 96-جيدا بنقل 30 ميليلتر من الحل في الصف 1 إلى نفس الموضع العمود في الصف 2. المزيج مرة أخرى ونقل 30 ميليلتر من الحل للآبار في الصفوف اللاحقة حتى الوصول إلى الحدود.
إزالة ميليلتر 30 آخر.
  • إضافة 20 ميليلتر يدتا هيدروكسيد الصوديوم و 10 ملم 1 م لكل بئر وختم اللوحة وتسخين المخلوط لمدة 10 دقيقة عند 95 درجة مئوية تجريدها تماما مزدوج الحمض النووي.
  • فورا يبرد العينات على الجليد وإضافة 50 ميليلتر من خلات الأمونيوم 2 م المثلج (pH 7.0) واحتضان على الجليد لمدة 10 دقائق.
    ملاحظة: الخطوات 3.7-3.10 ينطوي على استخدام الفراغ.
  • تجميع جهاز وصمة عار دوت مع غشاء ما قبل غارقة وإزالة بقايا المخزن المؤقت باستخدام فراغ كامل.
  • يغسل الغشاء بإضافة 200 ميليلتر من المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات لكل بئر من جهاز وصمة عار دوت. بدوره على فراغ لإزالة المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات.
  • تحميل الحمض النووي التشويه والتحريف (أعد في الخطوات السابقة 3.1 3.6) لكل بئر من جهاز وصمة عار دوت. بدوره على فراغ إزالة الحل.
  • يغسل الغشاء بإضافة 200 ميليلتر من 2 × التعاون بين بلدان الجنوب وإزالة الحلول المتبقية تماما استخدام الفراغ.
  • تفكيك جهاز وصمة عار دوت وتأخذ بها الغشاء وشطف الغشاء كله مع 20 مل 2 x SSC.
  • أيردري الغشاء لمدة 20 دقيقة.
  • خبز الغشاء عند 80 درجة مئوية تحت الفراغ ح 2.
  • إضافة حل حظر (اللبن المقشود 5% في تبسة) للغشاء واحتضانها ح 1 في درجة حرارة الغرفة.
  • تجاهل حل حظر. إضافة 5hmC المخفف (1:5، 000) أو 5mC (1:1، 000) الأجسام المضادة للغشاء واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
  • يغسل الغشاء مع تبسة ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لإزالة الأجسام المضادة المتبقية. إزالة تبسة جيدا.
  • إضافة جسم ثانوي HRP مترافق (01:10، 000 لأرنب المضادة HRP(5hmC) أو 1:3,000 للماوس HRP(5mC)) المضادة للغشاء واحتضانها ح 1 في درجة حرارة الغرفة.
  • يغسل الغشاء مع تبسة ثلاث مرات لمدة 10 دقائق.
  • إضافة مسافنة الغربية النشاف الركيزة للغشاء لتصور إشارات 5hmC باستخدام جهاز للكشف عن تشيميلومينيسسينسي. وأبدى ممثل نتيجة الشكل 1E.

    • Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    يمكن التحقق من صحة التحويل 5mC إلى 5hmC إيندوسيبلي الكيميائية التي إيمونوستاينينج على مستوى خلية واحدة، والتدفق الخلوي التحليل على السكان ترانسفيكتيد (متشيري-إيجابي) الخلية أو كمية أكثر مقايسة دوت-وصمة عار كما هو مبين في الشكل 1. المجال الحفاز من TET2، أو TET2CD، استخدمت طوال فترة الدراسة كعنصر إيجابي. راجع مراجع 18-20 لمزيد من التفاصيل فيما يتعلق برسم خرائط الجينوم على نطاق المنظومة للتغيرات المستحثة ربمسن في الوصول إلى 5hmC والكروماتين.

