Summary
Aquí describimos un protocolo simple para producir rápidamente cientos de agar medios de crecimiento nematodos, placas 96 pocillos con un número constante de Caenorhhabditis elegans por pozo. Estas culturas son útiles para la detección fenotípica de organismos enteros. Nos centramos aquí en el uso de estas culturas a los productos químicos de la pantalla para efectos de Pro-longevidad.
Abstract
Caenorhabditis elegans es un organismo útil para pruebas de efectos químicos en la fisiología. Pantallas de molécula pequeña de todo organismo ofrecen ventajas significativas para identificar estructuras químicas biológicamente activas que pueden modificar los fenotipos complejos como la vida útil. Se describe aquí es un protocolo simple para producir cientos de placas de cultivo de 96 pozos con un número bastante consistente de C. elegans en cada pozo. A continuación, especificamos cómo utilizar estas culturas a pantalla miles de sustancias químicas de efectos sobre la vida del nematodo C. elegans. Este protocolo hace uso de cepas estériles sensibles de temperatura, las condiciones de la placa de agar y sencillo manejo para facilitar la producción de rápido y alto rendimiento de las culturas animales sincronizadas para la detección de animales.
Introduction
Aquí se describe un protocolo que fue desarrollado para el cribado de alto rendimiento de compuestos químicos para efectos sobre la vida útil de los elegans de Caenorhabditis . El protocolo sí mismo es fácilmente adaptable a otras pantallas fenotípicas, incluyendo estudios utilizando las cepas de C. elegans de reportero. Este protocolo fue utilizado con éxito para identificar un compuesto biológicamente activo novela, NP1 (nitrofenil-piperazina 1), que extiende fuertemente la vida de C. elegans a través de un mecanismo de restricción dietética. NP1 y una caracterización de su efecto sobre la vida, incluyendo una descripción de las vías genéticas en el juego, fue previamente descrito en otra parte1. Ese informe también incluye una descripción de los resultados de una implementación a gran escala de la pantalla. Aquí describimos con mucho más detalle la metodología y la configuración de la pantalla, que es escalable para ambas aplicaciones de pequeña y gran escala.
El objetivo que llevó a la creación del protocolo descrito aquí era desarrollar una plataforma de cultura de C. elegans que permitió la rápida proyección de grandes librerías de química de nuevos compuestos biológicamente activos. Mientras pantallas de química se han realizado antes del desarrollo de este protocolo, estos fueron principalmente en pequeña escala o tipo de candidato acerca a2,3. De hecho, la mayoría de las pantallas realizadas en el laboratorio en decenas de compuestos utilizados ensayos de resistencia de tensión, con golpes de ser evaluados para la longevidad efectos4. Este estudio buscó en cambio directamente la pantalla para efectos de la vida. Sorprendentemente, hubo pocas descripciones en la literatura científica a la hora de realizar pantallas químicas a gran escala con C. elegans. De hecho, en comparación con otros tipos de pantallas5,6,7, proyección química a gran escala con C. elegans parece ser subempleados.
Había dos descripciones de pantallas químicas a gran escala en C. elegans que fueron usados como base para desarrollar este enfoque. La primera de ellas fue un elegante estudio de laboratorio de Peter Roy utilizando pantallas químicas para identificar compuestos que podrían perturbar el desarrollo de los animales. El estudio siguió entonces con una pantalla de mutagénesis hacia delante para identificar los objetivos genéticos de estos productos químicos8. El protocolo descrito en este estudio utiliza patés de 24 pocillos, que era simplemente inviable para las necesidades específicas de este estudio (una cantidad limitada de producto químico en la biblioteca y espacio de incubadora disponible limitado). El otro estudio fue innovador y ambiciosa molécula pequeña pantalla de Michael Petrascheck vida útil extendiendo productos químicos9,10. Ese estudio utilizó placas de 384 pocillos y culturas líquidas. La otra característica principal de esta pantalla fue el uso de FUDR (5-fluorodeoxyuridine) para inhibir químicamente la producción de progenie. Después de la consideración considerable del protocolo descrito en este estudio, se evitaron culturas líquidas de C. elegans y esterilización química.
Aunque FUDR es ampliamente utilizado en experimentos de vida de C. elegans , había preocupaciones que FUDR puede causar interacciones entre drogas no previstos, o FUDR sí puede tener algún efecto en la vida. Recientemente esta última preocupación ha sido validada, al menos en algunas concentraciones y, en particular en 25 ° C11. Para evitar el problema de la contaminación de la progenie, se utilizó C. elegans cepa TJ1060, que alberga dos mutaciones sensibles de temperatura independiente (spe-9 (hc88) I; rrf-3(b26)II) que suprimen la producción de espermatozoides y se han demostrado para ser útil culturas masivas de poblaciones sincrónica12. Esta cepa fue totalmente estéril a 25 ° C, pero produce progenie cuando cultivadas en 15-20 ° C. Este estudio utiliza las condiciones de cultivo convencional, con gusanos arrastrándose sobre la superficie del agar, como resultados obtenidos con cultivos líquidos no siempre son reproducibles con placas convencionales. Mientras que este fenómeno no se entiende completamente, se ha demostrado que gusanos cultivan en líquido responden a DR (restricción dietética) de manera diferente que los gusanos cultivados en medios estándar13,14. Por lo tanto es plausible que medios líquidos podrían enmascarar algunos miméticos de DR que de lo contrario se identificaría con la pantalla.
