Summary
Wir beschreiben eine original Transfer-RNA-Analyse-Plattform namens SPOt (optimierte Plattform für die Beobachtung der tRNA). Ort und Stelle misst simultan zelluläre Ebenen alle tRNAs in biologischen Proben, in nur drei Schritten und in weniger als 24 Stunden.
Abstract
Transfer-RNA (tRNA) sind reichlich kurzen nicht-kodierende RNA-Spezies, die in der Regel 76 bis 90 Nukleotide in der Länge sind. tRNAs sind direkt verantwortlich für die Proteinsynthese Codons in mRNA in Aminosäuresequenzen übersetzt. tRNAs galten lange als Zimmermädchen Moleküle, die regulatorische Funktionen fehlten. Allerdings zeigt eine wachsende Zahl von beweisen, dass zelluläre tRNA Ebenen, in Übereinstimmung mit unterschiedlichen Bedingungen wie Zelltyp, Umwelt und Stress schwanken. Die Fluktuation der tRNA Ausdruck hat direkten Einfluss auf gen Übersetzung, Begünstigung oder unterdrücken die Expression von bestimmten Proteinen. Schließlich begreifen, die Dynamik der Proteinsynthese, erfordert die Entwicklung von Methoden in der Lage, qualitativ hochwertige tRNA Profile liefern. Die Methode, die wir hier vorstellen heißt Ort, steht für optimierte Plattform für Beobachtung tRNA. Vor Ort besteht aus drei Schritten, beginnend mit metabolischen Kennzeichnung von Zellkulturen mit radioaktiven Orthophosphat, gefolgt von Guanidinium-Thiocyanat-Phenol-Chloroform-Extraktion von radioaktiven total RNAs und schließlich Hybridisierung auf hauseigenen gedruckt Macroarrays. tRNA Ebenen sind geschätzt, indem die Radioaktivität Intensitäten an jedem Ort der Sonde zu quantifizieren. Im hier vorgestellten Protokoll Profil wir tRNAs in Mycobacterium Smegmatis Mc2155, ein apathogen Bakterium häufig als Modellorganismus verwendet, um Tuberkulose zu studieren.
Introduction
Zelluläre tRNA Ebenen schwanken je nach Bedingungen wie Zelltyp, Umwelt und Stress1,2,3. SPOt, optimierte Plattform für die Beobachtung der tRNA, ist ein Original, zuverlässig, und einfache Technik, die schnelle und präzise Quantifizierung der Transfer-RNA-Spiegel im Labor gewachsen Organismen ermöglicht.
tRNAs haben bemerkenswert stabil sekundäre und tertiäre Strukturen4. Sie zeigen auch zahlreiche posttranskriptionelle Modifikationen5. Diese Funktionen stellen wesentliche Struktur- und Sequenz Straßensperren Vorspannen oder manchmal verhindert direkte und reproduzierbare tRNA Profilierung mit standard-Benchmark RNA Quantifizierung Techniken6. Forschergruppen auf der ganzen Welt waren gezwungen, kreativ, aber oft komplizierten Techniken um zelluläre tRNA-Ebenen zu bewerten. Einige dieser Methoden sind: (1) zweidimensionale Elektrophorese Trennung von metabolisch beschrifteten tRNAs kombiniert mit methodischen Ort Zuordnung von Northern Blot1; (2) individuelle Quantifizierung von Northern blot mit sorgfältig standardisierte radioaktiver DNA-Sonden7; (3) nach Extraktion Etikettierung mit Cyanin Fluorochromes gefolgt von Microarray-Analyse3und (4) in-vitro- Abisolieren der tRNA Änderungen mit Hilfe von rekombinanten Demodification Enzymen kombiniert mit reverse Transkription und die anschließende Hochdurchsatz-Sequenzierung8.
Vor Ort ist eine einfache und originelle Kombination aus zwei unkomplizierten Ansätze: (1) RNA Körper bezeichnen, besteht in der Synthese in den wachsenden Organismen, von radioaktiven total RNAs und (2) tRNA Macroarrays, eine systematische und miniaturisierte genomische Werkzeug optimiert für tRNA Segregation.
Proben sind von lebenden Organismen auf die Quantifizierung Plattform optimiert. Sie werden direkt nach der Extraktion analysiert und nicht verarbeitet nicht weiter die Verzerrungen im Vergleich zu Techniken, die Post-Extraktion Verstärkung oder enzymatischen Behandlungen erfordern wesentlich einschränkt. SPOt ist vielseitig und leicht zu Polysome Fraktionierung zu identifizieren und quantifizieren tRNA Subpopulationen, die physisch verbunden mit der Übersetzung von Ribosomen sind kombinierbar.