    Figure 1
    رقم 1: عصير التفاح بوساطة إيندوسيبلي هيدروكسيميثيليشن الحمض النووي في الخلايا HEK293T- (أ) تصميم أداة إعادة عرض (عصير التفاح) ابيجينومي إيندوسيبلي الكيميائية استناداً إلى انقسام الإنزيم TET2. (ب) ممثل إيمونوستينينج النتائج في الخلايا HEK293T الإعراب عن عصير التفاح-مشري قبل (اللوحة العلوية) بعد (أسفل اللوحة)، والعلاج ربمسن (200 نانومتر). الأخضر، 5hmC، أحمر، عصير التفاح-مشري، الأزرق، DAPI تلطيخ نويات. شريط المقياس = 10 ميكرون. (ج) الإنتاج "الكمي من عصير الفاكهة" بوساطة 5hmC بتحليل التدفق الخلوي. خلايا HEK293T transfected مع عصير التفاح-مشري من TET2CD-مشري (كالمراقبة الإيجابية) كانت ملطخة بجسم أساسي مكافحة 5hmc وجسم ثانوي المسمى فيتك. إلا TET2 (متشيري) 5hmC وبوابات الخلايا إيجابية مزدوجة (فيتك) وتشير إلى. (د) دورة الوقت لإنتاج المواد الكيميائية إيندوسيبلي من 5hmC في الخلايا HEK293T الإعراب عن عصير التفاح عقب سحب ربمسن أو الإدارة (200 nM). n = 5، البيانات كما هو موضح يعني ± التنمية المستدامة (E) دوت-وصمة عار المقايسة لقياس التغييرات ربمسن إيندوسيبلي في مستويات 5hmC في الخلايا HEK293T. تم transfected الخلايا HEK293T مع بناء TET2CD أو عصير التفاح. اليغنوكليوتيد اصطناعية مع كمية معروفة من 5hmC كعنصر إيجابي (الصف العلوي). عرض عنصر التحكم تحميل تصور الإيثيلين الأزرق تلطيخ المبالغ الإجمالية لإدخال الحمض النووي في أسفل لوحة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    هنا أننا قد يتضح استخدام إنزيم TET2 انقسام هندسيا لتحقيق التحكم الزمني للحمض النووي هيدروكسيميثيليشن. عقب اكتشاف عائلة تيت ديوكسيجيناسي 5-ميثيسيتوسيني، تم إجراء العديد من الدراسات فك الوظائف البيولوجية تيت البروتينات وعلى المنتج الحافز الرئيسي 5hmC1،2،3، 4،5،،من67،،من89،10،11. ومع ذلك، تواصل السيطرة الزمنية ودقيقة على التعديلات الدنا في الجينوم تحديا تطلبا للحقل. لدينا نظام عصير التفاح واحد من عدد قليل من النظم التي تستخدم الحمض الخلوي الصبغي هندسيا تعديل الإنزيم لسد هذه الفجوة التقنية. البروتوكول الموضحة هنا معظمها مصممة لنظم نموذجية الخلوية، مثل الكلي الجنينية البشرية (HEK) 293T وخطوط الخلية هيلا. تركيزات ربمسن ووقت العلاج قد تحتاج إلى تعديل لتحقيق الأداء الأمثل في أنواع مختلفة من الخلايا. للحصول على أفضل نقطة الوقت التعريفي 5hmC، تجربة دورة وقت، كما وصفها في المقطع 1.3.3، ينصح بشدة. يمكن استخدام الفلورة تلطيخ من 5hmC في transfected الخلايا كقراءات الأكثر ملاءمة. لإجراء مزيد من تحليل الكمي، ينصح مقايسة دوت-وصمة عار ولكن قد يستغرق الإجراءات أكثر شاقة. لفحوصات دوت-وصمة عار، الكميات من الحامض النووي الإدخال يجب أن يكون الأمثل لأنواع مختلفة من الخلايا. من المستحسن تجربة معايرة دقيقة استخدام إضعاف إضعاف المسلسل مع اختلاف المبالغ تحميل الحمض النووي.