Habiéndose establecido en las condiciones de cultivo de agar, se consideraron diferentes opciones para que el rendimiento de los pozos en este ensayo. Mientras que varios ensayos basados automatizados o imágenes estaban disponibles, exigía adquisición y despliegue de técnicamente difícil dispositivos, la mayoría de los cuales era prohibitivamente cara. Mientras que teniendo en cuenta estas opciones, es esencial referirse a pantallas anteriores de la vida útil de todo tipo. En última instancia, este estudio utilizó un método de puntuación adaptado de pantalla de ARNi de Siu Sylvia Lee Lab genoma entero de fenotipos de vida15. Específicamente, se establecieron todas las placas de la vida útil de la misma manera, pero sólo los controles negativos fueron monitoreados. Una vez que las placas control negativo fueron confirmadas para tener cerca de mortalidad total, las placas de prueba fueron anotadas a mano. En esta pantalla a gran escala, positivos fueron confirmados por nueva prueba con productos químicos recién preparadas, con triplicado las repeticiones de los primarios positivos.
Protocol
1. preparación de tampones
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Caldo LB
- Seguir protocolo del fabricante para la preparación y utilizar gránulos pre-mixed (véase Tabla de materiales).
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Crecimiento de nematodos Media (NGM) Agar
- La mezcla 23 g de agar, 3 g de NaCl, 2.5 g de bacto peptona y agua desionizada a 0.972 L. Autoclave y dejar enfriar a 60 ° C, luego añadir 25 mL de tampón de fosfato (KPO4) de potasio de 1 M (pH 6.0), 1 mL de 1 M del sulfato de magnesio (MgSO4) , 1 mL de 1 M de cloruro de calcio (CaCl2) y 1 mL de colesterol 5 mg/mL (en etanol).
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Solución de hipoclorito
- Mezclar 5 mL de 5 M de KOH, 4 mL de solución de hipoclorito de sodio (6%) y desionizada de H2O hasta un volumen total de 50 mL.
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S basal
- Mezclar 5 g de NaCl, 1 g de K2HPO4, 6 g de KH2PO4y agua desionizado 1 L, entonces el autoclave.
2. preparación de concentrado de e. coli (OP50)
Nota: Este paso concentra 1 L de una solución saturada de e. coli en 25 mL de tampón básico S.
- Inocular 5 mL de caldo LB esterilizado (paso 1.1) con una sola Colonia de e. coli (cepa OP50) e incubar durante 4-6 h a 37 ° C con agitación (250 rpm). Usar 0,1 mL de esta solución para inocular 1 L de LB en un matraz de Erlenmeyer de 2 L. Incube los frascos 1 litro toda la noche (12-16 h) a 37 ° C con agitación (250 rpm).
- Centrifugue las culturas noche 1 L en botellas de 500 mL centrifugar 5 min a 10.000 x g y 4 ° C las bacterias de la pelotilla y decantar los residuos lejos de medios. Resuspender el precipitado en 25 mL de S Basal (paso 1.4). Almacenar a 4 ° C.
3. preparación de placas NGM
- Para la cultura de masas las placas utilizadas para producir grandes cantidades de gusanos, dispensar 30 mL de agar NGM fundido (60 ° C) (paso 1.2) en un gabinete en placas 10 cm con un aparato dispensador líquido automatizado o una pipeta serológica de flujo laminar. Permita que seque durante la noche.
- Pipeta 2 mL de concentrado OP50 en cada placa de 10 cm, extendido para cubrir completamente la superficie del agar inclinando y girando la placa, entonces permita que las placas se sequen. Almacenar las placas a 4 ° C hasta por 2 semanas.
- Ensayo cultura placas de alto rendimiento utilizadas para la detección, utilizan un dispensador de 8 canales automáticos para dispensar 0,15 mL de agar fundido de NGM en cada pocillo de una placa bien 96 en un gabinete de flujo laminar. Tenga cuidado de hacer pozos que están desprovistos de burbujas, como estas permitirán madrigueras de gusanos que comprometen el ensayo en que bien. Permita que seque durante la noche. Almacenar las placas a 4 ° C hasta por 2 semanas.
