Summary
Burada biz hızla nematodunun büyüme medya agar, yüzlerce Caenorhhabditis elegans tutarlı numaraları iyi başına 96-şey kültür plakaların üretimi için basit bir protokol tanımlamak. Bu kültürler tüm canlıların fenotipik tarama için yararlıdır. Yanlısı uzun ömürlü efektleri için ekran kimyasallara bu kültürler kullanarak üzerinde odaklanabilir.
Abstract
Caenorhabditis elegans fizyolojisi üzerinde kimyasal etkileri test etmek için yararlı bir organizmadır. Bütün organizma küçük molekül ekranlar ömrü gibi karmaşık fenotipleri değiştirebilirsiniz biyolojik olarak aktif kimyasal yapıları tanımlamak için önemli avantajlar sunuyor. Burada açıklanan yüzlerce C. elegans her iyi oldukça tutarlı numaraları ile birlikte 96-şey kültür plakaların üretimi için basit bir protokoldür. Daha sonra Yuvarlak solucanlar C. elegansömrü üzerinde etkileri için bu kültürler ekrana kimyasalların binlerce kullanmayı belirtilen. Bu iletişim kuralının yeteneklerinden sıcaklık duyarlı steril suşları, agar plaka koşullar ve basit hayvan eşitlenmiş hayvan kültürler tarama için hızlı ve yüksek üretilen iş üretimini kolaylaştırmak için işleme.
Introduction
Burada bir iletişim kuralı Caenorhabditis elegans ömrü üzerinde etkileri için kimyasal bileşikler yüksek aktarım tarama için geliştirilen açıklanmıştır. Protokolün kendisi gazeteci C. elegans suşları kullanan çalışmaları da dahil olmak üzere diğer fenotipik ekranlara kolayca uyarlanabilir. Bu iletişim kuralı başarıyla bir roman biyolojik olarak aktif bileşim, NP1 tanımlamak için kullanılmıştır (nitrophenyl-piperazin 1), C. elegans ömrü bir diyet kısıtlama mekanizması aracılığıyla güçlü genişleten. NP1 ve ömrü oynayan, genetik yolları için bir açıklama da dahil olmak üzere, üzerindeki etkisini bir karakterizasyonu oldu daha önce başka bir bölümünde1. Rapor Ayrıca ekranın büyük ölçekli bir uygulama sonuçlarından bir açıklaması vardır. Burada biz çok daha ayrıntılı olarak Metodolojisi ve Kur ekranın kendisi, hem küçük ve büyük ölçekli uygulamalar için ölçeklenebilir olduğu açıklanmaktadır.
Büyük kimyasal kitaplıkları roman biyolojik olarak aktif bileşikler için hızlı tarama için izin verilen bir C. elegans Kültür Platformu geliştirmek için burada açıklanan protokol yol açtı hedefi oldu. Kimyasal ekranlarında bu protokolü geliştirme önce gerçekleştirilmiş olsa da, bunlar özellikle küçük ölçekli / veya2,3aday türü yaklaşımlar. Nitekim, onlarca bileşikler üzerinde laboratuarında gerçekleştirilen ekranlarının en uzun ömürlü etkileri4için tarandı sayısı ile stres direnç deneyleri, kullanılmıştır. Bu çalışmada bunun yerine doğrudan ömrü etkileri için ekran istedi. Dikkat çekici, büyük ölçekli Kimyasal ekranlarında C. elegansile gerçekleştirme esnasında bilimsel literatürde birkaç açıklamaları vardı. Nitekim, ekranlar5,6,7, diğer türleri için karşılaştırıldığında, C. elegans kullanarak büyük ölçekli Kimyasal tarama altında istihdam olmak gibiydi.
Bu yaklaşım geliştirmek için bir temel olarak kullanılan büyük ölçekli Kimyasal ekranlarında C. elegans iki açıklamaları vardı. Bunlardan ilki Peter Roy'un laboratuvar hayvanları gelişimi huzursuz bileşikler tanımlamak için kimyasal ekranlarında kullanarak zarif bir çalışma yapıldı. Çalışma daha sonra bu kimyasallar8genetik hedeflerini tanımlamak için ileri mutagenesis ekran ile takip. Bu çalışmada açıklanan protokol 24-şey pates, hangi sadece kullanışsız bu çalışmanın belirli gereksinimler (sınırlı miktarda kimyasal Kütüphane ve sınırlı kullanılabilir kuluçka alanı) için kullanılır. Diğer çalışma Michael Petrascheck'ın yenilikçi ve hırslı küçük molekül ekran kimyasallar9,10uzanan ömrü için başvurdu. Bu çalışma 384-şey plakaları ve sıvı kültürleri kullanılır. Diğer önemli özelliği bu ekran, kimyasal olarak döl üretim etkisizleştirmek için FUDR (5-fluorodeoxyuridine) kullanmaktı. Bu çalışmada açıklanan protokol önemli dikkate sonra kimyasal sterilizasyon ve C. elegans sıvı kültürleri atlanma.
FUDR C. elegans ömrü deneylerde yaygın olarak kullanılmasına rağmen FUDR önceden tahmin edilemeyen ilaç etkileşimleri neden olabilir veya o FUDR ömrü üzerinde bir etkisi olabilir endişeler vardı. Son zamanlarda bu ikinci endişe, en azından bazı konsantrasyonlarda ve özellikle 25 ° C11doğrulandı. Döl kirlilik sorunu aşmak için C. elegans zorlanma TJ1060, hangi iki bağımsız sıcaklık duyarlı mutasyonlar limanlar kullanıldı (spe-9 (hc88) ben; sperm üretimini ortadan kaldırmaya ve yararlı olması için göstermiştir rrf-3(b26)II) zaman uyumlu nüfus12kitle kültürleri için. Bu zorlanma 25 ° C'de tamamen steril, ama ne zaman 15-20 ° C'de kültürlü döl üretecek Bu çalışmada agar, yüzeyinde sıvı kültürleri ile elde edilen sonuçlar her zaman geleneksel Ağar kaplamalar ile tekrarlanabilir değildir olarak tarama solucanlarla geleneksel kültür koşulları, kullanılan. Bu olay tamamen anlaşılmaktadır değil iken, solucanlar solucan standart medya13,14tarihinde kültürlü daha farklı bir şekilde Dr (diyet kısıtlaması) sıvı cevap kültürlü kanıtlanmıştır. Bu nedenle sıvı medya ile ekranın tanımlanması bazı DR mimetics maske makul 's.
