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Chemistry

Un enzima Split-TET2 ingegnerizzati per chimica-inducible DNA Hydroxymethylation e rimodellamento epigenetico

Published: December 18, 2017 doi: 10.3791/56858
Automatic Translation
1, 2, 1
1Centre for Epigenetics and Disease Prevention, Department of Molecular and Cellular Medicine, Institute of Biosciences and Technology, College of Medicine, Texas A&M University, 2Centre for Translational Cancer Research, Department of Medical Physiology, Institute of Biosciences and Technology, College of Medicine, Texas A&M University

Summary

Protocolli dettagliati per l'introduzione di un enzima derivati dal Spalato-TET2 (sidro) nelle cellule di mammiferi per chimica viscoelastica DNA hydroxymethylation e rimodellamento epigenetici sono presentati.

Abstract

Metilazione del DNA è una modificazione epigenetica stabile ed ereditabile nel genoma dei mammiferi ed è coinvolta nella regolazione dell'espressione genica per controllare funzioni cellulari. L'inversione di metilazione del DNA, o demetilazione del DNA, è mediato dalla famiglia dieci-undici traslocazione (TET) proteina di diossigenasi. Anche se ampiamente è stato segnalato che aberrante metilazione del DNA e demetilazione sono associati con il cancro e difetti inerenti allo sviluppo, come questi cambiamenti epigenetici direttamente contribuiscano a successive modifiche in progressione di malattia o di espressione di gene rimane poco chiaro, in gran parte a causa della mancanza di strumenti affidabili accuratamente aggiungere o rimuovere modifiche del DNA nel genoma a risoluzione temporale e spaziale definita. Per superare questo ostacolo, abbiamo progettato un enzima di Spalato-TET2 per abilitare il controllo temporale della 5-metilcitosina (5mC) ossidazione e successivo rimodellamento degli Stati epigenetici in cellule di mammifero semplicemente aggiungendo sostanze chimiche. Qui, descriviamo i metodi per l'introduzione di uno strumento di ritocco epigenome chimico-inducibile (sidro), basato su un enzima derivati dal Spalato-TET2, in cellule di mammifero e quantificare la produzione chimica inducibile di 5-idrossimetilcitosina (5hmC) con immunostaining, citometria a flusso o un'analisi della macchia del puntino. Questo strumento di ritocco del chimico-inducible epigenome troveranno ampio uso in sistemi cellulari di interrogare senza alterare il codice genetico, così come nel sondaggio i rapporti di epigenotype−phenotype in vari sistemi biologici.

Introduction

Metilazione del DNA, per lo più l'aggiunta di un gruppo metile in posizione del carbonio 5 della citosina per formare la 5-metilcitosina (5mC) si riferisce, è catalizzata dalla DNA metil-transferasi (DNMTs). 5mc agisce come un segno importante epigenetico nel genoma dei mammiferi che spesso i segnali per la repressione trascrizionale, inattivazione del cromosoma x e trasposoni silenziamento1. L'inversione di metilazione del DNA è mediata dalla famiglia delle proteine di traslocazione (TET) Ten-elfico. Gli enzimi TET appartengono al ferro (II) e 2-ossoglutarato dipendenti diossigenasi che catalizzano l'ossidazione successivo di 5mC 5-idrossimetilcitosina (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) e 5-carboxycytosine (5caC). TET-mediata 5mC ossidazione impone un ulteriore livello di controllo epigenetico sopra il genoma dei mammiferi. La scoperta del TET ha suscitato interesse intenso nel campo epigenetico di svelare le funzioni biologiche delle proteine TET e loro 5hmC catalitica dei principali prodotti. 5hmC non è solo un intermedio durante il TET-mediata attivo DNA demetilazione2,3,4, ma anche atti come stalla epigenetica mark5,6,7,8 . Anche se hydroxymethylation del DNA è altamente correlato con l'espressione genica e aberrante cambiamenti nel DNA hydroxymethylation sono associati con alcuni disordini umani9,10,11, i rapporti di causalità tra le modifiche epigenetiche sul DNA e i fenotipi rimangono spesso difficile da stabilire, che può essere parzialmente attribuita alla mancanza di strumento affidabile con precisione aggiungere o rimuovere modifiche del DNA nel genoma presso definito temporale e spaziale ad alta risoluzione.