4. elaboración de temperatura sensible (ts) estériles C. Elegans culturas masivas
- Para comenzar culturas, mediante un 'gusano pick' (tomar una pipeta de vidrio con un hilo de platino conectado o un gusano fabricado) bajo un microscopio de disección, transferencia 20 huevos (cepa TJ1060: spe-9 (hc88) I; rrf-3(b26)II) en la cultura de masas placa preparada en el paso 3.1. Luego, incubar las placas a 20 ° C durante 6 días (permite más de una generación de crecimiento, como usted está apuntando para la colección de la progenie de los 20 huevos movidos).
- Confirmar visualmente la presencia de adultos grávidos (huevos presentes en el útero) con un microscopio de disección. Recoger a los adultos grávidos por 2-3 mL de S basal sobre la placa con una pipeta de vidrio de dispensación. Agitar el líquido alrededor de la placa con la mano, y luego recoger el líquido en un tubo de 15 mL con una pipeta de vidrio.
- Desactivación del tubo (1.000 x g durante 1,5 minutos a 20 ° C) de la pelotilla de gusanos, luego aspirar el sobrenadante. Añadir 10 mL de solución de hipoclorito (paso 1.3) a la pelotilla de gusano y agite rápidamente el tubo con la mano en una dirección de arriba a abajo por 5 s. Incubar durante 5 minutos, agitando cada 2,5 minutos.
- Otra vez, giro del tubo (1.000 x g durante 1,5 min.); el pellet debe ser de color marrón amarillento. Aspirar apagado el sobrenadante. Añadir 10 mL de solución de hipoclorito a la pelotilla de huevo y agite vigorosamente el tubo. Incubar 1-3 min, con agitación ocasional y manteniéndose en apariencia con el microscopio de disección. Confirmar visualmente sólo huevos son restantes y proceden al siguiente paso.
- Girar hacia abajo el tubo (1.000 x g durante 1,5 min) y aspirar el sobrenadante. El sedimento debe ser blanco con ninguna coloración marrón.
Nota: Después de la eliminación de la solución de hipoclorito, es fundamental utilizar técnicas estériles y almacenadores intermediarios, desde la contaminación (bacterias y hongos, en particular) pueden arruinar el experimento, perdiendo valioso tiempo y reactivos. Este estudio utilizó un gabinete de flujo laminar filtrado y mover líquidos utilizando pipetas estériles y consejos. - Abrir los tubos en un espacio estéril. Lavar el sedimento 3 veces con S basal, girar hacia abajo (1.000 x g durante 1,5 min) y a aspirar el sobrenadante cada vez. Vuelva a suspender el sedimento de huevo en 2-3 mL S basal. Estos huevos pueden utilizarse ahora para una noche Portilla en búfer para recoger la larva L1 (paso 5).
5. incubación de huevos de C. Elegans en tampón para obtener cultivos sincrónicos (preparación de larvas L1 C. Elegans )
- Decantar el huevo pellets y tampón en un plato de petri de vidrio estéril con tapa. Enjuagar los huevos restantes del tubo en un plato con una pipeta serológica de 2-3 mL de S basal. Añadir 5 mL de S basal para facilitar la aglomeración, como esto puede animar a eclosión, como se sacude (20 rpm con un agitador orbital de bailarín de vientre). Incubar durante una noche a 20 ° C, para dar tiempo de huevos a la portilla (16-24 h). Arrestan a todas sus crías en la 1° etapa larval (L1) debido a la ausencia de alimentos.
Nota: La evidencia anecdótica indica que recién preparadas de la L1 (16-36 h después de la recolección de huevos) generan las poblaciones más sincrónicas de gusanos adultos. - Recoger L1s en un tubo de 15 mL con una pipeta serológica. Desactivación de L1s en una centrifugadora (1.000 x g durante 1,5 minutos), a aspirar el sobrenadante y repita hasta que L1s todos han sido recopilados de incubar las placas, dejando 10 mL de S basales para el paso siguiente.
- Del tubo que contiene L1s, micropipeta fuera 0,01 mL (inmediatamente después de la mezcla) y dispensar en un no sembradas (no e. coli) placa de NGM. Contar el número de L1s en la placa. Repita 10 veces y obtener un promedio para el número de L1s en cada alícuota. Por lo general, esperar entre 1-3 L1s por μl (cuando a partir de 1 placa de la cultura de masas que contengan 20 huevos).
- Determinar con una pipeta serológica el volumen de S basal sosteniendo el L1s. Luego extrapolar con el número de lombrices por 0,01 mL, obtenido en el paso anterior, para estimar el número total de L1s promedio determinado. Por lo general, se esperan entre 10.000-30.000 L1s (por placa de la cultura de masas que contengan 20 huevos).
- Para utilizar esta cultura en ensayo de 96 pocillos, diluir la suspensión L1 1 L1 por μL en un frasco estéril media redonda y, a continuación, vaya al paso 7. Si esta cultura debe ser utilizado para generar adicional C. elegans culturas de masas, entonces vaya al paso 6.
6. gran escala cultura síncrono preparación
Nota: Soluciones de L1 se pueden utilizar para aumentar rápidamente las poblaciones de gusano.