Agar kültürü koşulları üzerinde yerleşmiş, bu tahlil wells performansını puanlama için farklı seçenekler kabul edildi. Çeşitli otomatik ya da görüntü tabanlı deneyleri mevcut iken, satın alma ve teknik cihazlar, en çok hangi prohibitively pahalıydı zorlu dağıtım gerektirdiği. Bu seçenekleri göz önünde iken, tüm türleri önceki ömrü ekranlara başvurmak için gerekliydi. Sonuçta, bu çalışma--dan Siu Sylvia Lee laboratuar tüm genom RNAi perde ömrü fenotipleri15için uyarlanmış bir skor yöntem kullanılır. Özellikle, tüm ömrü plakaları aynı şekilde ayarlanmış olan ama sadece negatif denetimleri takip. Bir kez negatif kontrol levha tam ölüm için teyit edildi, el ile test plakaları skorlanmıştır. Bu büyük ölçekli ekranda, pozitif yeniden kullanarak taze hazırlanmış kimyasallar ile test ederek nüsha birincil pozitif tekrarlar teyit edildi.
Protocol
1. hazırlanması arabellekleri
-
LB suyu
- Önceden karışık granül ( Malzeme tabloyabakın) kullanın ve hazırlık için üreticinin iletişim kuralı izler.
-
Nematot büyüme medya (NGM) Agar
- Mix 23 agar g, 3 g-in NaCl, bacto pepton 2.5 g ve 0.972 L. otoklav deiyonize su ve 60 ° c, let serin sonra 1 M Magnezyum sülfat (MgSO4) 1 mL 1 M potasyum fosfat (KPO4) arabelleği (pH 6.0), 25 mL ekleyin , 1 mL 1 M Kalsiyum klorür (CaCl2) ve 1 mL 5 mg/mL kolesterol (etanol içinde).
-
Hipoklorit çözüm
- 4 mL sodyum hipoklorit çözüm (% 6) ve deiyonize H2O toplam hacmiyle 50 mL 5 mL 5 m KOH, karıştırın.
-
S Bazal
- 5 gram NaCl, 1 g K2HPO4, 6 gr KH2PO4ve 1 L, sonra otoklav için de-iyonize su karıştırın.
2. konsantre E. coli (OP50) hazırlanması
Not: Bu adım bir doymuş E. coli çözeltinin 1 L S Bazal arabellek 25 mL yoğunlaşmaktadır.
- Autoclaved LB suyu (Adım 1.1) 5 mL bir koloni E. coli (zorlanma OP50) ile aşılamak ve 4-6 h 37 ° C'de (250 devir/dakika) sallayarak ile için kuluçkaya. Bu çözümün 0.1 mL lb 1 L bir 2 L Erlenmeyer şişesi aşılamak için kullanın. 1 L şişeler gecede (12-16 h) 37 ° C'de (250 devir/dakika) sallayarak ile kuluçkaya.
- 500 ml'lik santrifüj şişe 10.000 x g ve bakteri cips ve uzak kalan medya dikkatle boşaltmak için 4 ° C ' 5 min için 1 L gecede kültürlerde santrifüj kapasitesi. Pelet 25 mL S Bazal (Adım 1.4) resuspend. 4 ° C'de mağaza
3. hazırlık NGM kültür plakaların
- Solucanlar çok sayıda üretmek için kullanılan kitle kültürü plakaları erimiş (60 ° C) NGM agar (Adım 1.2) bir otomatik sıvı losyonlu aparat veya serolojik pipet ile 10 cm kültür plakalar üzerine kabin laminar akışı 30 mL dağıtmak. Kuru gece kalmak için izin verir.
- Konsantre OP50 tamamen yatırma ve plaka, dönen Ağar yüzey kapsayacak yaymak her 10 cm plaka üzerine 2 mL damlalıklı sonra plakaları kuru izin verir. Tabaklar 4 ° C'de 2 hafta için saklayın.
- Tarama için kullanılan yüksek işlem hacmi tahlil kültür plakaları için 96 iyi plaka laminar akış dolabında her kuyuya erimiş NGM agar 0.15 mL dağıtmak için otomatik bir 8 kanal dağıtıcı kullanmak. Kullanım bakım emin kuyu olun kabarcıklar yoksun, bunlar o kadar iyi tahlil taviz Worms burrowing sağlayacak vardır. Kuru gece kalmak için izin verir. Tabaklar 4 ° C'de 2 hafta için saklayın.
4. sıcaklık duyarlı (ts) steril C. Elegans kitle kültürü hazırlanması
- Kültürler, '(cam pipet ile ekli bir platin tel veya imal edilmiş solucan çekme) bir solucan pick' bir diseksiyon mikroskop altında kullanarak başlatmak için 20 yumurta transferi (TJ1060 soy: spe-9 (hc88) ben; 3.1 adımda hazırlanan kitle kültürü plate(s) üzerine rrf-3(b26)II). Sonra 20 ° C'de plakaları için 6 gün kuluçkaya (bir nesil için büyüme, döl taşındı 20 yumurta toplama için hedeflediğiniz gibi sağlar).
