Protocolli dettagliati per l'introduzione di un enzima derivati dal Spalato-TET2 (sidro) nelle cellule di mammiferi per chimica viscoelastica DNA hydroxymethylation e rimodellamento epigenetici sono presentati.
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Articolo metodologico
Un enzima Split-TET2 ingegnerizzati per chimica-inducible DNA Hydroxymethylation e rimodellamento epigenetico
In questo articolo
Sommario
Abstract
Metilazione del DNA è una modificazione epigenetica stabile ed ereditabile nel genoma dei mammiferi ed è coinvolta nella regolazione dell'espressione genica per controllare funzioni cellulari. L'inversione di metilazione del DNA, o demetilazione del DNA, è mediato dalla famiglia dieci-undici traslocazione (TET) proteina di diossigenasi. Anche se ampiamente è stato segnalato che aberrante metilazione del DNA e demetilazione sono associati con il cancro e difetti inerenti allo sviluppo, come questi cambiamenti epigenetici direttamente contribuiscano a successive modifiche in progressione di malattia o di espressione di gene rimane poco chiaro, in gran parte a causa della mancanza di strumenti affidabili accuratamente aggiungere o rimuovere modifiche del DNA nel genoma a risoluzione temporale e spaziale definita. Per superare questo ostacolo, abbiamo progettato un enzima di Spalato-TET2 per abilitare il controllo temporale della 5-metilcitosina (5mC) ossidazione e successivo rimodellamento degli Stati epigenetici in cellule di mammifero semplicemente aggiungendo sostanze chimiche. Qui, descriviamo i metodi per l'introduzione di uno strumento di ritocco epigenome chimico-inducibile (sidro), basato su un enzima derivati dal Spalato-TET2, in cellule di mammifero e quantificare la produzione chimica inducibile di 5-idrossimetilcitosina (5hmC) con immunostaining, citometria a flusso o un'analisi della macchia del puntino. Questo strumento di ritocco del chimico-inducible epigenome troveranno ampio uso in sistemi cellulari di interrogare senza alterare il codice genetico, così come nel sondaggio i rapporti di epigenotype−phenotype in vari sistemi biologici.
Introduzione
Metilazione del DNA, per lo più l'aggiunta di un gruppo metile in posizione del carbonio 5 della citosina per formare la 5-metilcitosina (5mC) si riferisce, è catalizzata dalla DNA metil-transferasi (DNMTs). 5mc agisce come un segno importante epigenetico nel genoma dei mammiferi che spesso i segnali per la repressione trascrizionale, inattivazione del cromosoma x e trasposoni silenziamento1. L'inversione di metilazione del DNA è mediata dalla famiglia delle proteine di traslocazione (TET) Ten-elfico. Gli enzimi TET appartengono al ferro (II) e 2-ossoglutarato dipendenti diossigenasi che catalizzano l'ossidazione successivo di 5mC 5-idrossimeti....
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Protocollo
1. cultura, plasmide transfezione e induzione chimica delle cellule
- Cultura una linea cellulare aderente (ad es., il rene embrionale umano delle cellule HEK293T) nel mezzo dell'Aquila di Dulbecco modificato (DMEM), completata con 10% inattivati siero bovino fetale, 100 U/mL di penicillina e streptomicina a 37 ° C con 5% CO2.
- Transfect cellule con il plasmide di sidro.
- Almeno 18 h prima di transfezione, seme 0,3 x 106 cellule in 2,5 mL di DMEM appropriato per bene in una piastra a 6 pozzetti e incubare le cellule a 37 ° C durante la notte per raggiungere confluency di 60-80%.
- Pre-riscal....
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Risultati
Conversione di 5mC-a-5hmC inducibile chimica può essere convalidato da immunostaining a livello di singola cellula, analisi di citometria a flusso su popolazioni cellulari trasfettate (mCherry-positivo) o un'analisi più quantitativa di macchia del puntino come illustrato nella Figura 1. Il dominio catalitico di TET2, o TET2CD, sono stati utilizzati in tutto lo studio come controllo positivo. Vedere riferimenti 18-20 per maggiori dettagli riguardo la mappatura.......
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Discussione
Qui abbiamo illustrato l'uso di un enzima di Spalato-TET2 derivati dal raggiungere il controllo temporale del DNA hydroxymethylation. Dopo la scoperta della famiglia di TET di 5-methycytosine diossigenasi, molti studi sono stati effettuati per decifrare le funzioni biologiche delle proteine TET e loro principali prodotto catalitica 5hmC1,2,3, 4,5,<.......
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano concorrenti interessi finanziari.
Ringraziamenti
Ringraziamo la finanziaria concedono supporti dai National Institutes of Health (R01GM112003 a YZ), la Fondazione di Welch (BE-1913-YZ), l'American Cancer Society (RSG-16-215-01 TBE per YZ), la prevenzione del cancro e Research Institute del Texas (RR140053 a YH, RP170660 a YZ), associazione americana del cuore (16IRG27250155 a YH) e il programma di premio di ricerca collaborativa Fondazione John S. Dunn.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Reagente di trasfezione Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668027 | |
| Rapamicina | Sigma-Aldrich | 37094 | |
| Paraformaldeide, soluzione al 16% | VWR | 100503-916 | |
| Triton X-100 | Amresco | 0694-1L | |
| Acido cloridrico | Amresco | 0369-500ML | |
| Albumina, Bovino | Amresco | 0332-100G | |
| Tween 20 | Amresco | 0777-1L | |
| 5-Idrossimetilcitosina (5-hmC) anticorpo (pAb) | Active Motif | 39769 | |
| Capra anti-coniglio IgG (H+L) Anticorpo secondario adsorbito in modo incrociato, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
| 4,6-Diamidino-2-fenilindolo (DAPI) | Biotium | 40043 | |
| SVAC1E SHEL LAB Forno sottovuoto economico, 0.6 Cu.Ft. (17 L) | SHEL LAB | SVAC1E | |
| UltraPure SSC, 20X | Thermo Fisher Scientific | 15557036 | |
| Bio-Dot Apparatus | BIO-RAD | 1706545 | |
| Anticorpo anti-5-metilcitosina (5mC), clone 33D3 | Millipore | MABE146 | |
| Anti-mouse IgG, Tecnologia | di segnalazione cellulare | 7076S | |
| Anti-coniglio IgG, | Tecnologia di segnalazione cellulare | 7074S | |
| West-Q Pico Dura ECL Solution | Gendepot | W3653-100 |
Riferimenti
- Li, E., Zhang, Y. DNA methylation in mammals. Cold Spring Harbor Perspectv Biol. 6 (5), a019133(2014).
- Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324 (5929), ....
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Ristampe e permessi