    يمكن استخدام نظام عصير التفاح على نطاق واسع لتشريح العلاقة بين هيدروكسيميثيليشن الحمض النووي والتغيرات المظهرية في مختلف النظم البيولوجية. وفيما يلي تطبيقات المصب المثالية أو الأسئلة التي يمكن معالجتها باستخدام نظام عصير التفاح.

    كيف ستغير أكسدة 5mC تيت بوساطة المشهد مثلايشن الحمض النووي في مختلف نموذج نظام الهاتف الخلوي؟ وهذا يمكن الآن بسهولة معالجتها بمقارنة مثيلوم الحمض النووي وهيدروكسيميثيلومي قبل وبعد العلاج ربمسن. كيف ستغير التعديلات إمكانية الوصول وهيستون الكروماتين هيدروكسيميثيليشن الحمض النووي؟ نتائج مقارنة seq أتاك ورقاقة Seq في نفس الخلية قبل وبعد إقامة ربمسن كفيل بالإجابة. منذ تيت البروتينات تلعب دوراً قمعية في أنواع معينة من السرطان، سيكون من المثير للاهتمام أن اختبار استعادة إيندوسيبلي كيميائية كيف البروتين تيت وإنتاج 5hmC سوف تؤثر على نمو الورم. نظراً لدور تيت/5hmC في تمايز الخلايا الجذعية، فإنه لا يزال يتعين مصممة الإنتاج 5hmC كيف وقتيا الخاضعة للرقابة في مرحلة انتقالية محددة تؤثر على مواصفات نسب الخلايا الجذعية من خلال التنمية.

    في شكلها الحالي، يمكن فقط استخدام النظام عصير التفاح للحث على تحويل 5mc إلى 5hmC على الصعيد العالمي. ومن الناحية المثالية، يمكن أن تنصهر فيها عصير التفاح مع Cas9 حفازة غير نشط أو في أورثولوجويس، مما سيمكن استهداف مواقع محددة والحمض النووي إيندوسيبلي مثلايشن التحرير في الجينوم. هذه epigenome الكيميائية إيندوسيبلي دقيقة إعادة عرض أداة يمكن تطبيقها على نطاق واسع للتحقيق لا لبس فيه أن العلاقات ابيجينوتيبي-النمط الظاهري في الثدييات دون تغيير الشفرة الجينية.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    الكتاب يعلن لا تضارب المصالح المالية.

    Acknowledgments

    ونحن نشكر المالية منح يدعم من "المعاهد الوطنية للصحة" (R01GM112003 إلى YZ)، مؤسسة ولش (BE-1913 إلى YZ) وجمعية السرطان الأمريكية (TBE RSG-16-215-01 إلى YZ)، والوقاية من السرطان ومعهد تكساس للبحث (RR140053 إلى YH، RP170660 إلى YZ)، جمعية القلب الأمريكية (16IRG27250155 إلى أي إتش)، والبرنامج جائزة جون س. دن مؤسسة البحوث التعاونية.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific 11668027
    Rapamycin Sigma-Aldrich 37094
    Paraformaldehyde, 16% Solution VWR 100503-916
    Triton X-100 Amresco 0694-1L
    Hydrochloric Acid Amresco 0369-500ML
    Albumin, Bovine Amresco 0332-100G
    Tween 20 Amresco 0777-1L
    5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) antibody (pAb) Active Motif 39769
    Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-11008
    4,6-Diamidino-2-phenylindolde (DAPI) Biotium 40043
    SVAC1E SHEL LAB Economy Vacuum Oven, 0.6 Cu.Ft. (17 L) SHEL LAB SVAC1E
    UltraPure SSC, 20X Thermo Fisher Scientific 15557036
    Bio-Dot Apparatus BIO-RAD 1706545
    Anti-5-methylcytosine (5mC) Antibody, clone 33D3 Millipore MABE146
    Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7076S
    Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7074S
    West-Q Pico Dura ECL Solution Gendepot W3653-100