- Görsel olarak gravid yetişkin (yumurta rahim içinde mevcut) varlığını diseksiyon mikroskop doğrulamak. Gravid yetişkin cam pipet kullanarak tabağa Bazal S 2-3 mL dağıtımı tarafından toplamak. Kalenin çevresinde sıvı el ile girdap, sonra sıvı cam pipet kullanarak bir 15 mL tüp içine toplamak.
- Spin aşağı (20 ° C'de 1,5 dk 1000 x g) tüp solucanlar cips, daha sonra süpernatant Aspire edin. 10 mL hipoklorit çözüm (Adım 1.3) solucan Pelet ekleyin ve hızla tüp bir üst alt yönde elle her 2.5 dakikada sallayarak 5 s. Incubate için 5 min için çalkalanır.
- Yine, spin tüp (1,5 dk 1000 x g); Pelet sarımsı-kahverengi olmalıdır. Süpernatant Aspire edin. 10 mL hipoklorit çözüm yumurta Pelet ekleyin ve tüp şiddetle çalkalanır. 1-3 dk, ara sıra sallayarak ile görünüm diseksiyon mikroskop ile izleme sırasında kuluçkaya. Görsel olarak sadece yumurta kalıyor ve sonraki adıma geçin onaylayın.
- Spin aşağı tüp (1,5 dk 1000 x g) ve süpernatant Aspire edin. Pelet ile hiçbir kahverengi rengi beyaz olmalıdır.
Not: hipoklorit çözümü kaldırıldıktan sonra bu steril teknikleri ve arabellekleri, kirlenme beri kullanmak için önemlidir (bakteriyel ve mantar, özellikle) israf değerli zaman ve reaktifler deneyi mahvedebilir. Bu çalışmada kullanılan bir filtre uygulanmış laminar akış kabine ve sıvılar steril Pipetler ve ipuçlarını kullanarak taşındı. - Tüpler bir steril alanında açın. 3 kez ile S Pelet Bazal (1,5 dk 1000 x g) aşağı iplik ve uzak süpernatant her zaman aspirating yıkayın. Yumurta Pelet 2-3 mL S Bazal yeniden askıya alma. Bu yumurta şimdi arabellekte bir gecede kapağı L1 larva (5. adım) toplamak için kullanılabilir.
5. zaman uyumlu kültürler (L1 larva C. Elegans hazırlama) almak için arabellek C. Elegans yumurta kuluçkalık
- Steril cam petri kabına bir kapak ile içine yumurta Pelet ve arabellek dikkatle boşaltmak. Serolojik pipet ile 2-3 mL s Bazal kullanarak bir çanak içine kalan yumurta tüp durulayın. Bu tarama, (dansöz orbital Çalkalayıcı ile 20 devir/dakika) sallayarak yanacaktır teşvik gibi kalabalık, kolaylaştırmak için Bazal s 5 mL ekleyin. Bir gecede 20 ° C'de yumurta zaman kapağı (16-24 h) için izin vermek için kuluçkaya. Bütün yavru 1st larva aşamasında (L1) gıda yokluğu nedeniyle tutuklarım.
Not: Taze L1 hazırlıkları (16-36 saat sonra yumurta toplama) Yetişkin solucanlar en zaman uyumlu nüfus oluşturmak anekdot niteliğinde kanıtlar gösterir. - L1s 15 mL tüp serolojik pipet ile toplamak. Bir santrifüj (1,5 dk 1000 x g) L1s spin, uzakta süpernatant Aspire edin ve bütün L1s S 10 mL bir sonraki adım için Bazal bırakarak tabak, yumurtadan toplanmıştır kadar tekrarlayın.
- L1s içeren tüp, micropipette dışarı 0,01 mL (hemen karıştırdıktan sonra) ve bir seribaşı dağıtmak (yok E. coli) NGM plaka. L1s plaka üzerinde saymak. 10 kez yineleyin ve her aliquot L1s sayısında için ortalama elde edilir. Genel olarak, 1-3 L1s (20 yumurta içeren 1 kitle kültürü plaka ile Başlarken) µL başı arasında bekliyoruz.
- Serolojik pipet ile S L1s tutan Bazal hacmi belirlemek. Solucan L1s toplam sayısını tahmin etmek için önceki adımda elde 0,01 mL başına belirlenen ortalama sayısı ile o zaman tahmin et. Genel olarak, 10.000-30.000 L1s (başına 20 yumurta içeren kitle kültürü plaka) arasında bekliyoruz.
- Bu kültür 96-iyi tahlil kullanmak için L1 süspansiyon 1 µL steril yuvarlak medya şişedeki L1 sulandırmak, sonra adım 7'ye gidin. Bu kültür ek oluşturmak için kullanılacak ise C. elegans kültürler kitle, sonra adım 6'ye gidin.
6. büyük ölçüde zaman uyumlu kültür hazırlama
Not: L1 çözümleri hızlı bir şekilde solucan örneğin alınma olasılığını artırmak için kullanılabilir.
- Büyük solucan numara bir L1 çözüm oluşturmak için her bir kitle kültürü plakaları için istediğiniz sayıyı 5. 000'e kadar L1s dağıtmak. Gravid yetişkin 4.1-2, adımlarda açıklandığı gibi 2.5 gün sonra (20 ° C) toplamak ve yumurta toplamak için 4,3 adıma geçin.
- Bu tekrarlanan hipoklorit koleksiyonu boyun eğdirilmiş nüfus stres, nüfus tarafından bölünmüş anecdotally gözlenmiştir gibi malzeme çekme hipoklorit tedavilere kalan nüfus çok tabi önce yayma için o birden fazla yumurta nesiller nüfusun art arda hipoklorit çözüm tedaviye tabi değil.
7. Kur 96-iyi tahlil plakaların
- (3.3 adımda hazırlanan) tahlil plakaları oda sıcaklığında ulaşmak için izin verir. Sonra bir laminar akış kabine içinde her şey için konsantre OP50 (Adım 2.2 hazır) 5 µL ekleyin. Daha önce olduğu gibi bir otomatik 8 kanal dağıtıcı kullanın.
