Summary
哺乳類細胞化学誘導型 DNA hydroxymethylation およびエピジェネティックな改造のために設計された分割型 TET2 酵素 (サイダー) を導入するための詳細なプロトコルが表示されます。
Abstract
DNA メチル化は、哺乳類のゲノムの安定性と遺伝性のエピジェネティックな修飾と細胞機能を制御する遺伝子発現の調節に関与しています。DNA のメチル化や DNA 脱メチル化の逆転は、dioxygenases の 10-11 転流 (テト) 蛋白質家族によって媒介されます。異常な DNA のメチル化および脱メチル化、発育障害や癌に関連付けられて広く報告されたが、どのようにこれらのエピジェネティックな変化に直接貢献遺伝子発現や疾患の進行の後の変化正確に定義された時間的・空間的解像度でゲノムの DNA の変更を削除追加する信頼性の高いツールの不足が主原因、不明のまま。このハードルを克服するためには、5-メチルシトシン (5mC) の酸化反応の時間的制御と化学物質を追加するだけで哺乳類細胞におけるエピジェネティックな状態のそれに続く改造する分割型 TET2 酵素を設計されています。ここで、哺乳類細胞との 5-ヒドロキシメチルシトシン (5hmC) の化学誘導生産の定量化に設計された分割型 TET2 酵素に基づく化学誘導性エピゲノム改造ツール (サイダー) を導入するための方法を説明します。免疫染色、フローサイトメトリーやドット ・ ブロット分析。遺伝コードを変更することがなくセルラー システムを尋問でだけでなく、epigenotype−phenotype の関係を様々 な生物系の調査に、この化学誘導性エピゲノムの改造ツールは広い使用を見つけます。
Introduction
DNA のメチル化は大抵 5-メチルシトシン (5mC) を形成するシトシンの炭素 5 位置へメチル グループの付加を指し、DNA メチルのトランスフェラーゼ (種) によって触媒されます。5mC は、しばしば信号転写抑制、x 染色体不活性化とトランスポゾンのサイレンシング1哺乳類のゲノムの主要なエピジェネティックなマークとして機能します。DNA のメチル化の逆転は、10 エルフ転座 (テト) 蛋白質家族によって媒介されます。テト酵素は鉄 (II) に属する、2-オキソグルタル酸依存 dioxygenases 5-ヒドロキシメチルシトシン (5hmC)、5 formylcytosine (5 fC) および 5-carboxycytosine (5caC) 5mC の連続的な酸化を触媒します。テトを介した 5mC 酸化は、哺乳類のゲノム上のエピジェネティックな制御の追加層を課しています。テトの発見は、TET タンパク質の生物学的機能とその主要な触媒製品 5hmC を発表するエピジェネティックな分野に強い関心を呼んでいます。5hmC はテトを介したアクティブな DNA 脱メチル化2,3,4中の中間だけではないが、安定したエピジェネティックな行為が5,6,7,8 をマークするも.DNA hydroxymethylation の変更がいくつかの人間の疾患9,10,11, 因果関係に関連付けられている DNA hydroxymethylation 遺伝子の発現と相関性の異常がエピジェネティック修飾 dna と表現型の間おく確立への挑戦、時空に定義されて正確にゲノムの DNA の変更を削除追加する信頼性の高いツールの不足にすることができます部分的に帰される解像度。
ここで化学誘導性エピゲノム DNA hydroxymethylation および遺伝子のトランスクリプションの間ツールの因果関係の研究が直面しているハードルを克服するために (サイダー) を改造の使用を報告します。デザインが仮定に基づいている TET2 の触媒ドメイン (TET2CD) は、哺乳類細胞で発現したとき 2 つのアクティブでないフラグメントに分割でき、酵素としての働きを化学的に誘導性二量体化アプローチ (によって復元できます図 1 a)。分割 TET2CD システムを確立するには、システイン豊富な地域と二重鎖 β ヘリックス (DSBH) 倍、低複雑さ領域12を欠いている TET2 DNA 複合体の報告された結晶構造から成る TET2CD の六つのサイトを選択します。合成遺伝子ラパマイシン誘導二量体化モジュール FK506 結合タンパク質 12 (FKBP12) およびラパマイシン14,の15割自己ペプチド T2A とともに哺乳類ターゲットの FKBP ラパマイシン結合ドメイン (FRB)ポリペプチド順序16,17は、TET2CD 内の選択した分割のサイトに個別に挿入されました。