Qui segnaliamo l'uso di una prodotto chimico-inducible epigenome rimodellamento strumento (sidro) per superare l'ostacolo di fronte gli studi delle relazioni causali tra trascrizione del DNA hydroxymethylation e gene. Il design è basato sul presupposto che il dominio catalitico di TET2 (TET2CD) può essere diviso in due frammenti inattivi quando espresso in cellule di mammifero e sua funzione enzimatica può essere ripristinato attraverso un approccio di dimerizzazione chimicamente inducibile ( Figura 1A). Per stabilire un sistema di Spalato-TET2CD, abbiamo selezionato sei siti in TET2CD, composto di una regione ricca di Cys e una piega doppia elica β-elica (DSBH), sulla base di una struttura di cristallo segnalati di TET2-DNA complesso che manca di una regione di bassa complessità12. Un gene sintetico che codifica la proteina rapamicina-inducible dimerizzazione modulo FK506 12 (FKBP12) e dominio di legame di rapamicina FKBP (FRB) dell'obiettivo mammifero della rapamicina14,15, insieme a un peptide self-che fende T2A polipeptide sequenza16,17, singolarmente è stato inserito nei siti selezionati di Spalato all'interno di TET2CD. La selezione di TET2 come nostro obiettivo engineering si basa sulle seguenti considerazioni. Mutazioni somatiche, prime TET2 con concomitante riduzione del DNA hydroxymethylation sono osservate frequentemente in disordini umani tra cui disordini mieloidi e cancro10, che fornisce informazioni utili su siti sensibili deve essere evitato per inserimento. In secondo luogo, non una grande frazione di TET2 dominio catalitico, specialmente la regione di bassa complessità, è indispensabile per la funzione enzimatica12, consentendoci così di una split-TET2 minimizzato per modificazioni epigenetiche viscoelastiche del mestiere. Dopo lo screening oltre 15 costrutti, un costrutto che ha esibito più alto rapamicina-inducible restauro della sua attività enzimatica nel sistema mammifero è stato scelto e designato come sidro18. Qui descriviamo l'uso di sidro mCherry-etichetta per raggiungere viscoelastica DNA hydroxymethylation e rimodellamento epigenetico con rapamicina e presentiamo tre metodi per la convalida di produzione 5hmC sidro-mediata in un sistema cellulare modello HEK293T.

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Protocol

1. cultura, plasmide transfezione e induzione chimica delle cellule

  1. Cultura una linea cellulare aderente (ad es., il rene embrionale umano delle cellule HEK293T) nel mezzo dell'Aquila di Dulbecco modificato (DMEM), completata con 10% inattivati siero bovino fetale, 100 U/mL di penicillina e streptomicina a 37 ° C con 5% CO2.
  2. Transfect cellule con il plasmide di sidro.
    1. Almeno 18 h prima di transfezione, seme 0,3 x 106 cellule in 2,5 mL di DMEM appropriato per bene in una piastra a 6 pozzetti e incubare le cellule a 37 ° C durante la notte per raggiungere confluency di 60-80%.
    2. Pre-riscaldare il reagente di transfezione a temperatura ambiente prima dell'uso.
    3. Posto 250 µ l di medium senza siero in una provetta sterile.
      Nota: Tale importo è su misura per una piastra a 6 pozzetti con confluency di 80%. Se necessario, regolare proporzionalmente gli importi medi secondo le dimensioni delle piastre o numeri di cellulare.
    4. Aggiungere 2,5 µ g del plasmide codifica sidro18 o il dominio catalitico di TET2 (TET2CD come controllo positivo)12,13 nel medium privo di siero e delicatamente mescolare pipettando.
    5. Aggiungere 7,5 µ l di reagente di transfezione per la miscela di DNA diluita e mescolare delicatamente pipettando.
    6. Incubare la miscela a temperatura ambiente per 20-30 min.
    7. Cambiare supporto pre-riscaldato e aggiungere la miscela drop-wise pozzetti e scuotere delicatamente la piastra di coltura cellulare per distribuire uniformemente il reagente di transfezione e la miscela di DNA.
    8. Incubare le cellule e miscela per una notte e quindi sostituire il reagente di transfezione contenente media con 2ml di DMEM completo fresco.
  3. Induzione chimica
    1. Diluire 2 mM di rapamicina stock (dissolto in DMSO) a una concentrazione di 20 µM su mezzo completo adeguato.
    2. Aggiungere 20 µ l di rapamicina diluito a transfected le cellule mantenute in 2 mL medium per raggiungere una concentrazione finale di 200 nM.
      Nota: Dopo incubazione per 48 h, le cellule sono pronte per la quantificazione della generazione di 5hmC o qualsiasi altre applicazioni a valle. Se necessario, l'efficienza di induzione può essere monitorato tenendo fuori cellule ogni 3 h per ulteriori 5hmC quantificazione come descritto di seguito e illustrato nella Figura 1.
    3. Per migliore quantificazione dell'efficienza di induzione di 5hmC, seme separare pozzi per monitorare le cellule ogni 3 ore.