- 10 µL L1 süspansiyon, bir otomatik 8 kanal dağıtıcısı kullanarak her şey ekleyin. Onlar süspansiyon 1 µL L1 olmadığı için bu şey, başına ortalama 10 solucanlar üzerinde ortaya çıkarır. L1s eşit dağılımı Bulamaç teşvik etmek, L1s aktif olarak orta derecede yavaş yavaş dönüm ile karışık bir yuvarlak medya şişe dağıtmak heyecan bar.
- Plaka kapak plakaları, kutu toplu halde ile kapak ve 25 ° C de 2 gün kuluçkaya.
8. 1 st gün yetişkin C. elegans kimyasallar ile tedavi
- Kimyasal Kütüphane plakaları dondurucudan kaldırın ve plakaları oda sıcaklığında devam etmeden önce ulaşmak izin.
Not: burada açıklandığı gibi kimyasal Kütüphane plakaları her şey, tüm bunların aynı konsantrasyonu ve DMSO içinde çözünmüş olarak ayrı bileşikler içeren 96 iyi tabaklar. Bu kütüphanelerin dış sütunları kullanmak değil de her plaka en fazla 80 farklı kimyasallar öyle. Burada açıklanan iletişim kuralında, Kütüphane konsantrasyonu 10 mM boyundadır. Fenotipleri çözücü etkileri dikkate almak önemlidir. Bu çalışmada bir DMSO konsantrasyonu % 0,5 ekranlar iken, bu düzey asla bu ömrü deneyleri ve iş hızı düşük deneyleri, nerede bir bileşik hisse senedi çözüm konsantrasyonu almaya daha yüksektir aşıldı. Bu iletişim kuralı, ömrü değişiklikler16, en azından N2 zorlanma meydana gelmez bir düzey % 0.25 aşmaz. - Yavaşça plaka üzerinde bir Mikroplaka shaker 1 dk. için 60 RPM hemen kullanmak için önceden sallamak.
- Bir otomatik 96-şey sıvı işleyicisi, transfer 0,75 µL bileşik (veya DMSO) Kütüphane plaka tahlil plaka için kullanmak. Öyle ki sıvı işleyicisi pipet uçları 0,75 µL birim (solucanlar ve konsantre OP50 adımlardan 7.1 ile agar yüzeyinde sıvı ~ 15 µL için teslim tahlil plaka sıvı teslimat sırasında pipet derinliği dikkatlice, kontrol edilir -2) ve agar yüzeyinin kuyuda delip değil. Kılavuzu 8 veya 12 çok kanallı Pipetler dışında çok küçük ekranlarında kullanmayın (< 10 plaka), onlar hata ve kez tahlil ödün vermez agar yüzeyinin Delme sonucu artırabilir.
- Test edilen Kütüphane DMSO solvent kullanan varsayarak kimyasal Kütüphane negatif kontrol pilakalar DMSO (Dimetil sülfoksit), hazır olun. Her 5 için 1 negatif kontrol levha Kaplamalar, 10 negatif kontrol plaka kadar test edin. Mümkünse, aynı zamanda bir olumlu denetim tabak hazırla (NP11 son tahlil yoğunlaşması 0.1 mm, 20 mm etkili bu amaç için; temsilcisi sonuçları bölümüne bakın). Kuruma için özellikle duyarlı oldukları gibi kimyasallar (test veya denetimi) plakaları, 2 Dış sütun için eklemeyin.
9. kurutma kültürler
- Agar yüzeyinden sıvı kaldırmak için 4-8 h için kabine laminar akış levha kuru. Bu tabakları tamamen kurumuş ama değil kurumuş olmak çok önemlidir. Bir kaç tabak diğerlerinden daha kuruması için daha uzun sürer gibi tüm plakaları yakından izlemek ve en kısa zamanda kuru kaldırın. Plaka bireysel kuyu dikkatli görsel denetim tarafından kurutma onaylayın.
Not: egzoz değeri kabine etmenlere bağlı olarak, bu süreyi ampirik olarak belirlenmelidir. Bu kurutma adım yaklaşık 4-8 h tam bir kabine için alabilir. - Şeffaf film ile plakalarının sonra tabak kapakları koydu.
- 96-iyi tahlil plakaları 45 için spin 1000 x g s.
- 25 ° C'de ters mağaza plakaları
10. puanlama C. Elegans kültürler için uzun ömürlü
- İzlemek kadar negatif kontrol Kaplamalar > % 95'i ölüm gözlenen. Kaplamalar, haftalık için ilk iki hafta ve her gün bundan sonra kontrol edin. Caenorhabditis tabur aynı soy ve türlerin deneme17tarafından önemli ölçüde farklı katlanacak görüntüleyebilirsiniz.
Not: Burada, 25 ° C'de kültürlü TJ1060 hayvanlarla açıklanan ömrü tahlil için % 95'i ölüm bu nüfusu yetişkin gün 16-20 oluştu. - Ne zaman negatif kontrol wells olarak kabul edilir ulaşmış > % 95 mark, tüm 96-iyi tahlil plakaları 45 için aşağı spin bir Mikroplaka ile bir masa üstü santrifüj s adapte rotor (250 x g 45 için s 20 ° c).
- Denetim plakaları bütün wells puan. Bu sayma ve canlı ve ölü hayvan sayısı her Peki kayıt yapılır. Ölü solucanlar sağ kurt hareketi tam onların eksikliği nedeniyle farklı. Sağ kurt hareketinde 96 iyi plaka yaklaşık 7 cm diseksiyon mikroskop yüzey üzerine herhangi bir çatışmaya yanıt için mercek ile bakarken tarafından atılan kışkırtmak. Ölü solucanlar yanıt ve yakındaki laboratuvar arkadaşları tekrarlayan gürültü takdir olmayabilir.
