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Chemistry

Une Enzyme machiné Split-TET2 pour Hydroxymethylation inductible par produit chimique de l’ADN et le remodelage épigénétique

Published: December 18, 2017 doi: 10.3791/56858
Automatic Translation
1, 2, 1
1Centre for Epigenetics and Disease Prevention, Department of Molecular and Cellular Medicine, Institute of Biosciences and Technology, College of Medicine, Texas A&M University, 2Centre for Translational Cancer Research, Department of Medical Physiology, Institute of Biosciences and Technology, College of Medicine, Texas A&M University

Summary

Des protocoles détaillés pour introduire une enzyme machiné split-TET2 (cidre) dans des cellules de mammifères pour hydroxymethylation chimique d’ADN inductible et remodelage épigénétique sont présentés.

Abstract

Méthylation de l’ADN est une modification épigénétique stable et héréditaire dans le génome de mammifères et est impliquée dans la régulation de l’expression des gènes pour contrôler les fonctions cellulaires. Le renversement de la méthylation de l’ADN, ou la déméthylation de l’ADN, est véhiculé par la famille de protéine de translocation (TET) de dix-onze de dioxygénases. Bien qu’il a été largement rapporté qu’aberrante de méthylation de l’ADN et de déméthylation sont associés à des anomalies du développement et cancer, comment ces changements épigénétiques contribuent directement à l’altération ultérieure dans la progression expression ou d’une maladie génétique reste floue, en grande partie en raison du manque d’outils fiables pour ajouter ou supprimer les modifications de l’ADN dans le génome à une résolution spatiale et temporelle définie adéquatement. Pour surmonter cet obstacle, nous avons conçu une enzyme split-TET2 pour permettre le contrôle temporel de l’oxydation de la 5-méthylcytosine (5mC) et retouche ultérieure des États épigénétiques dans les cellules de mammifères en ajoutant simplement des produits chimiques. Nous décrivons ici les méthodes pour introduire un outil de retouche épigénome chimique-inductible (cidre), basé sur une enzyme machiné split-TET2, dans les cellules de mammifères et de quantifier la production inductible chimique de 5-hydroxyméthylcytosine (5hmC) avec immunomarquage, cytométrie en flux ou un dosage de dot-blot. Cet outil de retouche épigénome chimique-inducible trouverez large utilisation en interrogeant les systèmes cellulaires sans modifier le code génétique, ainsi que dans la détection des relations epigenotype−phenotype dans les systèmes biologiques différents.

Introduction

Méthylation de l’ADN, pour la plupart fait référence à l’ajout d’un groupe de méthyle à la position du carbone 5 de cytosine pour former 5-méthylcytosine (5mC), est catalysée par l’ADN méthyl-transférase (DNMTs). 5MC agit comme une marque épigénétique majeure dans le génome de mammifères qui signale souvent pour répression transcriptionnelle, inactivation du chromosome x et transposon silencieux1. Le renversement de la méthylation de l’ADN est médié par la famille de protéine de translocation (TET) dix-elven. Enzymes de TET appartiennent au fer (II) et 2-oxoglutarate dioxygénases dépendants qui catalysent l’oxydation successifs de 5mC 5-hydroxyméthylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5FC) et 5-carboxycytosine (5caC). TET-mediated 5mC oxydation impose une couche supplémentaire de contrôle épigénétique sur le génome des mammifères. La découverte de TET a suscité l’intérêt intense dans le domaine épigénétique pour dévoiler les fonctions biologiques des protéines TET et leur principal produit catalytique 5hmC. 5hmC n’est pas seulement un intermédiaire durant la médiation TET active ADN déméthylation2,3,4, mais aussi agit comme une écurie épigénétique marque5,6,7,8 . ADN hydroxymethylation est fortement corrélé avec l’expression des gènes et aberrante dans ADN hydroxymethylation est associée à certaines maladies humaines9,10,11, les relations de cause à effet entre des modifications épigénétiques sur l’ADN et les phénotypes restent souvent difficiles à établir, qui peut être partiellement attribué à l’absence d’outil fiable pour ajouter ou supprimer des modifications de l’ADN dans le génome à adéquatement défini temporelle et spatiale résolution.