- Para generar números de gusano grande con una solución de L1, dispensar L1s hasta 5.000 en cada uno de la cantidad deseada de las placas de la cultura de masas. Recoger a adultos grávidos 2,5 días (20 ° C) como se describe en los pasos 4.1-2 y continúe con el paso 4.3 para recoger los huevos.
- Como se ha observado de manera anecdótica que repite colección hipoclorito puede destacar la población subyugada, dividir las poblaciones por recoger huevos de propagación antes de sujetar a la población a los tratamientos de hipoclorito, así múltiples generaciones de la población no son repetidamente sometidas a tratamiento de solución de hipoclorito.
7. configuración de placas de 96 pocillos de ensayo
- Permiten que las placas de ensayo (preparadas en el paso 3.3) se alcance la temperatura ambiente. Luego, en un gabinete de flujo laminar, añadir 5 μl del concentrado OP50 (preparado en el paso 2.2) a cada pocillo. Como antes, utilizar un dispensador de 8 canales automatizados.
- Añadir 10 μl de suspensión de L1 a cada pocillo utilizando un dispensador de 8 canales automatizados. Esto producirá en gusanos promedio 10 por pozo, ya que están presentes en la suspensión en 1 L1 por μl. Para promover la distribución equitativa de L1s de la mezcla, dispensar L1s de una botella redonda medios activamente mezclada con un moderado lentamente dando vuelta barra de agitación.
- Placa con tapa, lotes de caja de placas e incubar a 25 ° C durante 2 días.
8. tratamiento 1 st día adulto de C. elegans con productos químicos
- Biblioteca química saque del congelador y permiten las placas a temperatura ambiente antes de proceder.
Nota: Las placas de la biblioteca química según lo descrito aquí son 96 placas de pozos que contienen compuestos discretos en cada pozo, los cuales están en la misma concentración y disuelven en DMSO. Estas bibliotecas no utiliza las columnas exteriores, y por lo tanto cada placa tiene un máximo de 80 distintos productos químicos. En el protocolo descrito aquí, la concentración de la biblioteca es 10 mM. Es importante tener en cuenta efectos disolventes sobre los fenotipos. Mientras que este estudio pantallas en una concentración de 0.5% de DMSO, este nivel nunca fue superado en estos ensayos de vida útil y en ensayos de rendimiento bajo, donde es más probable que elija a una concentración de la solución stock compuesto. Este protocolo no excede 0.25%, que es un nivel en que modificaciones de vida útil no ocurren16, al menos en la tensión de N2. - Agitar suavemente la placa a 60 rpm en un agitador de microplacas durante 1 min inmediatamente antes del uso.
- Utilizando un automatizado 96 pocillos líquido controlador, transferencia 0,75 μl de compuesto (o DMSO) de la placa de la biblioteca a la placa de ensayo. La profundidad de la pipeta durante la entrega de líquido en la placa de ensayo es controlada cuidadosamente, tal que las puntas de la pipeta del líquido controlador de entrega el volumen de 0,75 μl a los ~ 15 μl de líquido en la superficie del agar (con gusanos y OP50 concentrado de pasos 7.1 -2) y no perforar la superficie del agar en el pozo. No utilice pipetas multicanal de 8 o 12 manual excepto en pantallas muy pequeñas (< 10 placas), como puede aumentar el error y a menudo resultado en la perforación de la superficie del agar, que compromete el análisis.
- Preparar platos para control negativo biblioteca química con DMSO (dimetil sulfóxido), suponiendo que la biblioteca está probada utiliza DMSO como solvente. Hacer 1 placa de control negativo para cada 5 placas hasta 10 placas de control negativo de la prueba. Si es posible, también hacer una placa de control positivo (NP11 a 20 mM, para una concentración de ensayo final de 0,1 mM, es efectivo para ello; véase la sección resultados de representante). No agregue productos químicos (prueba o control) a las 2 columnas exteriores de las placas, ya que son particularmente susceptibles a la desecación.
9. secado de las culturas
- Para quitar el líquido de la superficie del agar, seque las placas en el flujo laminar, gabinete para 4-8 h. Es fundamental que estas placas se secan completamente, pero no ser desecadas. Algunas placas tardará más en secar que los demás, vigilando de cerca todas las placas y eliminar tan pronto como ellos estén secos. Confirmar por inspección visual cuidadosa de los pozos individuales de la placa de secado.
Nota: Dependiendo de factores que incluyen la tasa de escape de la caja, el tiempo que esto toma debe ser empíricamente determinado. Este paso de secado puede tomar aproximadamente 4-8 h para un gabinete completo. - Sellar las placas con la película transparente, luego poner en las tapas de la placa.
- Girar las placas de 96 pocillos de ensayo 45 s a 1.000 x g.
- Almacenar las placas invertidas a 25 ° C.