- Test plakaları için saymak ve canlı solucan içeren wells kaydedin. Canlı bir solucan gözlenen zaman, o kadar iyi, iyi pozisyon ve plaka ile birlikte tüm canlı ve ölü hayvan saymak.
Not: Genellikle plakaları sonra yeniden puanı yararlı olduğu > negatif kontrol solucanlar % 99'u öldü. Büyük ölçekli ekranları, bu ilk Puanlama yapmak için en iyi nokta olabilir. Her iki durumda da, skor/yeniden-yukarıda açıklandığı gibi score
11. yeniden test bileşikler
- Az sayıda aday bileşikler sınarken (< 320 bileşikler), bir yeniden test veya bir aday ekran (bkz: temsilcisi sonuçları) ile tahlil 32 Merkez wells için olası plaka etkileri en aza indirmek için bir çaba kısıtlamak gibi. Bu 2 kuyu plaka kenarına yakın tedavi edilmemiş ama hala agar, gıda ve solucan içeren bırakır.
Representative Results
Biz bu iletişim kuralı 96-şey ömrü deneyleri için istihdam temsilcisi sonuçları inceleyerek başlar. İlk örnekte, yöntem başarıyla için 30.000 kimyasallar ile ekran için kullanılan kimyasallar, C. elegans, ömrünü uzatmak ve ayrıca takip yeniden test ekranından sonuçlarını en iyi kimyasallar kullanarak içerir tanımlamak aynı protokol. Bu sonuçlar yukarıda açıklanan1idi. İkinci örnek daha küçük ölçekli ekran aday bileşiklerin aynı iletişim kuralını kullanır.
Büyük ölçekli ekran ve yeniden test: 30.000 bileşikler test büyük ölçekli ekran yinelenen içinde tek bir doz olarak gerçekleştirildi. Her kimyasal bu nedenle iki Wells 20 beklenen bir toplam hayvan nüfusu ile test edildi. Bunu yapmak için üç ayrı Grup (yinelenen içinde) 10.000 bileşiklerin ~ 3 ay tüm 30.000 bileşikler kapsayacak şekilde bir süre içinde gösterildi. Bu kısmen, el ile testin sonunda puanlama yönetilebilir bir miktar sağlamak için yapılır ve her set 96-iyi tahlil plakaların 260 toplam gerekli. Kütüphane hisse senedi levha, sadece 80 wells bileşik yer alan; bir çoğaltma 10.000 bileşiklerin 125 tahlil plakaları yapar. Bu çalışmada 2 çoğaltır her sette 10 negatif kontrol plakalı kullanılır. İş çıkarma yeteneğini artırmak için ne zaman negatif kontrol nüfus % ~ 99 ölüm deneyimli olması değerlendirildi plakaları skorlanmıştır. Canlı solucanlar için tüm test Wells sonra muayene.
Wells bir canlı solucan ile kimyasalların sayısı olarak biliniyordu. Wells de denilen isabeti ve ayrıca bu Wells tüm solucanlar (canlı ve ölü) 1'den fazla solucan hayatta içeren kimyasallar sayılır basit bir skor oluşturmak için (yüzde canlı skor; sağ kurt ölü solucanlar numarasına göre bölünmüş sayısı). Her kimyasal kütüphanede bu nedenle bir hit iki kez olarak adlandırılabilir ve bu şarkıları olabilir, ama -ebilmek değil, var onlarla ilişkili puanları. 512 farklı kimyasallar (en az bir kez) sayısı 30.000 bileşikler ekrandan çağrıldı. Ekran güçlü ve/veya sağlam (tekrarlanabilir) yanlısı uzun ömürlü etkileri tanımlamak amacıyla gerçekleştirildi. Bu iki farklı özellik farklı etkileri olabilir. Güçlü kimyasallar bu durumda olduğu anlamına gelir'ın kuyuda hayatta olduğun için solucanlar yüksek bir yüzde beklediğiniz ömrü, önemli ölçüde arttırabilir. Sağlam kimyasallar için her iki çoğaltır canlı solucanlar için beklenir. Bulunanlar listesi bu kriterlere göre sırada yer aldı. 179 kimyasalların yüksek yüzde Canlı Skorlar, vermiştir veya her iki çoğaltır vuruldu ve bu nedenle yeniden test etmek için seçilmiştir. Sayısı olarak adlandırılan, ancak yeniden test etmek için seçili değil kalan kimyasalların çoğu yalnızca birinde Çoğalt wells, hayatta bir tek solucan yer.
Şarkıları yeniden sınamadan gerçekleştirilen, dışında birincil ekran 3 çoğaltır (beklenen toplam hayvan nüfusu 30) ve tedavi edilmezse denetim plakaları hayvanlarda katlanacak dikkatli miktar ile benzer. Bu değişiklikleri test ve denetim kuyuları karşılaştırma yardımcı olmak için eklenmiştir. kimyasal sayısı 179 yeniden sipariş, 10 mM ile seyreltilmiş ve 96 iyi kalıplara taşındı. Sadece iç 24 kuyu yeniden test tahlil için kullanılmıştır (geçerli sürümlerinde bu protokolü kullanılan iç 32 wells yeniden test ekranlar için protokol bölümünde açıklandığı gibi) ve bileşikleri nüsha altı negatif kontrol tahlil plakalı içinde yeniden test edildi DMSO solvent ile tedavi. Bir negatif kontrol plaka düzenli aralıklarla toplam yaşam (şekil 1A) için atan oldu. Denetim hayvanlar yaklaşık % 95'i ölü iken, tüm plakaları tamamen skorlanmıştır (tüm tedavi canlı ve ölü solucanlar sayılır).
Sayısı yeniden test sonuçlarını aramak için bir kesme ve ortalama yüzde canlı Puan negatif kontrol + 2 standart sapma (SD) yapıldı. Test kuyular için yüzde (puanlama sırasında) canlı ortalama puanları her şey için üç çoğaltır üzerinden yüzde canlı skor sayı ortalaması alınarak hesaplanan. Bu özel tahlil için negatif kontrol Wells'in ortalama yüzde Canlı Skorlar 48 wells (2 setleri onaylatılacak negatif kontrol) için üç çoğaltır ortalama olarak hesaplanmıştır. Yeniden test kimyasal kümesinden sayısı derdi SD SD 48 negatif kontrol genelinde ortalama olarak yüzde Canlı Skorlar oldu. Bu stratejiyi kullanarak, bu çalışmada 57 sayısı 179 bileşikleri, (şekil 1B) yeniden test Kimyasalları % 32 toplam pozitif test gösteren yeniden test Kütüphanesi bulundu. Negatif kontrol ve test kuyuları için ortalama yüzde canlı skor binning test wells denetim wells (şekil 1C) geride belirtti.
Aday ekran: Küçük ölçekli ekranlar yukarıda açıklanan sınava yeniden girmek için benzer bir şekilde gerçekleştirilebilir. Burada, 139 bileşikler ile aday ekranından sonuçları açıklayın. Bu adayların yapıları uzun ömürlü teşvik muhtemeldir toplandı. Bu ekran için iki farklı dozda (50 µM ve 100 µM) test plakaların 5 çoğaltır gerçekleştirilen. Ayrıca, iki farklı dozda içeren bir tek olumlu denetim (NP1) plaka ile 8 negatif kontrol levha, kullanılan; 50 µM ve 100 µM.
Hayvanların ~ %90 ölü olana negatif kontrol levha takip. O zaman, canlı ve ölü solucanlar tüm denetim Wells ve canlı solucanlar bulunan test kuyulardan sayarak wells skorlanmıştır. O zaman canlı puanlama yüzde ortalama yüzde canlı skorları her şey için hesaplamak için kullanılmıştır. Negatif kontrol için 8 çoğaltır üzerinden yüzde Canlı Skorlar 32 kuyu vardı. Pozitif kontrol için her doz için 4 çoğaltır genelinde ortalama 4 iyi skorları vardı. Sayısı ortalama büyük bir ortalama yüzde canlı skor ile kuyuları için çağrıldı negatif kontrol yüzde canlı Puan edinildi + 2 SD Bu kesim 14 sayısı aday ekrandan yaptı ve tüm negatif kontrol Wells hariç. Bu kesim de olumlu denetim dahil 100 µM ve olumlu denetimleri % 50'si tedavi wells tedavi 50 µM. Bu sonuçları sunulan burada binned ortalama 50 µM (Şekil 2A) ve 100 µM (Şekil 2B) test ekranları için yüzde canlı skorları.
Son olarak, tüm plakaları bir zamana denk geç bir zaman noktasında yeniden attı negatif kontrol % 99 daha fazla tedavi ederken hayvanlar ölmüştü. Bu sonuçları olumlu denetim wells Lübnan negatif kontrol ve test wells (Şekil 2C) dışı sahne olduğunu belirtti. Test kuyu negatif kontrolleri biraz daha iyi iken. Bu ikinci sonucu birçok test Wells toksisite kontrol tedavi (Tablo 1), böylece bu basit yorum semptomlarıdır göreli sergi ortaya çıktı göstergesi tarafından önyargılı. Bu yeniden test ekran aslında daha toksik olmayan bileşikler için önceden filtrelenmiş iken aday Kütüphane kimyasal C. elegans, bilinmeyen biyolojik aktivite ile gerçek bir ekran oldu bu yana, beklenen oldu. Bu birincil ekran ömrü uzamış bileşikler olduğu için önemli ölçüde zehirli kimyasal maddeler yeniden test ayarlanmamış.
Resim 1 : Temsilcisi sonuçları yüksek üretilen iş ekran ve yeniden test
(A)yaşayanlar eğri yeniden test assay olarak kullanılan bir temsilcisi negatif kontrol plaka. Bu eğri bu tahlil testin 18 gün içinde 4 kez kullanılan 24 Wells tüm canlı ve ölü solucanlar puanlama inşa edilmiştir. Gün 18 erişkin, denetimleri ~ %5 hayatta kalmak için değerlendirildi ve tüm kontrol testi ve plakaları sonra da skorlanmıştır. (B) tablo ekran ve yeniden test sonuçları özetleme. (C) Binning wells ortalama yüzde hayatta puanları yeniden test ekranından kontrol ve test koşulları için. Denetimler için puanları 48 kuyulardan her 3 çoğaltır ortalamasını oluşan. Test sonuçlarını 179 kuyulardan her üç çoğaltır üzerinden Ortalama puanı oluşan. Şekil 1 bir önceki yayın1ile yeniden oluşturulur. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Temsilcisi sonuçları bir aday ekrandan
(A)Binning 50 µM aday ekranından sonuçlarının. 139 test-iyi sonuçları ortalama yüzde canlı skor 5 çoğaltır temsil eder. 32 negatif kontrol sonuçları ortalama yüzde Canlı Skorlar 8 çoğaltır dan oluşur. 4 olumlu denetim sonuçları ortalama yüzde Canlı Skorlar 4 çoğaltır (16 toplam içeren NP1, 50 µM kuyuları) dan oluşur. (B) Binning 100 µM aday ekranından sonuçlarının. Tüm Yani (A), aynı test wells ve olumlu denetimleri 100 µM konsantrasyonları tedavi edildi dışında. Aynı negatif kontrol levha hem (A ve Biçinde) gösterilir. (C) temsilcisi plakaları nispeten aşırı geç saat noktada yeniden gelen puanlama sonuçları. Pozitif denetimleri büyük ölçüde tüm diğerleri, sadece wells ile canlı solucanlar karşı test wells ana metin ve Tablo 1' de açıklandığı gibi önyargılı bu zamanda noktada yüzde için muhasebe Eğer geride. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Ortalama yüzde hayatta puanları binning | ||||||
| Gruplandırılmış puanları | Tüm ölü (0) | 1-10 | 11-20 | 21-30 | 31-40 | > 41 |
| Yeniden test | ||||||
| # (-), Denetim | 16 | 31 | 1 | 0 | 0 | 0 |
| # Test Wells (50µM) | 46 | 69 | 50 | 8 | 3 | 3 |
| Aday ekran | ||||||
| # (-), Denetim | 0 | 11 | 21 | 0 | 0 | 0 |
| # (+) kontrol (50µM) | 0 | 0 | 2 | 2 | 0 | 0 |
| # (+) kontrol (100µM) | 0 | 0 | 0 | 0 | 2 | 2 |
| # Test Wells (50µM) | 94 | 22 | 21 | 2 | 0 | 0 |
| # Test Wells (100µM) | 86 | 25 | 21 | 6 | 1 | 0 |
Tablo 1: Farklı ekranlar binning temsilcisi sonuçları
Burada--dan iki perde (yeniden test ve aday) ortalama yüzde Canlı Skorlar binning mevcut. Yeniden test ekranında, negatif denetimine benzer zirve negatif kontrol sağdaki önemli ölçüde daha iyi performans tekrar testleri ile tablonun (uzun ömürlü) yan. Bu birden çok yanlısı uzun ömürlü bileşikler yeniden test kümesinde varlığını gösterir. Aday ekranda, biz varken zirve tüm ölü kategorisinde de tablonun sağ taraftan belirgin bir sinyal olduğunu görürsünüz. Bu yanlısı uzun ömürlü bileşikler aday küme varlığını gösterir, ancak aynı zamanda aday grup bileşikler arasındaki önemli toksisite varlığını gösterir.
Discussion
Burada C. elegans 96-şey levha kültür için basit bir yöntem anlatmıştık. Ama biz bu kültürler kimyasal tarama ve ömrü deneyleri için tarif deneyleri birçok türü için kullanılabilir. Ise kimyasal tarama için çok iyi kültür koşulları daha önce bildirilen8olabilirdi, ömrü analiz10için dahil burada açıklanan tahlil çeşitli şekillerde farklıdır. Burada açıklanan ömrü tahlil 96-şey plakaları kullanır, steril mutantlar (yerine kimyasal sterilizasyon) dayanan, agar kültürü koşulları kullanır, basit sıvı solucanlar taşımak için işleme kullanır ve uç noktada el ile attı. Bu tahlil kullanılan farklı yaklaşımlar araştırmacılar bu koşullar yer yöntemleri eleme için seyir için yardımcı olabilir.
Esas olarak tahlil için üretilen plakaların kalitesine Merkezi bu iletişim kuralı için çok önemli öğeleri. İlk olarak, tabak yaparken bu agar yüzeyinin kabarcıklar ve diğer kusurları ücretsiz zorunludur. Bu değişimler agar yüzeyinin hemen hemen her zaman tavşan çukuru ve kaybı iyi neden. İkinci olarak, bu iletişim kuralını kurulum ve hap veriyorsun aşamasında biriken sıvı kapalı kurutma dayanır. Bu sıvılar tamamen kaldırılır, ancak agar kurudu olmak değil önemlidir. Anecdotally, görünüşe göre tamamen değildir Wells solucanlar (sıvı içinde yüzme) kurutulmuş canlı düzgün kurutulmuş wells, daha fazla tabak kurutma kuruma ve tavşan çukuru ve kaybı solucan yol agar çatlama yol açar iken uzun. Başka bir önemli unsur bu protokol steril koşullar sürdürmektedir. Olarak herhangi bir ömrü tahlil ile bir sürü iş plaka kurulumu ile ilgili ve yerleşmek ve Tabaklarda büyümeye kirlenme bozma tahlil için birçok fırsat ve zaman adlı biri yok.
Burada açıklanan ömrü tahlil C. elegansbileşikler ile taranması için yararlıdır, sıcaklık duyarlı (ts) steril yaratıyordur dayanıyor gibi belirli genetik arka planlar için sınırlı iken; Biz yüksek kısırlık alellerle vardır TJ1060 kullanılır. Bu tarama için kullanılabilir suşları bu yöntem ile sınırlar. Ts steril mutasyonlar istenen arka plana geçiş veya kimyasal sterilizasyon kullanarak da dahil olmak üzere alternatif yaklaşımlar. Biz bu tahlil ile kimyasal sterilizasyon denemedim ama mümkün olmalıdır. Potansiyel Engelli Sterilizatör solucanlar üzerinde doğru aşamada ve uygun dozda yerleştirerek içerir. Açıklanan protokol burada hızlıdır, ancak yetişkin etkili bir şekilde dağıtmak için görünmüyor bir Sıvı Sabunluk kullanır. Bu yüzden, bu solucanları Tabaklarda geliştirmek ve bu nedenle Tabaklarda kimyasal sterilizasyon ile tedavi edilmelidir. En uygun doz belirleme ve zamanlama başarısı için önemli olacaktır. Alternatif Stratejileri yetişkin taşıyabilirsiniz bir dağıtım yöntemini kullanarak içerir. Geçmişte, biz makineleri belirlemek ve yetişkin sıralamak mümkün genellikle çok daha yavaş askıya alınmış larva homojen çamurlar dağıtabilirsiniz basit sıvı işleyicileri, bulduk.