Nous rapportons ici l’utilisation d’un chimique-inducible épigénome remodelage outil (cidre) à surmonter l’obstacle face à des études de relations causales entre hydroxymethylation et gène transcription de l’ADN. La conception est basée sur l’hypothèse que le domaine catalytique de TET2 (TET2CD) peut se scinder en deux fragments inactifs lorsqu’elle est exprimée dans les cellules de mammifères et sa fonction enzymatique peut être reconstituée en adoptant une approche de dimérisation chimiquement inductible ( Figure 1 a). Pour mettre en place un système de split-TET2CD, nous avons sélectionné six sites dans TET2CD, composé d’une région riche en Cys et un pli double brin β-hélice (DSBH), sur la base d’une structure en cristal rapportés du complexe ADN-TET2 qui ne dispose pas d’une région de faible complexité12. Un gène synthétique codant la protéine inductible par la rapamycine dimérisation module FK506 12 (FKBP12) et domaine de liaison de la rapamycine FKBP (FRB) de la cible mammalienne de rapamycine14,15, ainsi que d’un peptide Self clivage T2A polypeptide séquence16,17, a été individuellement insérés dans les sites sélectionnés split dans TET2CD. La sélection de TET2 que notre objectif de génie est basée sur les considérations suivantes. Premières mutations somatiques dans TET2 avec réduction concomitante dans hydroxymethylation de l’ADN sont fréquemment observées dans les maladies humaines, y compris les troubles myéloïdes et cancer10, qui fournit des informations utiles sur les sites sensibles à éviter pour insertion. Deuxièmement, une fraction importante du domaine catalytique TET2, plus particulièrement la région de faible complexité, est indispensable pour la fonction enzymatique12, afin que nous puissions concevoir un split-TET2 réduite pour les modifications épigénétiques inductibles. Après le dépistage des constructions de plus de 15, une construction qui expose plus haute restauration rapamycine inductible de l’activité enzymatique dans le système des mammifères a été choisie et désignée comme cidre18. Nous décrivons ici l’usage du cidre mCherry-tag pour atteindre inductible ADN hydroxymethylation et remodelage épigénétique avec la rapamycine et présenter trois méthodes pour valider la production induite par le cidre 5hmC dans un système cellulaire de modèle HEK293T.

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Protocol

1. Culture, Transfection de plasmide et Induction chimique des cellules

  1. Culture d’une lignée de cellules adhérentes (p. ex., l’embryonnaire rein humain cellules HEK293T) au moyen de l’aigle modifié de Dulbecco (DMEM), additionnée de 10 % sérum de veau fœtal inactivés par la chaleur, 100 U/mL de pénicilline et de streptomycine à 37 ° C, avec 5 % de CO2.
  2. Transfecter les cellules avec le plasmide de cidre.
    1. Au moins 18 heures avant la transfection, semences 0,3 x 106 cellules à 2,5 mL de DMEM approprié par bien dans une plaque 6 puits et incuber à 37 ° C pendant la nuit pour atteindre 60 à 80 % confluence des cellules.
    2. Réchauffez le réactif de transfection à température ambiante avant utilisation.
    3. Place 250 µL de milieu sans sérum dans un tube stérile.
      Remarque : Ce montant est adapté pour une plaque 6 puits avec confluence de 80 %. Le cas échéant, proportionnellement ajuster les quantités moyennes selon les tailles de plaques ou le nombre de cellules.
    4. Ajouter 2,5 µg du plasmide codant cidre18 ou le domaine catalytique de TET2 (TET2CD comme témoin positif)12,13 dans le milieu sans sérum et doucement de la composition de pipetage.
    5. Ajouter 7,5 µL de réactif de transfection pour le mélange de l’ADN dilué et mélanger doucement en pipettant également.
    6. Incuber le mélange à température ambiante pendant 20 à 30 min.
    7. Changer les médias préchauffé et ajouter le mélange de goutte-à-goutte dans les puits et secouez légèrement la plaque de culture cellulaire pour répartir uniformément le mélange de l’ADN et de réactif de transfection de.
    8. Incuber les cellules et le mélange jusqu’au lendemain et puis remplacez le réactif de transfection contenant des médias avec 2ml de frais DMEM complet.
  3. Induction chimique
    1. Diluée à 2 mM du stock de la rapamycine (dissoute dans le DMSO) à une concentration de 20 µM en milieu complet approprié.
    2. Ajouter 20 µL de la rapamycine diluée aux cellules transfectées maintenues dans un milieu de 2 mL pour atteindre une concentration finale de 200 nM.
      NOTE : Après incubation pendant 48 h, les cellules sont prêtes pour la quantification de la génération de 5hmC ou d’autres applications en aval. Si nécessaire, l’efficacité de l’induction peut être surveillée en ôtant les cellules toutes les 3 h pour plus 5hmC quantification tel que décrit ci-dessous et illustrée à la Figure 1.
    3. Pour une meilleure quantification de l’efficacité de l’induction 5hmC, semences différents puits pour surveiller des cellules toutes les 3 heures.

