本方案描述了如何使用一种 体外 分离的龟头制备用于测量其眼球运动的运动学。在从颅骨中移除脑组织后，可通过电流刺激颅神经，以量化眼球的旋转及瞳孔大小的变化。
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本文内容
摘要
摘要
动物被安乐死后，其组织会开始死亡。龟类具有优势，因为其组织存活时间更长，尤其是与恒温脊椎动物相比。因此，可以在龟类上进行较长时间的体外（in vitro）实验，以研究神经信号及其对靶向行为的控制。我们采用离体头部制备方法，测量了龟类眼球运动的运动学特征，以及由脑神经传递的电信号对这些运动的调节作用。在将脑组织从颅骨中移除而保留脑神经完整的前提下，将解剖后的头部置于万向支架中，以校准眼球运动。将玻璃电极连接至脑神经（动眼神经、滑车神经和外展神经），并通过电流刺激诱发眼球运动。我们使用红外视频追踪系统监测眼球运动，并量化眼球的旋转角度。采用不同幅度、频率和脉冲串持续时间的电流脉冲，观察其对反应的影响。由于该制备方法已将头部与脑部分离，因此可单独研究支配肌肉靶点的传出通路，从而在排除中枢处理的感觉信息干扰的情况下，探究神经信号传递机制。
引言
使用红耳滑龟进行电生理实验的原理：
红耳滑龟（Trachemys scripta elegans）被认为是全球最具危害性的入侵物种之一1，其出现可指示生态系统可能已出现问题。红耳滑龟之所以如此成功，其原因尚不完全清楚，但部分可能归因于其耐受性强的生理特性，以及拥有可在缺氧条件下存活的神经组织2,3,4。利用该物种进行实验不会威胁其种群数量，且只需较少操作，电生理制备样本即可维持较长时间的活性，最长可达18小时5,6。这一优势类似于使用无脊椎动物（如螯虾）7进行实验的好处，后者同样具备耐受低氧环境的能力8。
眼动测量技术：
利用非人灵长类动物测量前视性动物眼动的方法已得到充分发展9。眼睛在眼眶内围绕三个轴旋转：水平轴、垂直轴和扭转轴。磁搜索线圈法通常被认为是最可靠的旋转测量....
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方案
注意：红耳滑龟（包括雄性和雌性）均购自供应商。龟类饲养于温暖的动物房内，房内设有两个60加仑的水箱，配备砖砌晒台，并在250瓦红外灯下供其晒背。环境维持14小时光照/10小时黑暗的光周期，水温保持在22 °C。灯光于早上6:00开启，晚上8:00关闭。水箱配备过滤系统，每周清洁一次，龟类每隔一天自由进食（ad libitum）。红耳滑龟的饲养管理及本文所述所有实验操作32,33均经拉法耶特学院机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准。
1. 仪器设置
- 配制龟林格氏液。按以下顺序将下列成分加入蒸馏水中：氯化钠 96.5 mM（58.44 g/mol）、氯化钾 2.6 mM（74.56 g/mol）、氯化镁 2.0 mM（203.31 g/mol）、碳酸氢钠 31.5 mM（84.01 g/mol）、葡萄糖 20.0 mM（180.16 g/mol），用浓盐酸调节 pH 至 7.51，最后加入氯化钙 4.0 mM（110.98 g/mol）（见材料表）。每加入一种盐时均需搅拌溶液。
警告：浓盐酸具有危险性（对皮肤、眼睛、吸入和摄入均有危害）。 - 使用长度为 5 cm 的毛细玻璃管（见材料表）制作吸电极尖端，通过火焰抛光制成....
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结果
图1 显示了描述解剖过程的视频截图。这些图像提供了在从脑部切断之前神经的典型位置。
图1：从解剖视频中截取的图像静帧，显示视神经（nII）、动眼神经（nIII）、滑车神经（nIV）和外展神经（nVI）的位置。（A）去除脑膜后脑部各标记区域的图像。白色比例尺 = 10 mm。（B）显示nII、nIII和nIV在中脑右侧连接位置的图像（去除嗅球和大脑后）。（C）显示n.......
