哺乳類細胞化学誘導型 DNA hydroxymethylation およびエピジェネティックな改造のために設計された分割型 TET2 酵素 (サイダー) を導入するための詳細なプロトコルが表示されます。
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方法論記事
化学誘導型 DNA Hydroxymethylation およびエピジェネティックな改造のために設計された分割型 TET2 酵素
この記事について
サマリー
要約
DNA メチル化は、哺乳類のゲノムの安定性と遺伝性のエピジェネティックな修飾と細胞機能を制御する遺伝子発現の調節に関与しています。DNA のメチル化や DNA 脱メチル化の逆転は、dioxygenases の 10-11 転流 (テト) 蛋白質家族によって媒介されます。異常な DNA のメチル化および脱メチル化、発育障害や癌に関連付けられて広く報告されたが、どのようにこれらのエピジェネティックな変化に直接貢献遺伝子発現や疾患の進行の後の変化正確に定義された時間的・空間的解像度でゲノムの DNA の変更を削除追加する信頼性の高いツールの不足が主原因、不明のまま。このハードルを克服するためには、5-メチルシトシン (5mC) の酸化反応の時間的制御と化学物質を追加するだけで哺乳類細胞におけるエピジェネティックな状態のそれに続く改造する分割型 TET2 酵素を設計されています。ここで、哺乳類細胞との 5-ヒドロキシメチルシトシン (5hmC) の化学誘導生産の定量化に設計された分割型 TET2 酵素に基づく化学誘導性エピゲノム改造ツール (サイダー) を導入するための方法を説明します。免疫染色、フローサイトメトリーやドット ・ ブロット分析。遺伝コードを変更することがなくセルラー システムを尋問でだけでなく、epigenotype−phenotype の関係を様々 な生物系の調査に、この化学誘導性エピゲノムの改造ツールは広い使用を見つけます。
概要
DNA のメチル化は大抵 5-メチルシトシン (5mC) を形成するシトシンの炭素 5 位置へメチル グループの付加を指し、DNA メチルのトランスフェラーゼ (種) によって触媒されます。5mC は、しばしば信号転写抑制、x 染色体不活性化とトランスポゾンのサイレンシング1哺乳類のゲノムの主要なエピジェネティックなマークとして機能します。DNA のメチル化の逆転は、10 エルフ転座 (テト) 蛋白質家族によって媒介されます。テト酵素は鉄 (II) に属する、2-オキソグルタル酸依存 dioxygenases 5-ヒドロキシメチルシトシン (5hmC)、5 formylcytosine (5 fC) および 5-carboxycytosine (5caC) 5mC の連続的な酸化を触媒します。テトを介した 5mC 酸化は、哺乳類のゲノム上のエピジェネティックな制御の追加層を課しています。テトの発見は、TET タンパク質の生物学的機能とその主要な触媒製品 5hmC を発表するエピジェネティックな分野に強い関心を呼んでいます。5hmC はテトを介したアクティブな DNA 脱メチル化2,3,4中の中間だけではないが、安定したエピジェネティックな行為が5
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プロトコル
1. 細胞培養、プラスミド トランスフェクションと化学的誘導
- 文化、付着性のセル (例えば、ヒト胚の腎臓 HEK293T 細胞) の行ダルベッコ変法イーグル培地 (DMEM) 10% 熱不活化牛胎児血清、100 U/mL ペニシリンとストレプトマイシン 5% CO2と 37 ° C で補われます。
- サイダーのプラスミドを持つセルを transfect します。
- トランスフェクション前に少なくとも 18 h、につき適切な DMEM の 2.5 mL の種子 0.3 x 106セル 6 ウェル プレートでよく、60-80% の confluency に到達する 37 ° C は一晩でセルを孵化させなさい。
- 事前のトランスフェクション試薬を使用する前に室温を暖めます。
- 生殖不能の管に無血清培地の場所 250 μ L。
注: この金額が 80% の confluency に 6 ウェル プレートに合わせて調整されます。必要な場合、板や細胞数のサイズによると培地量は比例的に調整します。 - サイダー18または TET2 の触媒ドメイン エンコード プラスミドの 2.5 μ g を追加 (肯定的な制御として TET2CD)12,....
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結果
化学誘導 5mC-5hmC 変換は、単一細胞レベルや流れフローサイトメトリー解析 (mCherry 陽性) 細胞集団により定量ドット ・ ブロット法図 1に示すように免疫染色によって検証できます。TET2、または TET2CD の触媒ドメインは、研究を通して肯定的な制御として使用されました。5hmC とクロマチンのアクセシビリティの参照 18 20 ラパマイシンによる変化のゲノム マッピングに関する詳細についてを参照してください。
図 1: HEK293T 細胞における誘導型 DNA hydroxymethylation のサイダーを介した。分割に基づく化学誘導性エピゲノム (サイダー) を改.......
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ディスカッション
ここで我々 は DNA hydroxymethylation の時間的制御を達成するために設計された分割型 TET2 酵素の使用を説明しています。5 methycytosine ジオキシゲナーゼのテト家族の発見、多くの研究を行った TET タンパク質とその主要な触媒製品 5hmC1,2,の3、生体の機能を解読するには 4,5,6,7,8,9,10,<.......
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開示事項
著者は競合する金銭的な利益を宣言しません。
謝辞
我々 は金融に感謝健康の国民の協会からのサポートを許可 (YZ に R01GM112003)、ウェルチ財団 (YZ には BE-1913 年)、テキサス州の研究所、アメリカの癌協会 (YZ に RSG-16-215-01 TBE) がん予防 (YH、まで RR140053RP170660 YZ) には、アメリカ心臓協会 (YH まで 16IRG27250155)、ジョン s. ダン財団共同研究賞プログラム。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| リポフェクタミン 2000 トランスフェクション試薬 | サーモフィッシャーサイエンティフィ | サイエン | |
| ラパマイシン | Sigma-Aldrich | 37094 | |
| パラホルムアルデヒド、16% 溶液 | VWR | 100503-916 | |
| Triton X-100 | Amresco | 0694-1L | |
| 塩酸 | Amresco | 0369-500ML | |
| アルブミン、ウシ | Amresco | 0332-100G | |
| Tween 20 | Amresco | 0777-1L | |
| 5-ヒドロキシメチルシトシン (5-hmC) 抗体 (pAb) | 活性モチーフ | 39769 | |
| ヤギ抗ウサギ IgG (H+L) 交差吸着二次抗体、アレクサフルオ 488 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | A-11008 | |
| 4,6-ジアミジノ-2-フェニルインドールド (DAPI) | ビオチウム | 40043 | |
| SVAC1E SHEL LABエコノミー真空オーブン、0.6 Cu.Ft.(17リットル) | SHEL LAB | SVAC1E | |
| UltraPure SSC, 20X | Thermo Fisher Scientific | 15557036 | |
| Bio-Dot Apparatus | BIO-RAD | 1706545 | |
| Anti-5-methylcytosine (5mC) Antibody, clone 33D3 | Millipore | MABE146 | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7076S | |
| Anti-rabbit IgG,HRP結合抗体 | 細胞シグナル技術 | 7074S | |
| West-Q Pico Dura ECL Solution | Gendepot | W3653-100 |
参考文献
- Li, E., Zhang, Y. DNA methylation in mammals. Cold Spring Harbor Perspectv Biol. 6 (5), a019133(2014).
- Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324 (5929), ....
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再版と許可