2. quantificazione della produzione indotta da rapamicina 5hmC immunostaining

  1. 5hmC colorazione di immunofluorescenza
    Nota: Aggiungere una quantità sufficiente di soluzione di fissazione, composto di paraformaldeide al 4%, 0,2% tensioattivo (ad esempio Triton X-100) in PBS con 3 N HCl, per coprire tutte le celle nella piastra. Ad esempio, 500 µ l di soluzione sarebbe sufficiente per un pozzo in una piastra a 6 pozzetti. Eseguire tutti i passaggi a temperatura ambiente.
    1. Per correggere le celle, aggiungere paraformaldeide al 4% in PBS cellule trattate con rapamicina per 15 min a temperatura ambiente. Per il gruppo di controllo, utilizzare le cellule che esprimono mCherry-sidro senza trattamento rapamicina. Non agitare.
      Attenzione: Paraformaldeide è tossico. Indossare una protezione appropriata.
    2. Scartare la soluzione fissante. Incubare le cellule fisse con tensioattivo 0,2% in PBS per 30 min per permeabilize della membrana cellulare.
    3. Eliminare la soluzione di permeabilizzazione. Aggiungere 3 N HCl a celle permeabilized e incubare per 15 minuti per denaturare il DNA.
    4. Scartare HCl. Add 100 mM Tris-HCl tampone (pH 8.0 alle cellule per 10 min per neutralizzazione del pH).
    5. Smaltire tutta la soluzione. Lavare le cellule accuratamente con PBS per 3 - 5 volte. Rimuovere accuratamente la PBS.
      Nota: Aggiungere una quantità sufficiente di PBS per ogni passaggio di lavaggio. Per esempio, 1 mL di PBS è sufficiente per una piastra a 6 pozzetti.
    6. Bloccare le cellule aggiungendo il tampone di bloccaggio composto da BSA 1% e lo 0,05% di tensioattivo (ad esempio di Tween 20) in PBS per 1 h con agitazione delicata.
    7. Scartare la soluzione bloccante. Aggiungere l'anticorpo 5hmC diluito (1: 200) per le cellule e incubare per 2 ore a temperatura ambiente o tutta la notte a 4 ° C.
    8. Lavare le cellule con PBS tre volte per 15 min.
    9. Aggiungere un fluoroforo diluito (FITC)-coniugato anticorpo secondario (1: 200) per le cellule e incubare per 1 h.
    10. Lavare le cellule con PBS tre volte estesamente per rimuovere anticorpi residui.
    11. Aggiungere 250 ng/mL di 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) per macchiare il nucleo per 5 min, rimuovere la soluzione colorante.
    12. Montare la piastra di coltura diapositiva o con fondo di vetro con celle immunostained per imaging confocale. Un risultato rappresentativo è stato mostrato in Figura 1B.
  2. Citometria a flusso
    Nota: Utilizzare una piastra di fondo tondo 96 pozzetti per la seguente procedura di colorazione. Di solito, 150 µ l di reagenti è sufficiente per ciascun pozzetto.
    1. Risospendere le cellule trasfettate e indotta da rapamicina nel buffer di FACS (PBS con BSA 1%, 2 mM EDTA). Per il gruppo di controllo, utilizzare sidro-esprimendo le cellule senza trattamento rapamicina.
    2. Difficoltà e permeabilize le celle come descritto nel punto 2.1.
    3. Aggiungere 2 N HCl alle celle per denaturare il DNA per 10 min.
    4. Scartare HCl. neutralizzare e bloccare le celle come descritto nel punto 2.1.
    5. Aggiungere un anticorpo anti-5hmC diluito (1: 200) per le cellule e incubare per 1 h a temperatura ambiente o durante la notte a 4 ° C.
    6. Lavare le cellule con buffer di FACS tre volte. Rimuovere accuratamente il buffer di FACS.
    7. Aggiungere un fluoroforo diluito (FITC)-coniugato anticorpo secondario (1: 400) per fluorescenza-attivato delle cellule ordinamento analisi (FACS) e incubare per 1 h a temperatura ambiente.
    8. Lavare le cellule con buffer di FACS tre volte.
    9. I campioni sono pronti per l'analisi di FACS. Un risultato rappresentativo è stato mostrato in Figura 1-D.