当社のエンジニア リングの対象として TET2 の選択は、次の考慮事項に基づきます。骨髄性疾患癌10、使用を避けるために敏感なサイトに有用な情報を提供するなどの人間の疾患でしばしば DNA hydroxymethylation の併用削減と TET2 最初、体細胞変異が観測されます。挿入。第二に、複雑性が低い地域では特に TET2 触媒ドメインの大部分は酵素の機能12、こうして誘導エピジェネティック修飾の最小分割 TET2 をクラフトする私たちを有効にするために不可欠です。以上 15 構造をスクリーニングした後哺乳類システムでその酵素活性の高いラパマイシン誘導復元を展示構成は選択、サイダー18に指定します。ここ誘導型 DNA hydroxymethylation およびラパマイシンのエピジェネティックな改造を達成するためにタグ付きの mCherry サイダーの使用を記述し、HEK293T 細胞系における 5hmC のサイダーを介した生産を検証するための 3 つの方法を提示します。
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Protocol
1. 細胞培養、プラスミド トランスフェクションと化学的誘導
- 文化、付着性のセル (例えば、ヒト胚の腎臓 HEK293T 細胞) の行ダルベッコ変法イーグル培地 (DMEM) 10% 熱不活化牛胎児血清、100 U/mL ペニシリンとストレプトマイシン 5% CO2と 37 ° C で補われます。
- サイダーのプラスミドを持つセルを transfect します。
- トランスフェクション前に少なくとも 18 h、につき適切な DMEM の 2.5 mL の種子 0.3 x 106セル 6 ウェル プレートでよく、60-80% の confluency に到達する 37 ° C は一晩でセルを孵化させなさい。
- 事前のトランスフェクション試薬を使用する前に室温を暖めます。
- 生殖不能の管に無血清培地の場所 250 μ L。
注: この金額が 80% の confluency に 6 ウェル プレートに合わせて調整されます。必要な場合、板や細胞数のサイズによると培地量は比例的に調整します。 - サイダー18または TET2 の触媒ドメイン エンコード プラスミドの 2.5 μ g を追加 (肯定的な制御として TET2CD)12,13無血清培地にゆっくりとピペッティングで混ぜます。
- 希薄化後の DNA の混合物にトランスフェクション試薬の 7.5 μ L を追加し、軽くピペッティングで混ぜます。
- 20-30 分の室温で混合物を孵化させなさい。
- 予め温めておいたメディアを変更したり、drop-wise、井戸に混合物を追加し、トランスフェクション試薬と DNA の混合物を均等に分散させる細胞培養プレートを軽く振る。
- 細胞との混合物を一晩インキュベートし、2 ml の新鮮な完全な DMEM のメディアを含むトランスフェクション試薬を置き換えます。
- 化学的誘導
- ラパマイシン株式 (DMSO に溶解) 適切な完全培地で 20 μ M の濃度の希釈の 2 mM。
- 2 mL 中 200 の最終濃度に到達する維持 transfected セルに希薄ラパマイシンの 20 μ L を追加 nM。
注: 48 時間培養後の細胞、5hmC 世代の定量化や他のダウン ストリーム アプリケーションの準備ができて。必要な場合、誘導効率を細胞以下のとおりさらに 5hmC 定量化のためのすべての 3 h を取ることによって監視および図 1に示すようにできます。 - 5hmC 誘導効率のよりよい定量化のため種子は 3 時間おきにセルを監視する井戸を区切ります。
2. 免疫染色によるラパマイシン誘導 5hmC 生産の定量化
- 5hmC 免疫蛍光染色
注: は、プレートのすべてのセルをカバーする 3 N HCl で PBS で (トリトン X-100) など 0.2% を界面活性剤 4% パラホルムアルデヒドの固定の解決の十分な量を追加します。たとえば、ソリューションの 500 μ L は 6 ウェル プレートでも十分でしょう。室温ですべての手順を実行します。- セルを修正するには、周囲温度で 15 分間ラパマイシン処理細胞を PBS で 4% パラホルムアルデヒドを追加します。コントロール グループのラパマイシン標的治療せず mCherry サイダーを発現する細胞を使用します。揺り動かしてはいけない。