Die hier vorgestellten Protokoll ist optimiert für Mycobacterium Smegmatis, und es wurde auch erfolgreich eingesetzt, um Profil tRNAs in Escherichia coli9, Saccharomyces Cerevisiae10, Maus und menschlichen Zellkulturen11 .
Protocol
1. Kultur und metabolische Kennzeichnung
- Poke einmal das Zentrum der GAP eine sterile 1,5 mL Mikro-Zentrifuge Röhren mit einer 18-Gauge-Nadel um ordnungsgemäße Belüftung zu ermöglichen. Impfen 500 µL ergänzt steril 7H 9 Brühe mit 5 µL M. Smegmatis aus Vorspeise Kultur angebaut über Nacht12.
Hinweis: Das Rezept für einen Liter 7H 9 Brühe ist: 4,7 g kommerziellen 7H 9 Pulver, 2 mL Glycerin, 1 mL Tween 80, 0,85 g NaCl, 5 g Eiweiß, 2 g Dextrose, H2O (bringen Gesamtvolumen bis 1 L).- (Vorsicht) Im Anschluss an standard Strahlenschutz Praktiken spike Nährmedien mit 20 µCi/mL [32P] Na2HPO4. Wachsen Sie Bakterien bei 37 ° C und 1.200 u/min Unruhe in einem Shaker Inkubator platziert hinter einer 9 mm dickem Acryl Schild.
- In midlog Phase (O.D.600 nm ~ 0,5), übertragen die gesamte Kultur in ein 2-mL-Schraubverschluss-Röhrchen und pellet radioaktiven Bakterien bei Raumtemperatur durch Zentrifugieren für 2 min bei 10.000 x g. sammeln überstand enthält nicht inkorporierten radioaktiven Orthophosphat in entsprechende Abfallbehälter.
2. Vorbereitung des gesamten RNAs
Hinweis: Insgesamt RNAs werden extrahiert aus bakteriellen Pellets mit einem kommerziellen RNA Extraktion Reagens (mit Guanidinium-Thiocyanat, Phenol und Chloroform) nach der Hersteller-Protokolls.
- Fügen Sie 1 mL der kommerziellen RNA-Extraktion-Reagenz und ca. 200 µL von Glasperlen auf das Pellet. Das Röhrchen fest und stören die Bakterien in einem Homogenisator für 2 min unter maximale Erregung, (Nummer fünf auf ausgewählte Instrument einstellen (siehe Tabelle der Materialien)).
- Zentrifuge Probe bei 12.000 x g für 10 min bei 4 ° C. Den Überstand auf eine neue 2-mL-Tube übertragen und die Perlen entsprechend entsorgen. Geben Sie 0,2 mL Chloroform hinzu und kräftig schütteln Sie Rohr von Hand für 15 S. Zentrifuge bei 12.000 x g für 15 min bei 4 ° C.
- Sammeln der wässrigen Phase der Probe in einen neuen Schlauch durch das Rohr auf 45° Angeln. Zeichnung der Interphase oder organischen Schicht zu vermeiden. Fügen Sie 2 µL der farbigen Fällungsmittel und 0,5 mL 100 % Isopropanol. Schütteln Sie kräftig das Rohr von Hand für 5 S. Zentrifuge bei 12.000 x g für 10 min bei 4° C.
- Den Überstand aus dem Rohr zu entfernen und entsorgen Sie entsprechend wie die flüssige Fraktion Spuren von Radioaktivität enthalten kann. Luft trocken Pellet für 5 min dann in 200 µL 2 X Kochsalzlösung-Natriumcitrat (SSC), 0,1 % (w/V) Sodium Dodecyl Sulfat (SDS) endgültige aufzuwirbeln.
Hinweis: Die Zusammensetzung der Lager 20 X SSC ist 3,0 M NaCl, Natriumcitrat 0,3 M, pH 7.0.
3. Vorbereitung der 96 gut Drucker Platten
Hinweis: tRNA Microarrays werden manuell mit zweiundvierzig 70-Mer DNA Oligonucleotides Ergänzung zum 3' Ende jedes M. Smegmatis tRNA (terminal CCA ausgeschlossen) mit einem 8-poligen Arrayer gedruckt. Die Sequenzen der DNA-Oligonukleotid Sonden sowie die Sonde Layout in der Well-Platte und das Array werden zur Verfügung gestellt (ergänzende Datei 1 - Blatt 1 bis 3 bzw.).