3. dot-blot Assay quantificare 5hmC e la 5-metilcitosina (5mC) ammonta

  1. Isolare il DNA di genomic dalle cellule trasfettate e indotta da rapamicina, utilizzando un kit di estrazione del DNA commerciale. Per il gruppo di controllo, utilizzare cellule trasfettate con sidro senza trattamento rapamicina.
  2. Riscaldare il forno vuoto a membrana di nitrocellulosa 80 ° C e pre-immersione in bidistillata H2O e poi in 6 x tampone salino-sodio citrato (SSC) per 10 min.
  3. Caricare 60 µ l di uguali quantità di DNA (totale 2 µ g in buffer di TE) per una piastra PCR a 96 pozzetti. Aggiungere 30 µ l di tampone di TE (Tris-HCl 10 mM, 1 mM EDTA, pH 8.0) il resto nei pozzetti.
  4. Effettuare diluizioni seriali verticalmente sulla piastra 96 pozzetti trasferendo 30 µ l di soluzione sulla riga 1 nella stessa posizione della colonna nella riga 2. Mescolare nuovamente e 30 µ l di soluzione di trasferimento per i pozzi nella riga successiva fino a raggiungere il confine.
Rimuovere le ultime 30 µ l.
  • Aggiungere 20 µ l di 1 M NaOH e 10 mM EDTA in ciascun pozzetto, sigillare la piastra e riscaldare la miscela per 10 min a 95 ° C per denaturare completamente il duplex di DNA.
  • Immediatamente raffreddare i campioni su ghiaccio e aggiungere 50 µ l di acetato di ammonio ghiacciata 2 M (pH 7.0) e incubare in ghiaccio per 10 min.
    Nota: Passaggi 3,7-3.10 coinvolge l'uso del vuoto.
  • Montare l'apparecchiatura di macchia del puntino con membrana pre-impregnata e rimuovere residui buffer utilizzando il vuoto completo.
  • Lavare la membrana con l'aggiunta di 200 µ l di buffer di TE ad ogni pozzetto dell'apparato di dot blot. Girare a vuoto per rimuovere il buffer di TE.
  • Caricare il DNA denaturato (preparato nei passaggi precedenti 3.1-3.6) in ciascun pozzetto dell'apparato di dot blot. Accendere l'aspirapolvere per rimuovere la soluzione.
  • Lavare la membrana con l'aggiunta di 200 µ l di 2X SSC e Rimuovi soluzioni residuale utilizzando completamente vuoto.
  • Smontare l'apparato di dot blot, togliere la membrana e sciacquare l'intera membrana con 20 mL di 2 x SSC.
  • Asciugare la membrana per 20 min.
  • Cuocere in forno la membrana a 80 ° C sotto vuoto per 2 h.
  • Aggiungere la soluzione bloccante (5% latte scremato in TBST) alla membrana e incubare per 1 h a temperatura ambiente.
  • Scartare la soluzione bloccante. Aggiungere un 5hmC diluito (1:5, 000) o 5mC (1:1, 000) anticorpi alla membrana e incubare per una notte a 4 ° C.
  • Lavare la membrana con TBST tre volte per 10 min per rimuovere anticorpi residui. Rimuovere accuratamente TBST.
  • Aggiungere un anticorpo secondario coniugato HRP (01:10, 000 per anti-coniglio HRP(5hmC) o 1:3,000 per anti-mouse HRP(5mC)) alla membrana e incubare per 1 h a temperatura ambiente.
  • Lavare la membrana con TBST tre volte per 10 min.
  • Aggiungere ECL western blotting substrato alla membrana per visualizzazione di segnali 5hmC utilizzando un rivelatore a chemiluminescenza. Un risultato rappresentativo è stato mostrato in Figura 1E.