注意: パラホルムアルデヒドは有毒です。適切な保護具を着用します。 - 固定液を破棄します。細胞膜を permeabilize の 30 分間、PBS の 0.2% を界面活性剤で固定セルを孵化させなさい。
- 透過ソリューションを破棄します。グリセリンのセルに 3 N 塩酸を追加し、DNA を変性する 15 分間インキュベートします。
- PH の中和のため 10 分のセルに対する塩酸追加 100 mM トリス塩酸バッファー (pH 8.0) を破棄します。
- すべてのソリューションを破棄します。洗浄セル、PBS で徹底的に 3-5 回。PBS を徹底的に削除します。
注: は、すべて洗浄ステップの PBS の十分な量を追加します。たとえば、1 mL の PBS は、十分 6 ウェル プレートです。 - 穏やかな揺れで 1 時間 PBS で (トゥイーン 20) など界面活性剤の 0.05% 1 %bsa を有しブロック バッファーを追加してセルをブロックします。
- ブロッキング液を破棄します。セルに希釈 5hmC 抗体 (レバレッジ) を追加し、室温で 2 時間または 4 ° C で一晩インキュベート
- 3 回 15 分間 PBS のセルを洗浄します。
- 希釈した蛍光体 (FITC) を追加-共役二次抗体 (レバレッジ) セルに、1 時間インキュベートします。
- 洗浄は PBS のセル 3 回広範囲に残留抗体を削除します。
- 5 分削除染色液 250 ng/mL の 4', 6-diamidino-2-phenylindole 核を染色する (DAPI) を追加します。
- 共焦点レーザー顕微鏡のための immunostained 細胞をスライドまたはガラス底培養皿をマウントします。代表的な結果は、図 1 bに示されました。
- セルを修正するには、周囲温度で 15 分間ラパマイシン処理細胞を PBS で 4% パラホルムアルデヒドを追加します。コントロール グループのラパマイシン標的治療せず mCherry サイダーを発現する細胞を使用します。揺り動かしてはいけない。
- フローサイトメトリー
注: は、次のプロシージャを汚すの 96 ウェル丸底プレートを使用します。通常、試薬の 150 μ L の各ウェルに十分です。- FACS バッファー (1 %bsa、2 ミリメートルの EDTA を用いた PBS) のトランスフェクションとラパマイシン誘導細胞を再懸濁します。コントロール グループのラパマイシン標的治療せずサイダー発現細胞を使用します。
- 修正し、手順 2.1 で説明されるように、セルを permeabilize します。
- 2 N 塩酸を 10 分の DNA を変性するセルに追加します。
- 塩酸 Neutralize を破棄し、ステップ 2.1 で説明されているように、細胞をブロックします。
- セルに希釈の抗 5hmC 抗体 (レバレッジ) を追加し、室温でまたは一晩 4 ° C で 1 時間インキュベート
- FACS バッファーを持つセルを 3 回洗浄します。徹底的に FACS バッファーを削除します。
- 希釈した蛍光体 (FITC) を追加-共役二次抗体 (1: 400) 蛍光活性化セル (FACS) 分析を並べ替えのため、室温で 1 時間インキュベートします。
- FACS バッファーを持つセルを 3 回洗浄します。
- サンプルは、FACS 解析のため準備ができています。図 1-Dの代表的な結果を示した。
3. ドット ・ ブロット分析 5hmC、5-メチルシトシン (5mC) を定量化する金額
- 商業 DNA 抽出キットを使用して transfected およびラパマイシン誘導細胞からゲノム DNA を分離します。コントロール グループのラパマイシン標的治療せずサイダー transfected セルを使用します。
- ダブル蒸留 H2O にし、10 分のクエン酸塩ナトリウム (SSC) バッファー x 6 の 80 ° C および事前ソーク硝酸セルロースの膜を真空のオーブンを熱します。
- 96 ウェル PCR プレートに等しい量の DNA (TE バッファーの合計 2 μ g) の 60 μ L をロードします。残りの井戸に TE バッファー (10 mM トリス塩酸、1 ミリメートルの EDTA、pH 8.0) の 30 μ L を追加します。