10. anotar las culturas C. Elegans para la longevidad
- Seguimiento de las placas control negativo hasta > 95% de mortalidad se observa. Verifique placas semanalmente durante las primeras dos semanas y todos los días después de eso. Caenorhabditis cohortes de la misma cepa y especie pueden mostrar vida significativamente diferente en el ensayo17.
Nota: Para el ensayo de vida útil que se describe aquí, con los animales de TJ1060 cultivados en 25 ° C, 95% de mortalidad en estas poblaciones se ha producido de adulto día 16-20. - Cuando se consideran pozos de control negativo de haber llegado al > 95% marca, girar por todas las placas de 96 pocillos de ensayo 45 s en una centrífuga de mesa con una microplaca adaptado rotor (250 x g durante 45 s a 20 ° C).
- Anotar todos los pocillos de las placas de control. Esto se hace contando y registrando el número de animales vivos y muertos en cada pocillo. Gusanos muertos pueden diferenciarse de gusanos vivos por su falta completa de movimiento. Provocan movimiento en vivo gusanos mediante el uso de la placa de la pozo 96 de aproximadamente 7 cm sobre la superficie de microscopio de disección mientras se mira por el ocular para cualquier respuesta evocada. Gusanos muertos no responderá y cercanos compañeros de laboratorio no pueden apreciar el ruido repetitivo.
- Para las placas de prueba, contar y grabar sólo los pozos que contienen gusanos vivos. Cuando se observa un gusano vivo, contar todos los animales vivos y muertos que bien, junto con la posición bien y placa.
Nota: A menudo es útil volver a anotar las placas después de > 99% de los gusanos control negativo están muerto. En las pantallas de gran escala, esto puede ser el mejor punto para hacer el marcador inicial. En cualquier caso, puntuación/re-score como se describió anteriormente
11. volver a probar compuestos
- Cuando se prueba sólo un pequeño número de compuestos candidatos (< 320 compuestos), como con una prueba o una pantalla de candidato (ver resultados representativos), restringir el análisis a los 32 pozos central en un esfuerzo por minimizar los efectos posibles de la placa. Esto deja los 2 pozos más cercano al borde de la placa sin tratar pero todavía que contiene agar, alimentos y gusanos.
Representative Results
Empezaremos por examinar resultados representativos de emplear este protocolo para ensayos de vida útil de 96 pocillos. En el primer ejemplo, se utilizó el método a con éxito de la pantalla a través de 30.000 productos químicos para identificar químicos que extienden la vida de C. elegans y también incluyen los resultados de la pantalla de seguimiento Verifique nuevamente de los mejores productos químicos mediante la mismo protocolo. Estos resultados fueron descritos previamente1. El segundo ejemplo utiliza el mismo protocolo en una pantalla de menor escala de compuestos de candidato.
Pantalla en grande y volver a probar: La pantalla en grande 30.000 compuestos de prueba fue realizada en una sola dosis, por duplicado. Cada producto químico, por tanto, se probó en dos pozos con una población animal total esperada de 20. Para lograr esto, se revisaron tres conjuntos discretos de 10.000 compuestos (en duplicado) durante un período de 3 meses para cubrir el enteros 30.000 compuestos. Esto fue hecho en parte, para asegurar una cantidad manejable de puntuación manual al final de la prueba y requiere un total de 260 de las placas de 96 pocillos de ensayo en cada uno de los conjuntos. En chapa biblioteca, sólo 80 pozos contienen compuesto; una repetición de 10.000 compuestos hace 125 placas de ensayo. Este estudio utilizó 2 repeticiones con 10 placas de control negativo en cada juego. Para aumentar el rendimiento, las placas fueron marcadas cuando se evaluaron poblaciones de control negativo haber experimentado ~ 99% de mortalidad. Toda prueba pozos entonces examinaron gusanos vivos.
Productos químicos en pozos con un gusano vivo fueron llamados hits. Productos químicos en los pozos que contienen más de 1 gusano vivo fueron también llamados hits y además todos los gusanos en los pozos (vivos y muertos) fueron contados generar un puntaje simple (partitura de vivo por ciento; el número de gusanos vivos dividido por el número de gusanos muertos). Cada producto químico en la biblioteca podría por lo tanto ser llamado un golpe dos veces y los golpes podrían, pero no, tienen puntajes asociados a ellos. 512 productos químicos distintos fueron llamados hits (al menos una vez) en la pantalla de 30.000 compuestos. La pantalla fue realizada con la intención de identificar efectos de Pro-longevidad (reproducibles) potentes y robustos. Estas dos propiedades diferentes pueden tener distintos efectos. Potentes productos químicos podrían aumentar notablemente la vida útil, en cuyo caso se esperaría un alto porcentaje de gusanos a estar vivo en bien de ese producto químico. Productos químicos sólidos, dos repeticiones se espera tener los gusanos vivos. La lista de resultados se clasificó en base a estos criterios. 179 de los productos químicos rindió vivo porcentajes puntuaciones, o se vieron afectados en ambas muestras y por lo tanto fueron escogidos para volver a probar. La mayoría de los productos químicos restantes que se llama hits, pero no seleccionados para volver a probar, sólo contenía un solo gusano vivo en uno de los pozos de replicar.