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讨论
关键步骤：
本方案中的关键步骤如下：1）解剖过程以及采取措施保持横断神经的活性；2）使用吸电极匹配颅神经的尺寸，以获得一致的反应；3）将头部放置于万向支架中，以充分校准眼球的旋转。
问题排查：
解剖操作可能具有挑战性，但经过数次练习后，操作步骤应会变得相对简单直接。如果神经表现出无反应，最可能的原因是解剖失败。在移除脑组织时，切割神经过程中应尽量减少对其施加的牵拉和压力。应尽可能避免使用金属手术器械接触神经；若问题持续存在，可改用玻璃钩和塑料镊子替代金属工具34。尽管龟类组织能够耐受不同水平的氧气，但仍建议使用新配制并以95/5% O2/CO2气体饱和且已冷却的龟氏任氏液；不过这一点相对不那么关键。毕竟，使用该实验制备物的优势在于其在不同氧浓度和温度波动条件下均具有良好的存活能力2,3
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢Paulette McKenna女士和Lisa Pezzino在本研究中提供的行政支持，感谢Phil Auerbach先生提供的技术支持。作者还感谢Michael Ariel博士和Michael S. Jones博士（圣路易斯大学医学院）向我们介绍了体外分离头体制备方法。in vitro。本合作研究得到了拉法耶特学院生物学系（Robert S. Chase基金）、学术研究委员会以及神经科学项目的资助。最后，本工作谨献给Phil Auerbach先生，他于2016年9月28日逝世；他曾退役一台扫描电子显微镜，并认识到其五轴样品台在本实验方案中的应用价值。他的友谊与创造力将令人深切怀念。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 红耳滑龟 | Kons Scientific | Trachemys scripta elegans | 体型较大（甲壳长度 15–20 cm） |
| 氯化钠 | Sigma-Aldrich 公司有限责任公司 | S5886 | |
| 氯化钾 | Sigma-Aldrich 公司有限责任公司 | P5405 | |
| 氯化镁 | Sigma-Aldrich 公司有限责任公司 | M7304 | |
| 碳酸氢钠 | Sigma-Aldrich 公司有限责任公司 | S5761 | |
| 葡萄糖 | Sigma-Aldrich 公司有限责任公司 | C5767 | |
| 浓盐酸 | Sigma-Aldrich 公司有限责任公司 | H7020 | |
| 氯化钙 | Sigma-Aldrich 公司有限责任公司 | C7902 | |
| pH计 | 奥克顿 | pH 6+ | |
| 负压刺激电极 | A-M Systems | 573000 | 双极吸引电极。注意 573000 已被 573050 取代。 |
| 毛细玻璃管 | A-M 系统 | 626000 | 无内丝单通道硼硅酸盐毛细管玻璃，长10 cm，外径1.0 mm，内径0.50 mm |
| 替代性负压刺激电极 | A-M Systems | 573050 | 双极吸电极。需要较大直径的毛细玻璃管：627000，外径1.2 mm，内径0.68 mm |
| 体视显微镜 | Lieca | GZ7 | 放大倍数范围，10倍 – 70x |
| 光纤光源 | Amscope | HL250-A | 150W 光纤光学显微镜照明光源箱 |
| 咬骨钳 | 卡罗来纳生物供应公司 | 625654 | 不锈钢，直弹簧，5.25" |
| 钝性解剖探针 | 卡罗来纳生物供应公司 | 627405 | Huber 鞘管探针，双头探针和定位器，6" |
| 显微剪刀 | Carolina Biological Supply Company | 623555 | 虹膜显微解剖剪，不锈钢，0.5" 刀片，4.75" 长 |
| 精细镊子 | Sigma-Aldrich 公司有限责任公司 | F6521 | 珠宝镊，Dumont No. 5，inox合金，4.25" |
| 弯头镊子 | Sigma-Aldrich 公司有限责任公司 | Z168696 | 中号尖头弯镊，不锈钢，4" |
| 手术刀柄 | Sigma-Aldrich 公司有限责任公司 | S2896 | 手术刀柄，3号，不锈钢 |
| 手术刀片 | Sigma-Aldrich 公司有限责任公司 | S2771 | 11号手术刀片，钢制 |
| 断头台 | 哈佛仪器公司 | 73-1918 | 小型剪刀式切片器，型号 7575 |
| 刮勺 | Sigma | Z648299 | 微型药匙和刮勺称量套装。使用小型刮勺：5.9” 长 x 0.07” 直径为0.17的方形端手柄” ×1.3” 长，另一端圆形：0.17” × 1.27” 长 |
| 钩 | 自动区 | 98069 | SureBilt 挂钩和探针套装。使用磨床将挂钩的尖锐端磨钝，以防止对动物口腔造成伤害。 |
| 95/5% O2/CO2 | Airgas, Inc. | X02OX95C2003102 | 5% 二氧化碳余量为氧气的认证标准气体混合物，200 型气瓶，CGA-296 接头 |