- 行 1 の行 2 の列の同じ位置に転送してソリューションの 30 μ L で、96 ウェル プレートで垂直方向に 2 倍シリアル希薄を作る。再び混ぜるし、30 μ L のソリューションを境界に達するまで、後続の行で井戸に転送します。
注: 手順 3.7 3.10 は、真空の使用を含みます。
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Representative Results
化学誘導 5mC-5hmC 変換は、単一細胞レベルや流れフローサイトメトリー解析 (mCherry 陽性) 細胞集団により定量ドット ・ ブロット法図 1に示すように免疫染色によって検証できます。TET2、または TET2CD の触媒ドメインは、研究を通して肯定的な制御として使用されました。5hmC とクロマチンのアクセシビリティの参照 18 20 ラパマイシンによる変化のゲノム マッピングに関する詳細についてを参照してください。
図 1: HEK293T 細胞における誘導型 DNA hydroxymethylation のサイダーを介した。分割に基づく化学誘導性エピゲノム (サイダー) を改造ツール (A) 設計型 TET2 酵素。(B) 代表免疫染色の結果 (上部パネル) の前にサイダー mCherry を発現する HEK293T 細胞 (下段) の前後ラパマイシン処理 (200 nM)。グリーン、5hmC、赤、サイダー-mCherry、青、DAPI 染色の核。スケール バー = 10 μ m. (C) フローサイトメトリー法による定量化のサイダーを介した 5hmC 生産。(ポジティブ コントロール) として TET2CD mCherry のサイダー mCherry をトランスフェクトした HEK293T 細胞は抗 5hmc 一次抗体と FITC 標識二次抗体染色された.TET2 のみ (mCherry) と 5hmC (FITC) 二重陽性細胞がゲートし、示されました。(D) サイダー HEK293T 細胞で 5hmC の化学誘導生産の時間コース管理またはラパマイシンの撤退 (200 nM)。n = 5、HEK293T 細胞で 5hmC レベルのラパマイシン誘導変化を定量化する平均 ± 標準偏差 (E) ドット ・ ブロット法として表示されるデータ。HEK293T 細胞は、サイダー、または TET2CD のいずれかのコンス トラクターを導入させた。5hmC の既知量の合成オリゴヌクレオチドは、肯定的な制御 (上段) として使用されました。エチレンの合計量の入力 DNA の染色ブルーで可視化した負荷制御は、下部のパネルに示されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
ここで我々 は DNA hydroxymethylation の時間的制御を達成するために設計された分割型 TET2 酵素の使用を説明しています。5 methycytosine ジオキシゲナーゼのテト家族の発見、多くの研究を行った TET タンパク質とその主要な触媒製品 5hmC1,2,の3、生体の機能を解読するには 4,5,6,7,8,9,10,11。ただし、時間と正確な制御、ゲノムの DNA の変更は、フィールドの厳しい挑戦を続けています。サイダー体制はこの技術のギャップを埋めるため修飾酵素組み換え DNA を利用したいくつかのシステムの一つです。記載プロトコルはほとんど人間の萌芽期の腎臓 (HEK) 293 t、HeLa 細胞などのモデル携帯電話システムに合わせて調整します。ラパマイシンの濃度と処理時間は、異なる種類の細胞で最適なパフォーマンスを達成するために調整する必要があります。最高の 5hmC 誘導時間ポイントを見つける時間コース実験セクション 1.3.3、ようは強く推奨します。Transfected セルで 5hmC の免疫蛍光染色は、最も便利な読み出しとして使用できます。定量的な解析ドット ・ ブロット法をお勧めしますが、それはより困難なプロシージャをかかることがあります。ドット ・ ブロットの試金のため入力 DNA の量は、異なる種類の細胞に最適化されなければなりません。DNA 添加量を変化させて 2 倍連続希釈を使用して注意深く滴定実験することを強くお勧めします。
サイダー システムは、さまざまな生物系の DNA hydroxymethylation と表現型の変化との相関を分析に広く使用できます。模範的なダウン ストリーム アプリケーションまたはサイダー システムが対処することができる質問は次のとおりです。
テトを介した 5mC 酸化方法に様々 なモデルのセルラ システムにおける DNA メチル化風景を変更?これ今簡単に対処できますラパマイシン標的治療前後の DNA メチロームと hydroxymethylome を比較することによって。Hydroxymethylation DNA がクロマチン アクセシビリティとヒストン修飾を変更方法ATAC seq とチップ Seq の比較結果同じセルが前に、と後、ラパマイシンの投与が答えを教えてくれます。以来、TET タンパク質は、癌の特定の種類の抑制の役割を果たす、TET タンパク質の方法化学誘引可能な復元をテストする興味深いものになるし、5hmC 生産が腫瘍の成長に影響を与えます。幹細胞分化におけるテト/5hmC の役割を考えると、それは開発時に幹細胞の分化に影響を与える定義作れたら段階でどのように一時的に制御 5hmC 生産を決定する残る。
現在の構成でサイダー システムはグローバルに 5mc-5hmC 変換を誘導するためにのみ使用できます。理想的には、サイダーは、触媒不活性 Cas9 またはその第オーソロガス遺伝子をターゲットとゲノムの誘引可能な DNA メチル化の編集を可能にすると融合することができます。改造ツールこのような正確な化学誘導性エピゲノムは、遺伝コードを変更することがなく哺乳類の epigenotype 表現型の関係を明確にプローブに広く適用できます。
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Disclosures
著者は競合する金銭的な利益を宣言しません。
Acknowledgments
我々 は金融に感謝健康の国民の協会からのサポートを許可 (YZ に R01GM112003)、ウェルチ財団 (YZ には BE-1913 年)、テキサス州の研究所、アメリカの癌協会 (YZ に RSG-16-215-01 TBE) がん予防 (YH、まで RR140053RP170660 YZ) には、アメリカ心臓協会 (YH まで 16IRG27250155)、ジョン s. ダン財団共同研究賞プログラム。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11668027 | |
| Rapamycin | Sigma-Aldrich | 37094 | |
| Paraformaldehyde, 16% Solution | VWR | 100503-916 | |
| Triton X-100 | Amresco | 0694-1L | |
| Hydrochloric Acid | Amresco | 0369-500ML | |
| Albumin, Bovine | Amresco | 0332-100G | |
| Tween 20 | Amresco | 0777-1L | |
| 5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) antibody (pAb) | Active Motif | 39769 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
| 4,6-Diamidino-2-phenylindolde (DAPI) | Biotium | 40043 | |
| SVAC1E SHEL LAB Economy Vacuum Oven, 0.6 Cu.Ft. (17 L) | SHEL LAB | SVAC1E | |
| UltraPure SSC, 20X | Thermo Fisher Scientific | 15557036 | |
| Bio-Dot Apparatus | BIO-RAD | 1706545 | |
| Anti-5-methylcytosine (5mC) Antibody, clone 33D3 | Millipore | MABE146 | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7076S | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7074S | |
| West-Q Pico Dura ECL Solution | Gendepot | W3653-100 |
References
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