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    Representative Results

    Conversione di 5mC-a-5hmC inducibile chimica può essere convalidato da immunostaining a livello di singola cellula, analisi di citometria a flusso su popolazioni cellulari trasfettate (mCherry-positivo) o un'analisi più quantitativa di macchia del puntino come illustrato nella Figura 1. Il dominio catalitico di TET2, o TET2CD, sono stati utilizzati in tutto lo studio come controllo positivo. Vedere riferimenti 18-20 per maggiori dettagli riguardo la mappatura del genoma dei cambiamenti indotti da rapamicina in accessibilità 5hmC e della cromatina.

    Figure 1
    Figura 1: sidro-mediata inducibile hydroxymethylation di DNA in cellule HEK293T. (A) progettazione di uno strumento di ritocco (sidro) chimico-inducible epigenome basato su una divisione TET2 enzima. (B) rappresentante immunostaining provoca HEK293T cellule esprimenti sidro-mCherry prima (pannello superiore) e dopo (pannello inferiore) trattamento rapamicina (200 nM). Verde, 5hmC, rosso, sidro-mCherry, blu, DAPI la macchiatura dei nuclei. Barra della scala = 10 µm. (C) produzione di 5hmC quantificazione del sidro-mediata dall'analisi di citometria a flusso. HEK293t cellule trasfettate con sidro-mCherry di TET2CD-mCherry (come controllo positivo) sono state macchiate con un anticorpo primario anti-5hmc e un anticorpo secondario marcato con FITC. Solo TET2 (mCherry) e 5hmC cellule doppio-positive (FITC) erano gated e indicate. (D) corso di tempo della produzione chimica inducibile di 5hmC in HEK293T cellule che esprimono sidro dopo amministrazione o ritiro della rapamicina (200 nM). n = 5, dati riportati come media ± S.D. (E) Dot-blot test per quantificare la rapamicina-inducible cambiamenti nei livelli di 5hmC in cellule HEK293T. HEK293t cellule transfected con sidro o TET2CD costrutto. Un oligonucleotide sintetico con una quantità nota di 5hmC è stato usato come controllo positivo (riga superiore). Il controllo di caricamento visualizzato da etilene blu macchiatura delle quantità totali di ingresso del DNA è stato mostrato nel pannello inferiore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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    Discussion

    Qui abbiamo illustrato l'uso di un enzima di Spalato-TET2 derivati dal raggiungere il controllo temporale del DNA hydroxymethylation. Dopo la scoperta della famiglia di TET di 5-methycytosine diossigenasi, molti studi sono stati effettuati per decifrare le funzioni biologiche delle proteine TET e loro principali prodotto catalitica 5hmC1,2,3, 4,5,6,7,8,9,10,11. Tuttavia, il controllo temporale e preciso sulle modificazioni del DNA nel genoma continua ad essere una sfida impegnativa per il campo. Il nostro sistema di sidro è uno dei pochi sistemi che utilizzano un derivati dal DNA modificando enzima per colmare questa lacuna tecnica. Il protocollo descritto nel presente documento è per lo più su misura per sistemi cellulari modello, quali il rene embrionale umano (HEK) 293T e le linee delle cellule HeLa. Rapamicina concentrazioni e tempi di trattamento potrebbe essere necessario essere regolato per ottenere prestazioni ottimali in diversi tipi cellulari. Per trovare il miglior punto di tempo di induzione 5hmC, un esperimento di corso del tempo, come abbiamo descritto nella sezione 1.3.3, è fortemente raccomandato. Colorazione di immunofluorescenza di 5hmC in cellule transfected può essere utilizzato come la lettura più conveniente. Per un'analisi più quantitativa, è consigliato un dosaggio di macchia del puntino, ma potrebbe richiedere più laboriose procedure. Per analisi di dot-blot, la quantità di DNA di input deve essere ottimizzato per diversi tipi di cellule. Un esperimento di titolazione attenta usando 2-Fold diluizione seriale con DNA caricamento quantità variabili è fortemente raccomandato.

    Il sistema di sidro può essere largamente utilizzato per sezionare la correlazione tra DNA hydroxymethylation e cambiamenti fenotipici in diversi sistemi biologici. Elencati di seguito sono applicazioni a valle esemplare o domande che possono essere affrontate con il sistema di sidro.

    Come TET-mediata 5mC ossidazione altera il paesaggio di metilazione del DNA nel sistema cellulare modello vari? Questo può ora essere facilmente affrontato confrontando il DNA methylome e hydroxymethylome prima e dopo il trattamento di rapamicina. Come DNA hydroxymethylation altererà modificazioni della cromatina accessibilità e istone? Un confronto di ATAC-seq e ChIP-Seq risultati nella stessa cella, prima e dopo somministrazione di rapamicina dirà la risposta. Poiché TET proteine svolgono un ruolo soppressivo in alcuni tipi di cancro, sarà interessante testare come chimico restauro viscoelastico della proteina TET e 5hmC produzione sarà incidono sulla crescita del tumore. Dato il ruolo di TET/5hmC nel differenziamento di cellule staminali, rimane per essere determinata produzione 5hmC come temporaneamente controllata in una fase di transizione definita avrà un impatto sulle specifiche di lineage delle cellule staminali durante lo sviluppo.

    Nella sua attuale configurazione, il sistema di sidro utilizzabile solo per indurre a livello globale 5mc-a-5hmC conversione. Idealmente, il sidro può essere fuso con un Cas9 cataliticamente inattivo o suoi ortologhi, che consentiranno di targeting loci specifici e modifica viscoelastica metilazione di DNA nel genoma. Tali epigenome chimico-inducible precisa strumento di rimodellamento può ampiamente applicarsi per sondare in modo inequivocabile le relazioni epigenotipo-fenotipo nei mammiferi senza alterare il codice genetico.

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    Disclosures

    Gli autori non dichiarano concorrenti interessi finanziari.

    Acknowledgments

    Ringraziamo la finanziaria concedono supporti dai National Institutes of Health (R01GM112003 a YZ), la Fondazione di Welch (BE-1913-YZ), l'American Cancer Society (RSG-16-215-01 TBE per YZ), la prevenzione del cancro e Research Institute del Texas (RR140053 a YH, RP170660 a YZ), associazione americana del cuore (16IRG27250155 a YH) e il programma di premio di ricerca collaborativa Fondazione John S. Dunn.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific 11668027
    Rapamycin Sigma-Aldrich 37094
    Paraformaldehyde, 16% Solution VWR 100503-916
    Triton X-100 Amresco 0694-1L
    Hydrochloric Acid Amresco 0369-500ML
    Albumin, Bovine Amresco 0332-100G
    Tween 20 Amresco 0777-1L
    5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) antibody (pAb) Active Motif 39769
    Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-11008
    4,6-Diamidino-2-phenylindolde (DAPI) Biotium 40043
    SVAC1E SHEL LAB Economy Vacuum Oven, 0.6 Cu.Ft. (17 L) SHEL LAB SVAC1E
    UltraPure SSC, 20X Thermo Fisher Scientific 15557036
    Bio-Dot Apparatus BIO-RAD 1706545
    Anti-5-methylcytosine (5mC) Antibody, clone 33D3 Millipore MABE146
    Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7076S
    Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7074S
    West-Q Pico Dura ECL Solution Gendepot W3653-100

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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    Lee, M., Zhou, Y., Huang, Y. An… More

    Lee, M., Zhou, Y., Huang, Y. An Engineered Split-TET2 Enzyme for Chemical-inducible DNA Hydroxymethylation and Epigenetic Remodeling. J. Vis. Exp. (130), e56858, doi:10.3791/56858 (2017).

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