| 调节因子 | Airgas公司 | Y11244D296-AG | 单级黄铜0-100 psi分析气瓶减压器，CGA-296接口，带针型出口。使用黄铜可调空气管道阀，从3/8英寸 переход"，内径，连接至调节器的3/16英寸乙烯基输气管"，内径，通向气石或玻璃巴斯德吸管的气路连接。 |
| 可调式通气管道阀门 | 福斯特与史密斯医生 | CD-12061 | 黄铜阀门 |
| 刚性台面 | 未知 | 未知 | 将高压灭菌锅门平放在坚固的桌面上。九个 5" 直径网球使桌面顶部表面与振动隔离。 |
| 5" 网球 | Petco 动物用品公司 | 712868 | Petco 超大宠物网球：球体未切开，固定于灭菌器门下方的集成框架内。 |
| 替代式振动隔离台 | Newport Corporation | INT1-36-6-N | 刚性振动控制系统，完整性1：表面尺寸，3英尺 x 6英尺 |
| 万向节 | ISI，International Scientific Instruments, Inc. | SUPER III-A 扫描电子显微镜载物台 | 五轴同心样品台：X、Y 和 Z 轴线性移动， ±20 毫米，0.1 毫米精度；旋转，垂直方向 ±10°和水平的 ±12.5°，含1.25° 精确度。注意：来自已停用的仪器。 |
| 万向节夹头 | 未知 | 未知 | 将一个来源不明的旧切片机的标本夹改装，以适配扫描电镜载物台的样品杆 |
| 替代云台 | ThorLabs, Inc. | GN2/M 与 MBT602/M | 双轴测角仪（GN2/M）安装在带拇指旋钮调节器的三轴微调平台（MBT602/M）上：设计一个卡盘以固定龟头，使眼睛位于测角仪顶面以上12.7 mm处（至旋转点的距离） |
| 基于视频的眼动追踪系统 | Arrington Research, Inc. | ViewPoint 眼动仪，PC-60 | 追踪方法：基于暗瞳法的红外视频；黑白相机（货号 BC02）：30 Hz，640 × 480；系统要求：Windows 2000、XP、7、8、8.1、10；可视范围：水平 ±44°°；垂直方向 ±20°；准确度约 0.5°；空间分辨率约0.15°瞳孔尺寸分辨率约0.03 mm；眼动数据：注视点X、Y坐标，瞳孔高度和宽度，眼动扭转角，时间增量，总时间，以及感兴趣区域（ROI）；实时通信（项目0022）：4通道模拟输出，配备八个TTL输入通道，用于在数据文件中标记代码 |
| 多位置磁性底座 | Harbor Freight Tools | 匹兹堡，货号 #5645 | 磁力架最高可达12" 可产生45磅的磁性拉力，用于固定相机位置。在杆的末端加工有机螺纹孔，用于安装相机。 |
| 显微操作仪 | Kopf | 900 | 用于吸电极安装的五轴操控：X、Y、Z 三轴线性移动，双轴旋转 |
| 吊臂上的解剖显微镜 | Lieca | GZ6 | 放大倍数范围，6.7倍 – 40x |
| 神经/肌肉刺激器 | Astro-Med Grass Telefactor | Grass S88 | 双脉冲电压刺激器：具有两个输出通道，可独立运行或同步操作，以产生非隔离的恒定电压脉冲（10 mV 至 150 V）。脉冲可为单次（10 μ秒至10秒）、重复性（0.01 Hz至1 kHz）和脉冲串（1毫秒至10秒）模式，并可与TTL输入和输出同步。通过DB25连接器的输出通道将TTL信号发送至ViewPoint眼动仪的TTL输入通道。注意：Astro-Med Grass Telefactor公司已停止营业。 |
| 当前分离装置 | Astro-Med Grass Telefactor | PSIU6 | 当前刺激隔离单元：可实现S88向标本安全输送恒定电流。PSIU6通过BNC电缆连接至S88的一个输出通道。PSIU6上的倍率开关使S88能够产生范围从0.1起的多种电流强度 µA 至 15 mA。 |
| 带隔离功能的替代性神经/肌肉刺激器 | A-M Systems | 2100 | 独立脉冲刺激器：该设备内置隔离器，可产生恒定电流。 |
参考文献
- Kikillus, K. H., Hare, K. M., Hartley, S. Minimizing false-negatives when predicting the potential distribution of an invasive species: A bioclimatic envelope for the red-eared slider at global and regional scales. Anim Conserv. 13, 5-15 (2010).
- Lutz, P. L., Rosenthal, M., Sick, T. J. Living without oxygen: turtle brain as a model of anaerobic metabolism. Mol Physiol. 8, 411-42....
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