Repetir el análisis de los golpes fue realizado, al igual que la pantalla primaria excepto con 3 repeticiones (población animal total esperado de 30) y cuidado de cuantificación de la duración de la vida de los animales en las placas de control sin tratar. Estos cambios se agregaron a la ayuda en la comparación de los pozos de prueba y de control. 179 de los éxitos de la química fueron reordenarse, diluido a 10 mM y se mudó en 96 placas bien. Sólo el internos 24 pozos fueron utilizados para el ensayo de prueba (versiones actuales de este protocolo habría utilizado los 32 pozos interiores tal como se describe en la sección de protocolo para las pantallas de prueba) y los compuestos fueron re-probados por triplicado con seis placas de ensayo de control negativo tratados con disolvente DMSO. Una placa de control negativo fue anotada periódicamente para la supervivencia total (figura 1A). Cuando aproximadamente el 95% de los animales de control estaban muerto, todas las placas fueron anotadas completamente (todos tratados vivir y gusanos muertos fueron contados).
Para llamar a golpes de los resultados de la prueba, se hizo un corte en la partitura de vivo por ciento promedio del control negativo + 2 desviaciones típicas (SD). Para los pozos de prueba, un promedio de % viva (en el momento de anotar) se calcularon los puntajes promediando la puntuación vivo por ciento de tres repeticiones para cada pozo. Para este análisis particular, calificaciones vivo por ciento promedio de pozos de control negativo se calcularon como el promedio de tres repeticiones para los 48 pozos (2 juegos de placas de control negativo por triplicado). La SD solía llamar hits del conjunto químico prueba fue que la SD en el control negativo 48 promedio porcentajes puntuaciones vivo. Usando esta estrategia, este estudio encontró 57 hits de la biblioteca de prueba compuestos 179, demostrando que un total de 32% de los productos químicos de prueba prueba positiva (figura 1B). Binning de las puntuaciones vivo por ciento promedio en los pozos de control y prueba negativa indica que los pozos de prueba superaron a los pocillos de control (figura 1C).
Pantalla de candidatos: Pantallas de pequeña escala pueden realizarse en una manera similar a la contra-prueba descrito anteriormente. Aquí, describimos los resultados de una pantalla de candidato con 139 compuestos. Estos candidatos se reunieron como estructuras capaces de promover la longevidad. Para esta pantalla, se realizaron 5 repeticiones de las placas de prueba a dos diferentes dosis (50 μm y 100 μm). Además, utilizamos 8 placas de control negativo, con una placa de solo control positivo (NP1) que contiene dos dosis diferentes; 50 μm y 100 μm.
Las placas control negativo fueron monitoreadas hasta ~ 90% de los animales estaban muerto. En aquel momento, wells fueron marcados por contar gusanos vivos y muertos en todos los pocillos de control y de prueba de pozos que contenían gusanos vivos. El porcentaje vivo en el momento de que se utilizaron para calcular puntuaciones vivo por ciento promedio para cada pozo. Para los controles negativos, 32 pozos tenían puntuaciones por ciento vivos de 8 repeticiones. Para los controles positivos, había 4 partituras bien un promedio a través de 4 repeticiones para cada dosis. Golpes fueron llamados para los pozos con una promedio por ciento vivo puntuación mayor que el promedio por ciento de control negativo vivo score + 2 SD Este corte 14 hits a la izquierda de la pantalla de candidato y excluye a todos los pocillos de control negativo. Ese atajo también incluyó todos del control positivo pozos tratados en 100 μm y 50% de los controles positivos trataron en 50 μm. Estos resultados se presentan aquí como desechado un promedio de puntuaciones vivo por ciento para los 50 μm (figura 2A) y las pantallas de prueba 100 μm (figura 2B).
Finalmente, todas las placas fueron nuevamente anotadas en un momento tardío, que correspondió a una época cuando más del 99% del control negativo animales estaban muertos. Los resultados indicaron que los pozos de control positivo lejos hacia fuera-realizaron los pozos de prueba y control negativo (figura 2C). Mientras que los pozos de prueba fueron un poco mejores que los controles negativos. Este último resultado está sesgado por la indicación de que muchos de los pozos de prueba parecen presentan toxicidad en relación con el tratamiento testigo (cuadro 1), confusión de tal modo esta interpretación simple. Esto era de esperarse, ya que la biblioteca de candidato era una verdadera pantalla de sustancias químicas con actividad biológica desconocida en C. elegans, mientras que la pantalla vuelva a probar era esencialmente preseleccionada para compuestos que no se tóxicos. Desde esta pantalla principal era para compuestos que alarga la vida útil, significativamente tóxicos si no en la prueba de volver a establecidos.
Figura 1 : Representante resulta de un alto rendimiento la pantalla y volver a probar
Curva de supervivencia (A) de una placa representativa control negativo utilizada en el ensayo de prueba. Esta curva fue construida de anotar todos los gusanos vivos y muertos en los 24 pozos utilizados en este ensayo 4 veces durante los 18 días del ensayo. En el día 18 de la edad adulta, se evaluaron los controles para que el ~ 5% de supervivencia y todos los test de control y las placas entonces fueron también anotó. (B) tabla resumiendo los resultados de la pantalla y vuelva a probar. Binning (C) de las puntuaciones vivo por ciento promediados de pozos para las condiciones de control y prueba de la pantalla de prueba. Para los controles, partituras son de 48 pozos cada uno que consiste en el promedio de 3 repeticiones. Resultados de la prueba son de 179 pozos cada uno que consiste en la puntuación promedio de tres repeticiones. Figura 1 se reproduce de una anterior publicación1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Representante resulta de una pantalla de candidato
Binning (A) de los resultados de la pantalla de candidato de 50 μm. Los resultados de prueba-bien 139 representan la partitura de vivo por ciento promedio de 5 repeticiones. Los resultados del control negativo 32 consisten en partituras de vivo por ciento promedio de 8 repeticiones. Los resultados del control positivo 4 consisten en partituras de vivo por ciento promedio de 4 repeticiones (total 16 pozos que contienen NP1 en 50 μm). Binning (B) de los resultados de la pantalla de candidato de 100 μm. Todo es la misma que en (A), excepto que los pozos de prueba y los controles positivos fueron tratados con concentraciones μm 100. En tanto (A y B) se muestran las mismas placas de control negativo. Representante de (C) el resultado de volver a anotar las placas en un momento relativamente extremos finales. Controles positivos dramáticamente superaron a todos los demás, si sólo representa el porcentaje de pozos con gusanos vivos en este momento, que está sesgada contra pozos de prueba como se describe en el texto principal y la tabla 1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Binning de partituras vivo por ciento promedio | ||||||
| Puntuaciones agrupadas | Todos muertos (0) | 1-10 | 11-20 | 21-30 | 31-40 | > 41 |
| Vuelva a probar | ||||||
| # de (-) Control | 16 | 31 | 1 | 0 | 0 | 0 |
| número de pozos de prueba (50 μm) | 46 | 69 | 50 | 8 | 3 | 3 |
| Pantalla de candidato | ||||||
| # de (-) Control | 0 | 11 | 21 | 0 | 0 | 0 |
| # (+) Control (50 μm) | 0 | 0 | 2 | 2 | 0 | 0 |
| # (+) Control (100μm) | 0 | 0 | 0 | 0 | 2 | 2 |
| número de pozos de prueba (50 μm) | 94 | 22 | 21 | 2 | 0 | 0 |
| número de pozos de prueba (100μm) | 86 | 25 | 21 | 6 | 1 | 0 |
Tabla 1: Resultados de la representante de binning diferentes pantallas
Aquí presentamos el binning de las partituras de vivamos por ciento promedio de las dos pantallas (prueba y candidato). En la pantalla de prueba, el pico es similar del control negativo con el re-pruebas superando el control negativo dramáticamente a la derecha (larga vida) lado de la mesa. Esto indica la presencia de múltiples Pro-longevidad compuestos presentes en el conjunto de prueba. En la pantalla de candidatos, vemos que el pico es en la categoría muerto todos, mientras que hay también una señal evidente del lado derecho de la tabla. Esto indica la presencia de compuestos Pro-longevidad en el conjunto de candidatos, pero también indica la presencia de toxicidad significativa entre el candidato conjunto de compuestos.
Discussion
Aquí hemos descrito un método simple para el cultivo de C. elegans en placas de 96 pocillos. Describimos estas culturas para el uso en química investigación y análisis de vida útil, pero puede utilizarse para muchos tipos de ensayos. Mientras que las condiciones de cultivo bien múltiples para la detección química han sido previamente reportados8, incluyendo análisis de vida útil10, el análisis aquí descrito difiere de varias maneras. El ensayo de vida descrito aquí utiliza placas de 96 pocillos, se basa en mutantes estériles (en lugar de esterilización química), utiliza las condiciones de cultivo de agar, utiliza líquido simple manipulación para mover gusanos y manualmente se anotó al final. Los diferentes enfoques utilizados en este ensayo pueden ser de ayuda a los investigadores en busca de métodos que incluyen estas condiciones de cribado.
Elementos cruciales en el presente Protocolo centran principalmente en la calidad de las placas para el ensayo. En primer lugar, al hacer las placas es imprescindible que la superficie del agar está libre de burbujas y otras imperfecciones. Estas variaciones en la superficie del agar casi siempre conducen a la madriguera y la pérdida del pozo. En segundo lugar, este protocolo se basa en secar líquidos depositados durante las etapas de configuración y drogando. Es fundamental que estos líquidos se eliminan totalmente, sino que el agar no ser desecado. Anecdóticamente, parece que gusanos en pozos que no están completamente secos (natación en líquido) viven más de pozos debidamente secas, mientras que exceso de secado de las placas conduce a la desecación y el agrietamiento del agar, que conduce al gusano madriguera y pérdida. Otro elemento fundamental de este protocolo es manteniendo condiciones de esterilidad. Como con cualquier análisis de la vida, hay mucho trabajo involucrado con la configuración de la placa, y existen muchas oportunidades y tiempo para arruinar contaminación para asentarse y crecer en las placas de ensayo.
Mientras que el ensayo de vida útil se describe aquí es útil para la detección de compuestos en C. elegans, se limita a fondos genéticos particulares, como se basa en una cepa estéril temperatura sensible (ts); Utilizamos TJ1060, que tiene penetrancia alta esterilidad. Esto restringe las cepas disponibles para la detección con este método. Enfoques alternativos incluyendo cruzar ts mutaciones estéril en el fondo deseado o el uso de esterilización química. No hemos intentado esterilización química con este ensayo, pero debería ser posible. Obstáculos potenciales incluyen poner el esterilizador en los gusanos en el momento correcto y en la dosis adecuada. El protocolo descrito aquí utiliza un dosificador de líquido que es rápido, pero no aparece para dispensar a adultos con eficacia. Así, estos gusanos se desarrollan en las placas y por lo tanto deben ser tratados con la esterilización química en las placas. Determinar la dosis óptima y el tiempo sería importantes para el éxito. Estrategias alternativas incluyen el uso de un método de distribución que puede mover a adultos. En el pasado, hemos encontrado que máquinas capaces de identificar y ordenar los adultos son generalmente mucho más lentas que los controladores líquidos simple, que pueden dispensar mezclas homogéneas de suspensión de la larva.
En general, nosotros usamos este método rápidamente de pantalla productos químicos y tratamientos para grandes efectos positivos en la vida. El método es particularmente eficaz cuando se utiliza con dosis múltiples, alta replicar número y cerrar monitoreo de controles negativos que se mantienen siempre e intercalados entre las placas de prueba. Controles positivos son también útiles al diseñar e implementar las pantallas descritas en este manuscrito. Sin embargo, para ser un positivo eficaz, el control tendría que ser bastante potente y muy robusta. Cuando originalmente se desplegó la pantalla, no se pudieron identificar un compuesto adecuadamente potente y robusto. Actualmente, hay muchos informes en la literatura de 'envejecimiento' de candidatos para los controles positivos útiles en las pantallas que se describen aquí. Como se describe en la sección de la pantalla de candidatos de la sección de resultados esperados de este manuscrito y en la figura 2 y tabla 1, el compuesto NP1 es un eficaz control positivo para esta pantalla. Generalmente se confirman resultados positivos de estas pantallas con ensayos de vida útil estándar en placas de 3 mm.
Disclosures
Los autores declaran que ninguna entidad financiación apoyar este trabajo tenía cualquier entrada en la recolección de datos, análisis de resultados o la decisión de publicar.
Acknowledgments
Agradecemos a Dipa Bhaumik, Aaron Miller y Bob Hughes para asistencia técnica. Las cepas fueron proporcionadas por la CGC, que es financiada por los NIH oficina de programas de infraestructura de investigación (P40 OD010440). Agradecemos a los bosques de Georgia y miembros de Lithgow, Kapahi y Melov Labs para discusiones útiles. M.L. fue apoyada por los institutos nacionales de salud (NIH) formación Grant T32 AG000266 y un Ellison Medical Foundation/American Federación de envejecimiento Post-Doctoral beca de investigación. Este trabajo fue financiado por una subvención de los laboratorios de BioAge, una subvención de Larry L. Hillblom Foundation, así como institutos nacionales de salud concede UL1024917, apoyar el consorcio de investigación interdisciplinaria en Geroscience y 1R01AG029631-01A1 a G.J.L.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB Broth Miller Granules | VWR | ||
| Unispense | Wheaton Science Products | automated fluid dispensing apparatus | |
| 96 well assay plate; COSTAR 3370 | Corning | ||
| Multidrop 384; automated 8 channel dispenser | Thermo Fisher Scientific | ||
| manufactored worm pick | Genesee Scientific | ||
| Belly Dancer Orbital Shaker | Stovall Life Science inc. | ||
| microplate shaker; MTS 2/4 Digital | IKA Works, inc. | ||
| automated 96-well liquid handler; Biomek FX Liquid Handler | Beckman Coulter | ||
| automated 96-well liquid handler; Bench Top Pipettor | Sorenson Bioscience, inc. | ||
| manual 8 or 12 multi-channel pipettes | we use rainin… | ||
| transparent 96 well film cover; TempPlate RT Optical Film | USA Scientific | ||
| table top centrifuge; Centrifuge 5810 R | Eppendorf |
References
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