2. quantification de la Production induite par la rapamycine 5hmC par immunomarquage

  1. 5hmC immunofluorescence souillant
    NOTE : Ajouter une quantité suffisante de la solution de fixation, composé de paraformaldéhyde à 4 %, 0,2 % agent tensio-actif (par exemple X-100 Triton) dans du PBS avec 3 N HCl, pour couvrir toutes les cellules de la plaque. Par exemple, 500 µL de solution serait suffisant pour un puits dans une plaque 6 puits. Effectuez toutes les opérations à température ambiante.
    1. Pour corriger les cellules, ajoutez paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS à cellules traitées à la rapamycine pendant 15 min à température ambiante. Pour le groupe témoin, utiliser les cellules exprimant mCherry-cidre sans traitement de la rapamycine. Ne pas agiter.
      ATTENTION : Paraformaldéhyde est toxique. Porter une protection appropriée.
    2. Jeter la solution fixateur. Incuber les cellules fixes avec 0,2 % tensioactif dans du PBS pendant 30 min pour permeabilize la membrane cellulaire.
    3. Jeter la solution perméabilisation. Ajouter 3 N HCl dans les cellules perméabilisées et incuber pendant 15 min dénaturer l’ADN.
    4. Jetez HCl. Ajouter un tampon Tris-HCl 100 mM (pH 8,0) aux cellules pendant 10 min pour la neutralisation du pH.
    5. Jeter toute la solution. Laver les cellules soigneusement avec du PBS pour 3 - 5 fois. Enlevez complètement les PBS.
      NOTE : Ajouter des quantités suffisantes de PBS pour chaque étape de lavage. Par exemple, 1 mL de PBS est suffisant pour une plaque 6 puits.
    6. Bloquer des cellules en ajoutant le tampon de blocage comprenant BSA 1 % et 0,05 % d’agent tensio-actif (par exemple de Tween 20) dans du PBS pendant 1 h avec agitant doucement.
    7. Jeter la solution de blocage. Ajouter l’anticorps 5hmC dilué (1 : 200) aux cellules et incuber pendant 2 h à température ambiante ou pendant la nuit à 4 ° C.
    8. Laver les cellules avec du PBS trois fois pendant 15 min.
    9. Ajouter un fluorophore dilué (FITC)-conjugués anticorps secondaire (1 : 200) aux cellules et incuber pendant 1 heure.
    10. Laver les cellules avec du PBS trois fois abondamment pour éliminer les anticorps résiduels.
    11. Ajouter 250 ng/mL de 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pour colorer le noyau pendant 5 min. Retirer la solution colorante.
    12. Monter la boîte de Petri de diapositive ou de fond en verre avec immunomarquage des cellules pour l’imagerie confocale. Un résultat représentatif a été montré dans la Figure 1 b.
  2. Cytométrie en flux
    Remarque : Utilisez une plaque de 96 puits rond fond pour la procédure de marquage suivante. Normalement, 150 µL de réactifs est suffisant pour chaque puits.
    1. Remettre en suspension les cellules transfectées et induite par la rapamycine dans le tampon de FACS (PBS avec 1 % de BSA, 2 mM EDTA). Pour le groupe témoin, utiliser des cellules exprimant le cidre sans traitement de la rapamycine.
    2. Difficulté et permeabilize des cellules, comme décrit au point 2.1.
    3. Ajouter 2 N HCl aux cellules pour dénaturer l’ADN pendant 10 min.
    4. Jetez HCl. neutraliser et bloquer les cellules comme décrit au point 2.1.
    5. Ajouter un anticorps anti-5hmC dilué (1 : 200) aux cellules et incuber pendant 1 heure à température ambiante ou pendant la nuit à 4 ° C.
    6. Laver les cellules avec du tampon de FACS trois fois. Enlevez complètement le tampon de FACS.
    7. Ajouter un fluorophore dilué (FITC)-conjugués anticorps secondaire (1 : 400) pour la cellule activée par fluorescence tri analyse (FACS) et incuber pendant 1 heure à température ambiante.
    8. Laver les cellules avec du tampon de FACS trois fois.
    9. Les échantillons sont prêts pour l’analyse des FACS. Un résultat représentatif a été montré dans la Figure 1-D.

3. dot-blot Assay pour quantifier la 5hmC et la 5-méthylcytosine (5mC) s’élève

  1. Isoler l’ADN génomique des cellules transfectées et induite par la rapamycine en utilisant un kit commercial d’extraction d’ADN. Pour le groupe témoin, utiliser les cellules transfectées cidre sans traitement de la rapamycine.
  2. Chauffer le four sous vide à 80 ° C et trempage une membrane de nitrocellulose en bidistillée H2O et puis 6 x tampon citrate de solution saline-sodium (SSC) pendant 10 min.
  3. Charger 60 µL de quantités égales de l’ADN (total 2 µg dans un tampon TE) sur une plaque PCR 96 puits. Ajouter 30 µL de tampon TE (EDTA 1 mM, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0) dans les puits de repos.
  4. Faire des dilutions successives double verticalement sur la plaque à 96 puits en transférant 30 µL de solution de 1er rang à la même position de la colonne sur la ligne 2. Mélangez à nouveau et 30 µL de solution de transfert aux puits de la nouvelle ligne jusqu'à atteindre la limite.
Supprimer la dernière 30 µL.
  • Ajouter 20 µL de NaOH et 10 mM EDTA de 1 M dans chaque puits, sceller la plaque et chauffer le mélange pendant 10 min à 95 ° C pour dénaturer complètement le duplex d’ADN.
  • Immédiatement, refroidir les échantillons sur la glace et ajouter 50 µL de glacé d’acétate d’ammonium 2 M (pH 7,0) et incuber sur glace pendant 10 min.
    NOTE : Étapes 3,7-3.10 implique l’utilisation du vide.
  • Assembler l’appareil point de tache avec membrane préalablement trempé et enlever tampon résiduel en utilisant le vide total.
  • Laver la membrane en ajoutant 200 µL de tampon TE à chaque puits de l’appareil de dot blot. Allumez le vide pour éliminer le tampon TE.
  • Charger l’ADN dénaturé (préparé dans les étapes précédentes 3,1 à 3,6) dans chaque puits de l’appareil de dot blot. Allumez le vide pour éliminer la solution.
  • Laver la membrane en ajoutant 200 µL de 2 x solutions résiduaires SSC et supprimer complètement utilisant le vide.
  • Démonter l’appareil de dot blot, retirer la membrane et rincez l’ensemble membrane avec 20 mL de 2 x SSC.
  • Sécher la membrane pendant 20 min.
  • Cuire au four de la membrane à 80 ° C sous vide pendant 2 h.
  • Ajoutez la solution de blocage (5 % du lait écrémé dans un mélange TBST) à la membrane et incuber pendant 1 heure à température ambiante.
  • Jeter la solution de blocage. Ajouter un 5hmC dilué (1:5 000) ou 5mC (1:1, 000) anticorps dirigés contre la membrane et incuber une nuit à 4 ° C.
  • Nettoyer la membrane avec un mélange TBST trois fois pendant 10 min pour éliminer les anticorps résiduels. Enlevez un mélange TBST complètement.
  • Ajouter un anticorps secondaire conjugué HRP (01:10, 000 de anti-lapin HRP(5hmC) ou 1:3,000 de anti-souris HRP(5mC)) à la membrane et incuber pendant 1 heure à température ambiante.
  • Nettoyer la membrane avec un mélange TBST trois fois pendant 10 min.
  • Ajouter ECL western blotting substrat à la membrane pour la visualisation des signaux de 5hmC à l’aide d’un détecteur à chimiluminescence. Un résultat représentatif a été montré dans la Figure 1E.

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    Representative Results

    Conversion chimique de 5mC-à-5hmC inductible peut être validée par immunohistochimie au niveau de single-cell, analyse en cytométrie en flux sur les populations de cellules transfectées de (mCherry-positif) ou une épreuve plus quantitative de buvardage tel qu’illustré à la Figure 1. Le domaine catalytique de la TET2, ou TET2CD, ont été utilisés tout au long de l’étude comme témoin positif. Voir les références 18-20 pour plus amples renseignements sur la cartographie du génome des changements induits par la rapamycine en matière d’accessibilité 5hmC et la chromatine.

    Figure 1
    Figure 1 : induite par le cidre inductible hydroxymethylation d’ADN dans les cellules HEK293T. (A) conception d’un outil de retouche (cidre) épigénome inductibles par produit chimique issu d’une scission enzymatique TET2. (B) représentant immunostaining se traduit par des cellules HEK293T exprimant cidre-mCherry avant (du haut) et après (panneau inférieur) traitement de la rapamycine (200 nM). Vert, 5hmC, rouge, cidre-mCherry, DAPI bleu, coloration des noyaux. Echelle = 10 µm. (C), à la production induite par la Quantification du cidre 5hmC par analyse en cytométrie en flux. Les cellules HEK293T transfectées avec cidre-mCherry de TET2CD-mCherry (en tant que témoin positif) ont été colorées avec un anticorps primaire anti-5hmc et un anticorps secondaire marqué FITC. Seulement TET2 (mCherry) et 5hmC (FITC) double-positifs cellules étaient bloquées et indiqués. (D) évolution temporelle de production inductible chimique des 5hmC dans les cellules HEK293T exprimant le cidre après administration ou le retrait de la rapamycine (200 nM). n = 5, données présentées comme moyenne ± S.D. (E) Dot-blot assay pour quantifier les changements rapamycine inductible en 5hmC niveaux de cellules HEK293T. Les cellules HEK293T ont été transfectées avec un cidre ou TET2CD construct. Un oligonucléotide synthétique avec une quantité connue de 5hmC a été utilisé comme témoin positif (rangée du haut). Le contrôle de chargement visualisé par l’éthylène bleu coloration des montants totaux de l’ADN d’entrée a été affiché dans le panneau de fond. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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    Discussion

    Ici, nous avons illustré l’utilisation d’une enzyme machiné split-TET2 pour obtenir un contrôle temporel des hydroxymethylation de l’ADN. Après la découverte de la famille TET de 5-methycytosine dioxygénase, de nombreuses études ont été réalisées à déchiffrer la fonction biologique des protéines TET et leur principal produit catalytique 5hmC1,2,3, 4,5,6,7,8,9,10,11. Toutefois, un contrôle précis et temporel sur les modifications de l’ADN dans le génome demeure un défi exigeant pour le champ. Notre système de cidre est l’un des rares systèmes utilisant un ADN machiné Modification enzymatique pour combler les lacunes techniques. Le protocole décrit ci-après est surtout adapté pour les systèmes cellulaires de modèle, tels que le rein embryonnaire humain (HEK) 293 t et les lignées de cellules HeLa. Les concentrations de la rapamycine et durée du traitement peuvent devoir être ajustée pour optimiser les performances dans différents types de cellules. Pour trouver le meilleur point de temps d’induction 5hmC, une expérience de cours de temps, que nous avons décrit dans la section 1.3.3, est fortement recommandée. Immunofluorescence souillant des 5hmC dans les cellules transfected peut servir de la lecture plus pratique. Pour une analyse quantitative plus, un dosage de dot-blot est recommandé, mais il peut prendre des procédures plus laborieuses. Pour les tests de dot-blot, la quantité d’ADN d’entrée doit être optimisée pour différents types de cellules. Une expérience de titrage soigneusement à l’aide de dilutions 2 fois avec diverses quantités de chargement d’ADN est fortement recommandée.