- Design-DNA-Sonden von ersten Abrufen von tRNA-Sequenzen oder tRNA Kodierung Gene von tRNA-Datenbanken wie z. B. die genomische tRNA Datenbank13. Trim konservierten 3' Ende CCA kodiert. Umgekehrte Ergänzung die resultierende Sequenz. Bestellung-Sonde basierend auf den ersten 70 Nukleotiden.
- Aufschwemmen Sie trockenere DNA-Sonden im Wasser. Passen Sie die Sonden Konzentration bis 100 µM. Bereiten Sie in einem 96 Well-Platte 120 µL 50 µM Oligos in 3 X SSC, 0,01 % (w/V) SDS Finale (verdünnte 60 µL Lager Sonden in einzelnen gut mit 60 µL 6 X SSC, 0,01 % (w/V) SDS.
- Abdeckplatte mit Zinnfolie Verdampfung oder Kontamination zu verhindern, sofort einfrieren und halten bei-20 ° C bis benötigt.
(4) Array drucken
- Tauen Sie die 96-Well-Platte bei Raumtemperatur (dauert ca. 20 min.).
- Beschriften Sie Amin-beschichtete Objektträger mit einem Diamant-Stift. Platzieren Sie Folien in Indizierung Gerät. Folgen Sie die Raster-Platzierungen und gehen Sie wie folgt.
- Tauchen Sie sorgfältig den Replikator Pins in den Brunnen.
- Drucken Sie sanft das Array auf die Glas-Objektträger mit minimalem Druck (Sie werden einen kleinen Widerstand spüren). Weiterdrucken Sie ohne Reinigung Arrayer bis fertig mit Block A.
- Wenn Sie bereit sind, auf den nächsten Block zu bewegen, Folgen des Waschvorgangs beschrieben.
- Replikator in 5 % Bleichmittel Tauchen und vorsichtig schütteln.
- Presse-Replikator in saugfähigem Papier.
- DIP Replikator im destillierten Wasser, schütteln, und drücken Sie in Papier. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal.
- DIP Replikator in Isopropanol, schütteln, und drücken Sie auf dem Papier.
- Trocknen Sie den Replikator auf den Lüfter für ca. 20 s bevor ich auf den nächsten Block von 96-Well-Platte. Gewünschte Anzahl der Abzüge weiter.
- Lassen Sie die Folien dann Crosslink Oligos auf die Folie mit einem 254 nm UV-Vernetzer trocknen.
- Legen Sie das Energieniveau auf 999.990 µJ/cm2.
- Das Folien-Gesicht auf einer sauberen Fläche in der Vernetzer aufgestellt. Drücken Sie die Taste "start".
- Blockieren Sie die Arrays über Nacht in 450 mL Lösung auf einen Magnetrührer, bei Raumtemperatur und unter langsamen Rühren zu blockieren. Erfassen Sie und Wiederverwenden Sie blockierende Lösung bis zu viermal.
Hinweis: Das Rezept für die blockierende Lösung ist: 125 mM Phosphatpuffer (NaH2PO4NUM2HPO4-) pH 7,2, 2,25 % SDS (w/V), 0,5 mM EDTA, 0,5 X SSC, 1 % BSA (w/V). - Waschen Sie die Folien 2 Mal für 5 min bei Raumtemperatur in 500 mL destilliertem Wasser. Trocknen Sie die Folien durch Zentrifugieren für 10 s bei Raumtemperatur in einer Microarray-Zentrifuge. Speicher-Arrays in einem trockenen und dunklen Platz für bis zu 6 Monaten.
(5) Array Hybridisierung
- Vor der Hybridisierung Folien in kochendem Wasser spülen und trocknen durch Zentrifugieren (wie in 4.6).
- Array in einer Hybridisierung Kassette platzieren und radioaktiven RNS-Probe zu laden.
- Führen Sie die automatische Hybridisierung-Waschstation für maximale Reproduzierbarkeit.
- Programmschritte wie folgt. Zustand-Dichtungen für 2 min bei 75 ° C. Einführen der Sonde bei 60 ° C.
Denaturieren Sie Sonden und Proben 5 min bei 90 ° C. Hybridisieren Sie Proben für 3 h bei 60 ° C.- Objektträger bei 50 ° C mit 2 X SSC, 0,1 % (w/V) SDS, Fluss 10 s zweimal waschen und halten 20 s. Wash Folien bei 42 ° C zweimal mit 0,1 X SSC, 0,1 % SDS, Fluss 10 s und halten 20 S. Wash Folien bei 42 ° C zweimal mit 0,1 X SSC , Fluss 10 s und halten 20 s.