Genel olarak, yaşam süresi üzerinde büyük olumlu etkileri için hızla ekran kimyasallar ve tedavileri için bu yöntemi kullanın. Yöntemi ile birden fazla dozlarda kullanıldığında özellikle etkilidir, yüksek sayılar çoğaltmak ve her zaman muhafaza ve test plakaları arasında serpiştirilmiş negatif denetimleri izlenmesi kapatın. Pozitif denetimleri tasarlama ve bu el yazması açıklanan ekranlar uygularken yararlıdır. Ancak, etkili bir pozitif olmak, denetimin oldukça güçlü ve/veya son derece sağlam olması gerekir. Ekranın ilk olarak dağıtıldığında, uygun güçlü ve sağlam bir bileşik tanımlanamıyor. Şu anda vardır birçok raporlar olumlu denetimler için muhtemel adayların 'yaşlanma' Edebiyat burada açıklanan ekranlar yararlı. Bu el yazması beklenen sonuçları bölümünün aday ekran bölümünde ve Şekil 2 ve Tablo 1' de açıklandığı gibi bileşik NP1 bu ekran etkili bir pozitif kontrol içindir. Biz genellikle bu ekranlar ile standart ömrü deneyleri 3 mm kültür Tabaklarda gelen pozitif sayısı onaylayın.
Disclosures
Bu eser destekleyici finansman hiçbir varlık veri, analiz sonuçlarının veya yayımlamak için karar koleksiyonu üzerinde herhangi bir giriş vardı yazarlar bildirin.
Acknowledgments
Dipa Bhaumik, Aaron Miller ve Bob Hughes teknik yardım için teşekkür ederiz. Suşları NIH ofisi araştırma altyapı programları (P40 OD010440) tarafından finanse edilen CGC tarafından temin edilmiştir. Georgia Woods ve Lithgow, Kapahi ve Melov Labs üyelerine yararlı tartışmalar için minnettarız. M.L. ulusal kurumları Sağlık (NIH) eğitim Grant T32 AG000266 ve bir Ellison tıbbi Vakfı/Amerikan Federasyonu, yaşlanma araştırma bulunan bursu tarafından desteklenmiştir. Bu eser bir hibe BioAge Labs tarafından desteklenen, Larry L. Hillblom Vakfı Hibe yanı sıra ulusal sağlık Enstitüleri verir UL1024917, Geroscience ve 1R01AG029631-01A1 G.J.L. için disiplinler arası araştırma Konsorsiyumu destekleyen
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB Broth Miller Granules | VWR | ||
| Unispense | Wheaton Science Products | automated fluid dispensing apparatus | |
| 96 well assay plate; COSTAR 3370 | Corning | ||
| Multidrop 384; automated 8 channel dispenser | Thermo Fisher Scientific | ||
| manufactored worm pick | Genesee Scientific | ||
| Belly Dancer Orbital Shaker | Stovall Life Science inc. | ||
| microplate shaker; MTS 2/4 Digital | IKA Works, inc. | ||
| automated 96-well liquid handler; Biomek FX Liquid Handler | Beckman Coulter | ||
| automated 96-well liquid handler; Bench Top Pipettor | Sorenson Bioscience, inc. | ||
| manual 8 or 12 multi-channel pipettes | we use rainin… | ||
| transparent 96 well film cover; TempPlate RT Optical Film | USA Scientific | ||
| table top centrifuge; Centrifuge 5810 R | Eppendorf |
References
- Lucanic, M., et al. Chemical activation of a food deprivation signal extends lifespan. Aging Cell. , (2016).
- Evason, K., Huang, C., Yamben, I., Covey, D. F., Kornfeld, K. Anticonvulsant medications extend worm life-span. Science. 307 (5707), 258-262 (2005).
- Melov, S., et al. Extension of life-span with superoxide dismutase/catalase mimetics. Science. 289 (5484), 1567-1569 (2000).
- Benedetti, M. G., et al. Compounds that confer thermal stress resistance and extended lifespan. Exp Gerontol. 43 (10), 882-891 (2008).
- Hansen, M., Hsu, A. L., Dillin, A., Kenyon, C. New Genes Tied to Endocrine, Metabolic, and Dietary Regulation of Lifespan from a Caenorhabditis elegans Genomic RNAi Screen. PLoS Genet. 1 (1), 17 (2005).
- Lee, S. S., et al. A systematic RNAi screen identifies a critical role for mitochondria in C. elegans longevity. Nat Genet. 33 (1), 40-48 (2003).
- Samuelson, A. V., Carr, C. E., Ruvkun, G. Gene activities that mediate increased life span of C. elegans insulin-like signaling mutants. Genes Dev. 21 (22), 2976-2994 (2007).
- Kwok, T. C., et al. A small-molecule screen in C. elegans yields a new calcium channel antagonist. Nature. 441 (7089), 91-95 (2006).
- Petrascheck, M., Ye, X., Buck, L. B. A high-throughput screen for chemicals that increase the lifespan of Caenorhabditis elegans. Ann N Y Acad Sci. 1170, 698-701 (2009).
- Solis, G. M., Petrascheck, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates. J Vis Exp. (49), (2011).
- Angeli, S., et al. A DNA synthesis inhibitor is protective against proteotoxic stressors via modulation of fertility pathways in Caenorhabditis elegans. Aging (Albany NY). 5 (10), 759-769 (2013).
- Fabian, T. J., Johnson, T. E. Production of age-synchronous mass cultures of Caenorhabditis elegans. J Gerontol. 49 (4), 145-156 (1994).
- Greer, E. L., Brunet, A. Different dietary restriction regimens extend lifespan by both independent and overlapping genetic pathways in C. elegans. Aging Cell. 8 (2), 113-127 (2009).
- Mair, W., Panowski, S. H., Shaw, R. J., Dillin, A. Optimizing dietary restriction for genetic epistasis analysis and gene discovery in C. elegans. PLoS One. 4 (2), 4535 (2009).
- Hamilton, B., et al. A systematic RNAi screen for longevity genes in C. elegans. Genes Dev. 19 (13), 1544-1555 (2005).
- Frankowski, H., et al. Dimethyl sulfoxide and dimethyl formamide increase lifespan of C. elegans in liquid. Mech Ageing Dev. 134 (3-4), 69-78 (2013).
- Lucanic, M., et al. Impact of genetic background and experimental reproducibility on identifying chemical compounds with robust longevity effects. Nat Commun. 8, 14256 (2017).