    Le système de cidre permet largement de disséquer la corrélation entre les hydroxymethylation de l’ADN et des modifications phénotypiques dans les systèmes biologiques différents. Ci-dessous vous trouverez les applications en aval exemplaires ou questions qui peuvent être traitées avec le système de cidre.

    Comment oxydation induite par la TET 5mC modifiera le paysage de la méthylation de l’ADN dans divers systèmes cellulaires de modèle ? Cela peut maintenant être facilement résolu en comparant l’ADN méthylome et hydroxymethylome avant et après traitement de la rapamycine. Comment l’ADN hydroxymethylation modifiera la chromatine accessibilité et histone modifications ? Une comparaison de l’ATAC-seq et ChIP-Seq donne dans la même cellule avant et après que l’administration de la rapamycine dira la réponse. Car les protéines TET jouent un rôle suppresseur dans certains types de cancer, il sera intéressant de tester comment chimique restauration inductible de protéines TET et 5hmC production n’empiètera sur la croissance tumorale. Compte tenu du rôle de TET/5hmC dans la différenciation des cellules souches, reste à être déterminé comment temporellement contrôlée 5hmC production à un stade de transition défini auront une incidence sur la spécification de la lignée de cellules souches au cours du développement.

    Dans sa configuration actuelle, le système de cidre utilisable uniquement pour induire au niveau mondial conversion 5mc-à-5hmC. Idéalement, le cidre peut être fusionné avec un Cas9 catalytiquement inactif ou ses orthologues, qui permettra aux locus-spécifiques ciblant et inductible édition de méthylation de l’ADN dans le génome. Tel épigénome inductibles par produit chimique précise transformant l’outil peut être largement appliquée pour sonder sans ambiguïté des relations phénotype-epigenotype chez les mammifères sans modifier le code génétique.

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    Disclosures

    Les auteurs déclarent sans intérêts financiers concurrents.

    Acknowledgments

    Nous remercions le financier prend en charge de la National Institutes of Health accorde (R01GM112003 à YZ), la Fondation Welch (BE-1913 à YZ), l’American Cancer Society (RSG-16-215-01 TBE à YZ), la prévention du Cancer et Research Institute of Texas (RR140053 à YH, RP170660 à YZ), l’American Heart Association (16IRG27250155 à YH) et le programme de prix de recherche en collaboration de fondation de John S. Dunn.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific 11668027
    Rapamycin Sigma-Aldrich 37094
    Paraformaldehyde, 16% Solution VWR 100503-916
    Triton X-100 Amresco 0694-1L
    Hydrochloric Acid Amresco 0369-500ML
    Albumin, Bovine Amresco 0332-100G
    Tween 20 Amresco 0777-1L
    5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) antibody (pAb) Active Motif 39769
    Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-11008
    4,6-Diamidino-2-phenylindolde (DAPI) Biotium 40043
    SVAC1E SHEL LAB Economy Vacuum Oven, 0.6 Cu.Ft. (17 L) SHEL LAB SVAC1E
    UltraPure SSC, 20X Thermo Fisher Scientific 15557036
    Bio-Dot Apparatus BIO-RAD 1706545
    Anti-5-methylcytosine (5mC) Antibody, clone 33D3 Millipore MABE146
    Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7076S
    Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7074S
    West-Q Pico Dura ECL Solution Gendepot W3653-100

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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    Chimie numéro 130 méthylation de l’ADN épigénétique accessibilité de la chromatine déméthylation de l’ADN biologie chimique TET2 5-hydroxyméthylcytosine transcription expression génique épigénome édition
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    Lee, M., Zhou, Y., Huang, Y. An Engineered Split-TET2 Enzyme for Chemical-inducible DNA Hydroxymethylation and Epigenetic Remodeling. J. Vis. Exp. (130), e56858, doi:10.3791/56858 (2017).

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