- Programmschritte wie folgt. Zustand-Dichtungen für 2 min bei 75 ° C. Einführen der Sonde bei 60 ° C.
- Trockenen Folien durch Zentrifugieren (wie in 4.6).
(6) Array Quantifizierung
- Wickeln Sie Folien mit einer dünnen Kunststoff-Folie. Folien für radioaktive Signal mit einem Geigerzähler auf seine empfindlichsten Einstellung zu überprüfen. Folien auf eine Lagerung Phosphor Leinwand in einer Exposition Kassette bei Raumtemperatur für 10 bis 90 h je nach Signalstärke aussetzen.
Hinweis: Da die Empfindlichkeit der Geigerzähler variieren von einem Gerät zum anderen, Belichtungszeiten müssen empirisch optimiert werden. - Scan-Dia mit 50 µm Auflösung mit einem Phosphorimager. Quantifizieren Sie und subtrahieren Sie Hintergrund-Radioaktivität Intensitäten an jede Sonde Stelle mit der kostenlosen Bild J-Software mit einem Microarray-Profiler aufgerüstet.
- Organisieren Sie und verarbeiten Sie Daten, die mit einem elektronischen Tabellenkalkulation. Mit der bedingten Formatierung Tool Heatmaps erzeugen. Vertreten Sie zum Beispiel jede Sonde Signal als Bruchzahl (ausgedrückt in ‰) des gesamten Sonde Signals.
Representative Results
Drei unabhängige biologische repliziert Show, die unter den getesteten Wachstumsbedingungen, alle M. Smegmatis tRNAs ü Hintergrund (Abbildung 1) ausgedrückt werden. In diesem besonderen Experiment besteht die beobachteten Standardabweichung für jede Sonde zwischen 2 % (Arg (TCT)) und 22 % (Cys (GCA)) mit einem Median von 5 % (Abbildung 1). Falsche Änderungen auf Wiederholungen werden maßgeblich beeinflusst durch Faktoren wie Array Vorbereitung und Hybridisierung. Hoher Reproduzierbarkeit wird erreicht durch sorgfältige und konsequente Array drucken sowie automatisierte Probe Hybridisierung. Es gibt einen 5-fold Unterschied zwischen tRNA Ile (GAT) und tRNA (Val (TAC), die höchsten und niedrigsten reichlich Arten bzw.. Vor Ort zeigt, dass der Ausdruck der tRNA Isoacceptors nicht einheitlich ist. Isoacceptors sind Arten, die die gleiche Aminosäure zu halten aber anzeigen verschiedene Anticodon Sequenzen und daher verschiedene Codons auf mRNAs zu entschlüsseln. Zum Beispiel werden alle Alanin Isoacceptors auf ähnlichem Niveau ausgedrückt, während die höchsten und niedrigsten Arginin akzeptieren tRNAs unterscheiden sich durch 3-Fach.
Abbildung 1: repräsentative tRNA Macroarray Ergebnisse. (A) gescannte bakterielle, Maus und menschlichen Macroarrays. M. Smegmatis Arrays verwenden nur 43 Sonden statt 48 für Maus und Mensch. Folglich zeigt das bakterielle Array 40 leere Spots (Sonden werden acht Mal repliziert, auf jedes Array), die in den Hintergrund übergehen. Die meisten von ihnen sind in der oberen linken Ecke zusammengefasst. (B) Histogramm und Heatmap Darstellungen der tRNA-Profile in M. Smegmatis unter optimalen Wachstumsbedingungen. Sonde Signale sind im Durchschnitt von drei unabhängigen Experimenten (einschließlich bakterielles Wachstum, metabolische Etikettierung, Extraktion und Array Hybridisierung) und nach tausend Werte der gesamten tRNAs ausgedrückt werden. Standardabweichungen für die drei Wiederholungen sind bzw. als Fehlerbalken und Schattierungen von Orange auf dem Histogramm und Heatmap angegeben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Discussion
Beta Partikelemissionen sind bakteriostatisch und antibakterielle Agenten14, bekannt, aber Strahlungen im Bereich getestet keine nennenswerten Auswirkungen auf Zelle Fitness haben. Funkeln Zählung ergab, dass 25 % der Gesamt-Zelle Extrakten und anschließend 1 % des gereinigten total RNAs die Radioaktivität eingegliedert ist.
Der Sonden identische Größen, vergleichbarer Schmelztemperatur und GC-Gehalt, sowie ein einheitliches Protokoll für Macroarray Schmierblutungen, Hybridisierung und Quantifizierung erlauben eine objektive Messung der tRNA Ebenen direkt vom spot Signale.
Ort ist reproduzierbar und spezifisch. Seine großen Dynamikbereich und leicht einstellbaren Schwellwert ermöglicht Profilierung geringere reichliche Arten wie tRNAs Polysomes, einfach durch eine Verlängerung Array Belichtung Zeiten9zugeordnet. Nach der anfänglichen Investition für die notwendige Ausrüstung die laufenden Kosten pro Probe, einschließlich Verbrauchsmaterialien, im Durchschnitt $15 pro Proben.
Vor Ort gilt für jeden Organismus, dessen Genom für Sonde Design zur Verfügung steht. Modell-Organismen, die in-vitro- angebaut werden sind ideale Kandidaten für die metabolische Beschriftung. Wie Säugetier-Genome codieren oft viele Isodecoders (tRNAs, die Teilen identisch Anticodons, aber kleine Unterschiede in ihren Körper Sequenzen anzeigen) müssen Sonden teilweise degenerierten, homogene Hybridisierung enge tRNA-Arten zu erhalten sein. Schließlich liefern anhaftende Säugetier-Zellen in der Regel geringere Mengen an Gesamt-RNS im Vergleich zu Organismen in Federung wie M. Smegmatis, angebaut, so Kulturen erheblich skaliert werden müssen.
Disclosures
Kein Interessenkonflikt erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt durch einen SC INBRE Zuschuss aus dem National Institute of General Medical Science - NIH (P20GM103499, r.g.) und gewährt von der National Cancer Institute P.H.H. CA555536 & CA154664 Dieses Programm wurde zum Teil durch einen Zuschuss an das College of Charleston aus dem Howard Hughes Medical Institute über das Pre-College & Undergraduate Science Education Program und durch Zuschüsse aus dem National Center für Forschungsmittel (5 P20 RR016461) unterstützt und das National Institute of General Medical Sciences (8 P20 GM103499) von den National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass slide indexing system | V&P Scientific, Inc. | VP 470 | |
| Glass slide arrayer replicator | V&P Scientific, Inc. | VP 478 | |
| 96 well microplate indexing system | V&P Scientific, Inc. | VP 472 | |
| Wash and blot station | V&P Scientific, Inc. | VP 475 | |
| Replicator pin dryer | V&P Scientific, Inc. | VP 474 | |
| Amine coated slides | Molecular Devices | K2615 | |
| Hybridizer / Automated hybridization and washing station | Digilab | Hyb10022 | |
| Shaker incubator | Eppendorf Themomixer | 05-400-200 | |
| Screw cap 2 ml tubes | Thermo Scientific | 21-403-201 | |
| [32P] Na2HPO4 | Perkin Elmer | NEX011001MC | |
| Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform (Trizol) | Invitrogen | 15596026 | |
| 0.5 mm glass beads | Research Products International Corp. | 9831 | |
| Mini bead mill | VWR | 25-020 | |
| Storage phosphore screen | Fujifilm | BAS-IP SR 0813 | |
| Phosphorimager | GE Healthcare | Typhoon FLA7000 | |
| DNA oligonucleotides | IDT | N/A | |
| UV crosslinker | Spectroline | Select series 254 nm | |
| Microarray centrifuge | Arrayit Corporation | MHC110V | |
| Mycobacterium smegmatis | ATCC | 700084 | |
| Single-use needles | BD (Becton Dickinson) | 305185 | |
| 2 ml centrifuge tube | Fisherbrand | 14-666-317 | |
| Precipitant (GlucoBlue) | Invitrogen | AM9516 | |
| 7H9 broth | Difco | 271310 | |
| Chloroform | Fisher Chemicals | C298-500 | |
| Isopropanol | Fisher Chemicals | A451-4 | |
| 20 X SSC | Lonza | 51205 | |
| SDS | Fisher Bioreagents | BP166-100 | |
| hybridisation cassette | GE Healthcare | 63-0035-44 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Tween 80 | Amresco | M126-100ML | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Albumin | Spectrum Chemicals | A3611 | |
| Dextrose | Fisher Chemicals | D16-1 | |
| EDTA (Ethylenediaminetetraacetic Acid) | Fisher Bioreagents | BP2482-500 | |
| 0.5 M Phosphate buffer pH 7.2 | Alfa Aesar | AAJ63974AP |
References
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