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Li, E., Zhang, Y. DNA methylation in mammals. Cold Spring Harbor Perspectv Biol. 6 (5), a019133 (2014).
    2. Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324 (5929), 930-935 (2009).
    3. He, Y. F., et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science. 333 (6047), 1303-1307 (2011).
    4. Ito, S., et al. Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine. Science. 333 (6047), 1300-1303 (2011).
    5. Spruijt, C. G., et al. Dynamic readers for 5-(hydroxy)methylcytosine and its oxidized derivatives. Cell. 152 (5), 1146-1159 (2013).
    6. Lio, C. W., et al. Tet2 and Tet3 cooperate with B-lineage transcription factors to regulate DNA modification and chromatin accessibility. eLife. 5, e18290 (2016).
    7. Kellinger, M. W., et al. 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine reduce the rate and substrate specificity of RNA polymerase II transcription. Nat Struct Mol Biol. 19 (8), 831-833 (2012).
    8. Su, M., et al. 5-Formylcytosine Could Be a Semipermanent Base in Specific Genome Sites. Angew Chem Int Ed Engl. 55 (39), 11797-11800 (2016).
    9. Ko, M., et al. Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2. Nature. 468 (7325), 839-843 (2010).
    10. Huang, Y., Rao, A. Connections between TET proteins and aberrant DNA modification in cancer. Trends Genet. 30 (10), 464-474 (2014).
    11. Lu, X., Zhao, B. S., He, C. TET family proteins: oxidation activity, interacting molecules, and functions in diseases. Chem Rev. 115 (6), 2225-2239 (2015).
    12. Hu, L., et al. Crystal structure of TET2-DNA complex: insight into TET-mediated 5mC oxidation. Cell. 155 (7), 1545-1555 (2013).
    13. Hashimoto, H., et al. Structure of a Naegleria Tet-like dioxygenase in complex with 5-methylcytosine DNA. Nature. 506 (7488), 391-395 (2014).
    14. Banaszynski, L. A., Liu, C. W., Wandless, T. J. J. Characterization of the FKBP.rapamycin.FRB ternary complex. J Am Chem Soc. 127 (13), 4715-4721 (2005).
    15. Clackson, T., et al. Redesigning an FKBP-ligand interface to generate chemical dimerizers with novel specificity. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (18), 10437-10442 (1998).
    16. Ibrahimi, A., et al. Highly efficient multicistronic lentiviral vectors with peptide 2A sequences. Hum Gene Ther. 20 (8), 845-860 (2009).
    17. Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PLoS One. 6 (4), e18556 (2011).
    18. Lee, M., et al. Engineered Split-TET2 Enzyme for Inducible Epigenetic Remodeling. J Am Chem Soc. 139 (13), 4659-4662 (2017).
    19. Huang, Y., Pastor, W. A., Zepeda-Martínez, J. A., Rao, A. The anti-CMS technique for genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine. Nat Protoc. 7 (10), 1897-1908 (2012).
    20. Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide. Curr Protoc Mol Biol. 109 (21.29), 1-9 (2015).

    Tags

    الكيمياء، 130 قضية، مثلايشن الحمض النووي، التخلق، الكروماتين إمكانية الوصول، ديميثيلاتيون الحمض النووي، والبيولوجيا الكيميائية، TET2، 5-هيدروكسيميثيلسيتوسيني، والنسخ، والتعبير الجيني، وتحرير ابيجينومي
    إنزيم TET2 انقسام هندسيا للحمض النووي الكيميائية إيندوسيبلي هيدروكسيميثيليشن ويعيد البناء جينية
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Lee, M., Zhou, Y., Huang, Y. An… More

    Lee, M., Zhou, Y., Huang, Y. An Engineered Split-TET2 Enzyme for Chemical-inducible DNA Hydroxymethylation and Epigenetic Remodeling. J. Vis. Exp. (130), e56858, doi:10.3791/56858 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter