Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

En konstruerad Split-TET2 enzym för kemisk-inducerbara DNA Hydroxymethylation och epigenetiska Remodeling

Published: December 18, 2017 doi: 10.3791/56858
Automatic Translation
1, 2, 1
1Centre for Epigenetics and Disease Prevention, Department of Molecular and Cellular Medicine, Institute of Biosciences and Technology, College of Medicine, Texas A&M University, 2Centre for Translational Cancer Research, Department of Medical Physiology, Institute of Biosciences and Technology, College of Medicine, Texas A&M University

Summary

Detaljerade protokoll för att införa ett bakåtkompilerade split-TET2 enzym (CiDER) i däggdjursceller för kemiska inducerbara DNA hydroxymethylation och epigenetiska remodeling presenteras.

Abstract

DNA-metylering är en stabil och ärftlig epigenetisk modifiering i däggdjur genomet och är involverad i reglering av genuttryck för att styra cellulära funktioner. Återföring av DNA metylering eller DNA demetylering, medieras av tio-elva translokation (TET) proteinfamiljen av dioxygenases. Även om det allmänt rapporterats att avvikande DNA-metylering och demetylering är associerade med defekter och cancer, hur dessa epigenetiska förändringar direkt bidra till den efterföljande förändringen i genen uttryck eller sjukdom progression oklar, till stor del på grund av bristen på tillförlitliga verktyg noggrant lägga eller ta bort ändringar av DNA i genomet definierade temporal och spatial upplösning. För att övervinna detta hinder, utformade vi en split-TET2 enzym att aktivera temporal kontroll av 5-metylcytosin (5mC) oxidation och efterföljande remodeling av epigenetiska staterna i däggdjursceller genom att lägga till kemikalier. Här, beskriver vi metoder för att introducera en kemisk-inducerbara epigenomet remodeling verktyg (CiDER), baserat på ett enzym som bakåtkompilerade split-TET2, i däggdjursceller och kvantifiera kemiska inducerbara produktionen av 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) med immunfärgning, flödescytometri eller en dot-blot-analys. Denna kemikalie-inducerbara epigenomet remodeling verktyg hittar brett bruk i förhör cellulära system utan att ändra den genetiska koden, liksom i sondera de epigenotype−phenotype förbindelserna i olika biologiska system.

Introduction

DNA-metylering, mestadels avser tillägg av en metylgrupp till cytosin kol 5 position att bilda 5-metylcytosin (5mC), är katalyseras av DNA metyl-transferaser (DNMTs). 5mC fungerar som en större epigenetiska mark i däggdjur genomet som ofta signalerar för transkriptionell repression, x-kromosom inaktivering och transposon ljuddämpning1. Återföring av DNA metylering medieras av familjen tio-elven translokation (TET) protein. TET enzymer tillhör järn (II) och 2-oxoglutarate beroende dioxygenases som katalyserar successiva oxidation av 5mC till 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) och 5-carboxycytosine (5caC). TET-medierad 5mC oxidation innebär ett extra lager av epigenetisk kontroll över däggdjur genomet. Upptäckten av TET har väckt intensiv intresse i fältet epigenetiska till avtäcka de biologiska funktionerna av TET proteiner och deras stora katalytisk produkt 5hmC. 5hmC är inte bara en intermediär under TET-medierad aktiv DNA demetylering2,3,4, men också fungerar som en stabil epigenetiska Markera5,6,7,8 . Även om DNA hydroxymethylation är starkt korrelerade med genuttryck och avvikande är förändringar i DNA hydroxymethylation förknippade med vissa mänskliga störningar9,10,11, orsakssambanden mellan epigenetiska förändringar på DNA och fenotyperna förblir ofta utmanande upprättas, som delvis kan hänföras till avsaknaden av tillförlitliga verktyg för att exakt lägga till eller ta bort DNA ändringar i genomet på definierade tidsmässiga och rumsliga upplösning.

Här rapporterar vi användningen av en kemikalie-inducerbara epigenomet remodeling verktyg (CiDER) att övervinna hindret inför studier av kausala relationer mellan DNA hydroxymethylation och gen transkription. Designen är baserad på antagandet att den katalytiska domänen av TET2 (TET2CD) kan delas in i två inaktiva fragment när uttryckt i däggdjursceller och dess enzymatiska funktion kan återställas genom en kemiskt inducerbara dimerization helhetssyn ( Figur 1A). För att upprätta ett split-TET2CD system, som vi valt ut sex platser i TET2CD, består av en Cys-rika region och ett dubbelsträngat β-helix (DSBH) veck, på grundval av en rapporterade kristallstruktur av TET2-DNA complex som saknar en låg komplexitet regionen12. En syntetisk gen som kodar för rapamycin-inducerbara dimerization modul FK506 bindande protein 12 (FKBP12) och FKBP rapamycin bindande domän (FRB) däggdjur målet på rapamycin14,15, tillsammans med en egen proteinspjälkande peptid T2A polypeptid sekvens16,17, infogades individuellt i de valda split-områdena inom TET2CD. Valet av TET2 till vårt tekniska mål bygger på följande överväganden. Första, somatiska mutationer i TET2 med samtidig minskning av DNA hydroxymethylation observeras ofta i mänskliga sjukdomar inklusive myeloiska sjukdomar och cancer10, som ger användbar information om känsliga platser bör undvikas för insättningspunkten. För det andra är en stor del av den TET2 katalytiska domänen, särskilt regionen låg komplexitet, dispensable för enzymatiska funktion12, vilket gör det möjligt för oss att farkoster en minimerad split-TET2 för inducerbara epigenetiska förändringar. Efter screening över 15 konstruktioner, var en konstruktion som uppvisade högsta rapamycin-inducerbara restaurering av dess enzymaktivitet i däggdjur systemet valt och som CiDER18. Vi beskriver häri användningen av mCherry-märkta CiDER att uppnå inducerbara DNA hydroxymethylation och epigenetiska remodeling med rapamycin, och presenterar tre metoder för att validera CiDER-medierad 5hmC produktion i cellulära modellsystem HEK293T.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. cell kultur, Plasmid Transfection och kemiska induktion

  1. Kultur en fastsittande cell linje (t.ex. den mänskliga embryonala njuren HEK293T cell) i Dulbeccos modifierade örnens medium (DMEM), kompletterad med 10% Värmeinaktiverade fetalt bovint serum, 100 U/mL penicillin och streptomycin vid 37 ° C med 5% CO2.
  2. Transfect celler med CiDER Plasmiden.
    1. Minst 18 h innan transfection, utsäde 0,3 x 106 celler i 2,5 mL lämplig DMEM per väl i en 6-well platta och inkubera cellerna vid 37 ° C under natten att nå 60-80% konfluens.
    2. Pre varma transfection reagens till rumstemperatur före användning.
    3. Plats 250 µL serumfritt medium i ett sterilt rör.
      Obs: Detta belopp är skräddarsydd för en 6-well platta med 80% konfluens. Proportionellt justera medium beloppen enligt storlekarna av plattor eller cell nummer vid behov.
    4. Lägga till 2,5 µg av Plasmiden kodning CiDER18 eller den katalytiska domänen av TET2 (TET2CD som positiv kontroll)12,13 till serumfritt medium och försiktigt blanda genom pipettering.
    5. Tillsätt 7,5 µL transfection reagens i utspädda DNA blandningen och blanda försiktigt genom pipettering.
    6. Inkubera blandningen i rumstemperatur i 20-30 min.
    7. Ändra pre värmde media och lägga till blandningen drop-wise i brunnarna och skaka försiktigt cell kultur plattan för att jämnt fördela av transfection reagens och DNA blandningen.
    8. Inkubera cellerna och blandningen över natten och sedan ersätta transfection reagens som innehåller media med 2ml färsk komplett DMEM.
  3. Kemiska induktion
    1. Utspädd 2 mM av rapamycin lager (upplöst i DMSO) till en koncentration av 20 µM i lämpligt komplett medium.
    2. Tillsätt 20 µL utspädda rapamycin transfekterade celler upprätthålls i 2 mL medium att nå en slutlig koncentration på 200 nM.
      Obs: Efter inkubation i 48 h, cellerna är redo för kvantifiering av 5hmC generation eller andra nedströms program. Om det behövs, kan induktion effektivitet övervakas genom att ta ut celler varje 3 h för ytterligare 5hmC kvantifiering som beskrivs nedan och visas i figur 1.
    3. För bättre kvantifiering av 5hmC induktion effektivitet separata utsäde brunnar för att övervaka celler var 3 timmar.

2. kvantifiering av Rapamycin-inducerad 5hmC produktion av immunfärgning

  1. 5hmC immunofluorescens färgning
    Obs: Lägg till tillräckliga mängder av de fixering lösning, som består av 4% paraformaldehyd, 0,2% tensid (såsom Triton x-100) i PBS med 3 N HCl, att täcka alla celler i plattan. Till exempel skulle 500 µL lösning vara tillräckligt för en brunn i en 6-bra platta. Utföra alla steg i rumstemperatur.
    1. För att fixa celler, lägga till 4% PARAFORMALDEHYD i PBS rapamycin-behandlade celler under 15 minuter vid omgivningstemperatur. För kontrollgruppen, Använd celler som uttrycker mCherry-CiDER utan rapamycin behandling. Inte agitera.
      Varning: PARAFORMALDEHYD är giftiga. Bär lämpligt skydd.
    2. Kassera fixativ lösning. Inkubera fast celler med 0,2% tensid i PBS för 30 min till permeabilize cellmembran.
    3. Kassera permeabilisering lösning. Lägg 3 N HCl till permeabilized celler och inkubera i 15 min att denaturera DNA.
    4. Kassera HCl. Lägg 100 mM Tris-HCl buffert (pH 8,0) till cellerna i 10 min för neutralisering av pH.
    5. Kassera all lösning. Tvätta cellerna noggrant med PBS för 3 - 5 gånger. Ta bort PBS grundligt.
      Obs: Lägga tillräckliga mängder av PBS för varje tvättningen. Exempelvis är 1 mL PBS tillräckligt för en 6-bra platta.
    6. Blockera celler genom att lägga till den blockerande buffertlösning bestående av 1% BSA och 0,05% tensid (såsom Tween 20) i PBS för 1 h med milda skakningar.
    7. Kassera den blockerande lösningen. Tillsätt den utspädda 5hmC antikroppen (1: 200) till cellerna och inkubera i 2 h i rumstemperatur eller över natten vid 4 ° C.
    8. Tvätta cellerna med PBS tre gånger under 15 minuter.
    9. Lägga till en utspädd fluorophore (FITC)-konjugerat sekundär antikropp (1: 200) till cellerna och inkubera i 1 h.
    10. Tvätta cellerna med PBS tre gånger i stor utsträckning för att ta bort kvarvarande antikroppar.
    11. Tillsätt 250 ng/mL 4', 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI) att färga kärnan i 5 min. ta bort färgningslösningen.
    12. Montera bild eller glasbotten kultur skålen med immunostained celler för confocal imaging. Representativa resultat visades i figur 1B.
  2. Flödescytometri
    Obs: Använd en 96-väl rund bottenplatta för den följande färgningsproceduren. Vanligtvis räcker 150 µL av reagenser för varje brunn.
    1. Återsuspendera transfekterade och rapamycin-inducerad celler i FACS buffert (PBS med 1% BSA, 2 mM EDTA). För kontrollgruppen, använda CiDER-uttryckande celler utan rapamycin behandling.
    2. Fixa och permeabilize celler som beskrivs i steg 2.1.
    3. Lägga till 2 N HCl celler att denaturera DNA i 10 min.
    4. Kassera HCl. neutralisera och blockera cellerna som beskrivs i steg 2.1.
    5. Lägga till en utspädd anti-5hmC antikropp (1: 200) i cellerna och inkubera i 1 h i rumstemperatur eller över natten vid 4 ° C.
    6. Tvätta cellerna med FACS buffert tre gånger. Ta bort FACS buffert grundligt.
    7. Lägga till en utspädd fluorophore (FITC)-konjugerat sekundär antikropp (1: 400) för fluorescens-aktiverad cell sortering (FACS) analys, och inkubera i 1 timme vid rumstemperatur.
    8. Tvätta cellerna med FACS buffert tre gånger.
    9. Proverna är redo för FACS analys. Representativa resultat visades i figur 1 c-D.

3. dot-blot analys att kvantifiera 5hmC och 5-metylcytosin (5mC) uppgår

  1. Isolera genomiskt DNA från transfekterade och rapamycin-inducerad celler med en kommersiell DNA extraktion kit. För kontrollgruppen, använda CiDER-transfekterade celler utan rapamycin behandling.
  2. Värm vakuum ugnen på 80 ° C och före blöt nitrocellulosa membran i dubbeldestillerat H2O och sedan i 6 x saltlösning-natriumcitrat (SSC) buffert i 10 min.
  3. Ladda 60 µL av lika mängder DNA (totalt 2 µg i TE buffert) till en PCR-plattan med 96 brunnar. Lägga till 30 µL av TE buffert (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) resten brunnarna.
  4. Gör dubbel seriespädningar vertikalt på plattan med 96 brunnar genom att överföra 30 µL lösning på rad 1 till samma kolumnpositionen på rad 2. Blanda igen och överföra 30 µL lösning till brunnarna i de efterföljande rad tills når gränsen.
Ta bort den senast 30 µL.
  • Tillsätt 20 µL av 1 M NaOH och 10 mM EDTA i varje brunn, försegla på plattan och värm blandningen i 10 min vid 95 ° C att fullständigt denaturera DNA duplex.
  • Omedelbart kylas ner proverna på is och tillsätt 50 µL iskall 2 M ammoniumacetat (pH 7,0) och inkubera på is i 10 min.
    Obs: Steg 3,7-3.10 innebär användning av vakuum.
  • Montera dot blot apparaten med pre dränkta membran och ta bort kvarvarande buffert med fullt vakuum.
  • Tvätta membranet genom att lägga 200 µL TE buffert till varje brunn av dot blot apparater. Slå på vakuum bort TE buffert.
  • Ladda denaturerade DNA (förberedd i föregående steg 3.1-3.6) till varje brunn av dot blot apparater. Slå på vakuum för att ta bort lösningen.
  • Tvätta membranet genom att lägga till 200 µL 2 x SSC och ta bort restlösningar helt med hjälp av vakuum.
  • Ta isär dot blot apparaten, ta ut membranet och skölj hela membranet med 20 mL 2 x SSC.
  • Lufttorka membranet i 20 min.
  • Grädda membranet vid 80 ° C under vakuum för 2 h.
  • Tillsätt den blockerande lösningen (5% lättmjölk i TBST) till membranet och inkubera i 1 h i rumstemperatur.
  • Kassera den blockerande lösningen. Lägga till en utspädd 5hmC (1:5, 000) eller 5mC (1:1, 000) antikroppar mot membranet och inkubera över natten vid 4 ° C.
  • Tvätta membranet med TBST tre gånger under 10 minuter att ta bort kvarvarande antikroppar. Ta bort TBST grundligt.
  • Lägga till en sekundär HRP-konjugerad antikropp (1:10, 000 för anti-kanin HRP(5hmC) eller 1:3,000 för antimus HRP(5mC)) till membranet och inkubera i 1 timme vid rumstemperatur.
  • Tvätta membranet med TBST tre gånger i 10 min.
  • Lägg till ECL western blotting substrat till membranet för visualisering av 5hmC signaler med chemiluminescence detektor. Representativa resultat visades i figur 1E.

    • Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Kemisk inducerbara 5mC-till-5hmC omvandling kan verifieras av immunfärgning på enskild cell nivå, flödescytometri Flödesanalys på transfekterade (mCherry-positiv) cellpopulationer eller en mer kvantitativ dot-blot-analys som illustreras i figur 1. Den katalytiska domänen av TET2, eller TET2CD, användes under hela studien som positiv kontroll. Se referenser 18-20 för ytterligare information om genome-wide mappningen av rapamycin-inducerade förändringar i 5hmC och kromatin tillgänglighet.

    Figure 1
    Figur 1: CiDER-medierad inducerbara DNA hydroxymethylation i HEK293T celler. (A) utformning av en kemikalie-inducerbara epigenomet remodeling (CiDER) verktyg baserat på en split TET2 enzym. (B) representant immunfärgning resulterar i HEK293T celler som uttrycker CiDER-mCherry innan (övre panelen) och efter (nedre panelen) rapamycin behandling (200 nM). Green, 5hmC, röd, CiDER-mCherry, blå, DAPI färgning av atomkärnor. Skalstapeln = 10 µm. (C), kvantifiering av CiDER-medierad 5hmC produktion av flödescytometri Flödesanalys. HEK293T celler transfekterade med CiDER-mCherry av TET2CD-mCherry (som positiv kontroll) var målat med en anti-5hmc primär antikropp och en FITC-märkt sekundär antikropp. Endast TET2 (mCherry) och 5hmC (FITC) dubbel-positiva celler var gated och anges. (D) tidsförloppet för kemiska inducerbara produktion av 5hmC i HEK293T celler som uttrycker CiDER efter administrering eller tillbakadragande av rapamycin (200 nM). n = 5, data visas som medelvärde ± S.D. (E) Dot-blot analys att kvantifiera rapamycin-inducerbara förändringar i 5hmC nivåer i HEK293T celler. HEK293T celler var transfekterade med antingen en CiDER eller TET2CD konstruktion. En syntetisk oligonukleotiden med en känd mängd 5hmC användes som en positiv kontroll (översta raden). Kontrollen lastning visualiseras av etylen blå färgning av totala mängder ingående DNA visades i den nedre panelen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Här har vi illustrerat användningen av en konstruerad split-TET2 enzym att uppnå temporal kontroll av DNA hydroxymethylation. Efter upptäckten av TET familj av 5-methycytosine dioxygenas, många studier för att dechiffrera biologiska funktioner TET proteiner och deras stora katalytisk produkt 5hmC1,2,3, 4,5,6,7,8,9,10,11. Tidsmässiga och exakt kontroll över DNA ändringar i genomet fortsätter dock att vara en krävande utmaning för fältet. Vår CiDER är en av de få system som utnyttjar en konstruerad DNA modifiera enzymet för att fylla denna tekniska lucka. Protokollet beskrivs häri är främst anpassad för cellulära modellsystem, såsom den mänskliga embryonala njuren (HEK) 293T och HeLa cell linjer. Rapamycin koncentrationer och behandlingstiden kan behöva justeras för att uppnå optimal prestanda i olika celltyper. För att ta reda på den bästa 5hmC induktiv tidpunkten, rekommenderas en tid kursen experiment, som vi beskrivit i avsnitt 1.3.3, starkt. Immunofluorescens färgning av 5hmC i transfekterade celler kan användas som den bekvämaste avläsningen. För en mer kvantitativ analys, en dot-blot-analys rekommenderas men det kan ta mer mödosamma förfaranden. För dot-blot analyser, måste beloppen för ingående DNA optimeras för olika celltyper. En noggrann titrering experiment med hjälp av 2-faldig seriell utspädning med varierande DNA lastning belopp rekommenderas starkt.

    CiDER systemet kan användas i stort sett att dissekera korrelationen mellan DNA hydroxymethylation och fenotypiska förändringar i olika biologiska system. Nedan listas exemplariskt nedströms tillämpningar eller frågor som kan lösas med CiDER-systemet.

    Hur påverkar TET-medierad 5mC oxidation DNA metylering landskapet i olika cellulära modellsystem? Detta kan nu lätt åtgärdas genom att jämföra DNA methylome och hydroxymethylome före och efter rapamycin behandling. Hur påverkar DNA hydroxymethylation kromatin tillgänglighet och Histon ändringar? En jämförelse av ATAC-seq och ChIP-Seq resulterar i samma cell före och efter administrering av rapamycin kommer att berätta svaret. Eftersom TET proteiner har en suppressiv roll i vissa typer av cancer, det ska bli intressant att testa hur kemiska inducerbara restaurering av TET protein och 5hmC produktion kommer att inkräkta på tumörtillväxt. Tanke på rollen av TET/5hmC i stamcellers differentiering, återstår det för att vara beslutsamma hur temporally kontrollerad 5hmC produktion i en definierad övergående skede kommer att påverka härstamning specifikation av stamceller under utveckling.

    I sin nuvarande konfiguration, kan CiDER systemet endast globalt inducera 5mc-till-5hmC omvandling. Idealiskt, CiDER kan vara smält med en katalytiskt-inaktiva Cas9 eller dess orthologues, som möjliggör loci-specifika inriktning och inducerbara DNA metylering redigering i genomet. Sådana exakta kemiska-inducerbara epigenomet remodeling verktyg kan i stor utsträckning för att otvetydigt probe epigenotype-fenotyp förbindelserna i däggdjur utan att ändra den genetiska koden.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Författarna förklarar inget konkurrerande finansiella intressen.

    Acknowledgments

    Vi tackar det finansiella stöd från National Institutes of Health bevilja (R01GM112003 till YZ), Stiftelsen Welch (BE-1913 till YZ), American Cancer Society (RSG-16-215-01 TBE till YZ), förebyggande av Cancer och Research Institute of Texas (RR140053 till YH, RP170660 till YZ), den American Heart associationen (16IRG27250155 till YH), och John S. Dunn stiftelse Collaborative Research Award Program.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific 11668027
    Rapamycin Sigma-Aldrich 37094
    Paraformaldehyde, 16% Solution VWR 100503-916
    Triton X-100 Amresco 0694-1L
    Hydrochloric Acid Amresco 0369-500ML
    Albumin, Bovine Amresco 0332-100G
    Tween 20 Amresco 0777-1L
    5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) antibody (pAb) Active Motif 39769
    Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-11008
    4,6-Diamidino-2-phenylindolde (DAPI) Biotium 40043
    SVAC1E SHEL LAB Economy Vacuum Oven, 0.6 Cu.Ft. (17 L) SHEL LAB SVAC1E
    UltraPure SSC, 20X Thermo Fisher Scientific 15557036
    Bio-Dot Apparatus BIO-RAD 1706545
    Anti-5-methylcytosine (5mC) Antibody, clone 33D3 Millipore MABE146
    Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7076S
    Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7074S
    West-Q Pico Dura ECL Solution Gendepot W3653-100

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Li, E., Zhang, Y. DNA methylation in mammals. Cold Spring Harbor Perspectv Biol. 6 (5), a019133 (2014).
    2. Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324 (5929), 930-935 (2009).
    3. He, Y. F., et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science. 333 (6047), 1303-1307 (2011).
    4. Ito, S., et al. Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine. Science. 333 (6047), 1300-1303 (2011).
    5. Spruijt, C. G., et al. Dynamic readers for 5-(hydroxy)methylcytosine and its oxidized derivatives. Cell. 152 (5), 1146-1159 (2013).
    6. Lio, C. W., et al. Tet2 and Tet3 cooperate with B-lineage transcription factors to regulate DNA modification and chromatin accessibility. eLife. 5, e18290 (2016).
    7. Kellinger, M. W., et al. 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine reduce the rate and substrate specificity of RNA polymerase II transcription. Nat Struct Mol Biol. 19 (8), 831-833 (2012).
    8. Su, M., et al. 5-Formylcytosine Could Be a Semipermanent Base in Specific Genome Sites. Angew Chem Int Ed Engl. 55 (39), 11797-11800 (2016).
    9. Ko, M., et al. Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2. Nature. 468 (7325), 839-843 (2010).
    10. Huang, Y., Rao, A. Connections between TET proteins and aberrant DNA modification in cancer. Trends Genet. 30 (10), 464-474 (2014).
    11. Lu, X., Zhao, B. S., He, C. TET family proteins: oxidation activity, interacting molecules, and functions in diseases. Chem Rev. 115 (6), 2225-2239 (2015).
    12. Hu, L., et al. Crystal structure of TET2-DNA complex: insight into TET-mediated 5mC oxidation. Cell. 155 (7), 1545-1555 (2013).
    13. Hashimoto, H., et al. Structure of a Naegleria Tet-like dioxygenase in complex with 5-methylcytosine DNA. Nature. 506 (7488), 391-395 (2014).
    14. Banaszynski, L. A., Liu, C. W., Wandless, T. J. J. Characterization of the FKBP.rapamycin.FRB ternary complex. J Am Chem Soc. 127 (13), 4715-4721 (2005).
    15. Clackson, T., et al. Redesigning an FKBP-ligand interface to generate chemical dimerizers with novel specificity. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (18), 10437-10442 (1998).
    16. Ibrahimi, A., et al. Highly efficient multicistronic lentiviral vectors with peptide 2A sequences. Hum Gene Ther. 20 (8), 845-860 (2009).
    17. Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PLoS One. 6 (4), e18556 (2011).
    18. Lee, M., et al. Engineered Split-TET2 Enzyme for Inducible Epigenetic Remodeling. J Am Chem Soc. 139 (13), 4659-4662 (2017).
    19. Huang, Y., Pastor, W. A., Zepeda-Martínez, J. A., Rao, A. The anti-CMS technique for genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine. Nat Protoc. 7 (10), 1897-1908 (2012).
    20. Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide. Curr Protoc Mol Biol. 109 (21.29), 1-9 (2015).

    Tags

    Kemi fråga 130 DNA-metylering epigenetik kromatin tillgänglighet DNA demetylering kemisk biologi TET2 5-hydroxymethylcytosine transkription genuttryck epigenomet redigering
    En konstruerad Split-TET2 enzym för kemisk-inducerbara DNA Hydroxymethylation och epigenetiska Remodeling
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Lee, M., Zhou, Y., Huang, Y. An… More

    Lee, M., Zhou, Y., Huang, Y. An Engineered Split-TET2 Enzyme for Chemical-inducible DNA Hydroxymethylation and Epigenetic Remodeling. J. Vis. Exp. (130), e56858, doi:10.3791/56858 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter