Summary
El protocolo actual presenta procedimientos experimentales para estimular macrófagos cultivados para ser dotado de capacidad para liberar factores moleculares que promueven la consecuencia del neurite. Tratamiento de entrenamiento de los co-cultivos de neurona-macrófago induce a los macrófagos para producir medio condicionado que posee fuerte neurite consecuencia actividad.
Abstract
Hay fuerte evidencia que los macrófagos pueden participar en la regeneración o la reparación del sistema nervioso lesionado. Aquí, describimos un protocolo en el que los macrófagos son inducidos a producir acondicionado medio (CM) que promueve la consecuencia del neurite. Las neuronas del ganglio (DRG) de adultos raíz dorsal agudo disociadas y plateadas. Después de que las neuronas se unen estable, macrófagos peritoneales son cultivados conjuntamente en una inserción de cultura celular superpuesta en el mismo bien. Cyclophosphate que amperio cíclico (campo de la db) se aplica a las culturas Co durante 24 h, después de que el cultivo celular insertar que contiene los macrófagos se traslada a otro pozo para recoger CM 72 h. La CM de los co-cultivos tratados con db-campamento, cuando se aplica a una cultura de neurona adulta independiente DRG, muestra robusta neurite consecuencia actividad. Los CM Obtenido de los cultivos tratados con db y campamento que consta de un solo tipo de células sólo, neurona DRG o macrófago peritoneal, no mostró actividad de consecuencia del neurite. Esto indica que la interacción entre las neuronas y los macrófagos es indispensable para la activación de los macrófagos que secretaban factores moleculares con actividad de consecuencia del neurite en CM. Así, nuestro paradigma de la cultura también será útil para el estudio de señalización intercelular en la interacción macrófago-neurona para estimular a los macrófagos a ser dotado de un fenotipo pro-regenerativa.
Introduction
Una variedad de estudios han intentado mejorar la regeneración del axon de CNS después de las lesiones de la médula espinal o el cerebro. Las reacciones inflamatorias, que inevitablemente acompaña a las lesiones en el sistema nervioso, tradicionalmente se cree que participan en procesos patológicos secundarios conduce a resultados deletéreos de1,2. De hecho, metilprednisolona que puede suprimir las reacciones inflamatorias es la única terapia aprobada para lesiones de médula espinal aguda3. Sin embargo, estudios más recientes han proporcionado evidencia que los macrófagos, un tipo de célula inflamatoria representante, pueden participar en la regeneración o la reparación del sistema nervioso lesionado4,5,6. Por ejemplo, infiltrarse en los macrófagos tras un lente lesiones producen pro renovables las moléculas para promover la regeneración de las neuronas ganglionares de la retina7,8. Además, trasplantado las neuronas DRG aumentaron en el crecimiento del axón hasta la región donde fueron activados los macrófagos por el zymosan9. Por otra parte, los macrófagos en el sitio de la lesión pueden crear un entorno permisivo crecimiento de nervios periféricos lesionados10.
Nuestro trabajo también proporcionó evidencia fuerte que los macrófagos pueden contribuir a la capacidad de regeneración de axones en las neuronas adyacentes. Hemos demostrado que la activación de los macrófagos en los ganglios de raíz dorsal (GRD) es esenciales para mejorar la capacidad regenerativa de DRG neuronas sensoriales siguiendo un preacondicionamiento periférica del nervio lesión11. Una investigación similar fue reportada independientemente de otro laboratorio12. También demostramos que intraganglionic inyección de cyclophosphate amperio cíclico (campo de db), que es una molécula conocida para mejorar la capacidad de regeneración del axón13, inducida por la activación de los macrófagos. La desactivación de los macrófagos suprimió los efectos de la db-campo de actividad de consecuencia del neurite. Obras posteriores identificaron expresión inducida por la lesión de CCL2 en las neuronas como una señal para estimular macrófagos con un fenotipo pro-regenerativa14,15.
Basado en los resultados experimentales anteriores, hemos establecido un modelo en vitro que se asemeja a los eventos moleculares que ocurren en los DRGs siguiendo un preacondicionamiento lesiones modelo11,14. En este modelo, db-campo se aplica a las neurona-macrófago co-cultivos obtención de señalización que conduce a la activación de macrófagos con un fenotipo pro-regenerativa intercelular. Aquí, describimos protocolos detallados que podemos generar los macrófagos que secretan factores moleculares que promueven neurite consecuencia (figura 1). Este modelo experimental ilustra un concepto que los macrófagos pueden ser estimulados o inducidos para apoyar la regeneración del axón siguiendo las lesiones al sistema nervioso. Nuestro modelo también será útil en el estudio de mecanismos de señalización intercelular que conduce a la activación de los macrófagos pro-regenerativa.
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Protocol
Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el institucional Animal cuidado y uso Comité de Ajou University School of Medicine.
1. cultura preparación de neurona disociado DRG adultos
- Antes de configurar la cultura, la capa de una placa de 6 pozos con poly-D-lisina y laminina. Incubar una placa de 6 pozos con 0.01% poly-D-lisina a 37° C por 2 h o a 4° C durante la noche. Luego, lave la placa dos veces con agua destilada.
- Incube la placa con solución de laminina en una concentración de 3 μg/mL en 2 h a temperatura ambiente y lavar la placa dos veces con agua destilada. Secar la placa a temperatura ambiente al menos 1 h.
- Eutanasia a un ratón en una cámara de2 CO transparente conectado a una bombona de gas comprimida de CO2 . Haga una incisión en la piel que cubre la columna vertebral con una cuchilla quirúrgica y disecar los músculos paravertebral bilateral para exponer los huesos vertebrales. Quitar los huesos vertebrales meticulosamente con una pinza quirúrgica con punta estrecha hasta que en el GRD se expone completamente.
Nota: Las neuronas DRG adultos se obtienen de ratones machos adultos C57BL6 entre 8 semanas a 12 semanas de edad. - Retire el DRGs bilateralmente el S1 hasta el nivel de C1 con iridectomía tijeras y pinzas de punta fina con un microscopio de disección. Intente cortar las raíces de GRD para reducir al mínimo la contaminación de las células de Schwann o fibroblastos.
- Guarde los DRGs disecadas en un 60 mm placa de Petri que contiene 5 mL de frío de Dulbecco modificado Eagle medio (DMEM) en hielo hasta que todos los GRD se recoge.
Nota: Es crítico para disecar el GRD lo antes posible. La colección de los DRGs de un ratón no debe tardar más de 30 min 30 min después de la eutanasia, dejar de recoger los DRGs y proceder al paso siguiente si todavía siguen GRD. - Transferencia de los DRGs a un tubo Eppendorf utilizando una pipeta azul (1000 μL) con un final de corte de 1,5 mL. Retire el DMEM después de una vuelta rápida por varios segundos utilizando una mini centrífuga. Añadir 1 mL de DMEM que contenía 125 colagenasa de XI de tipo U/mL e incubar el tubo durante 90 minutos con una rotación suave (35-40 rpm) usando un agitador de twister en una incubadora de 37 ° C. Inmovilizar el tubo en el piso de coctelera con la cinta.
- Descarte que contienen colagenasa DMEM y añadir 1 mL de DMEM fresco. Espere hasta que el GRD flotante hundirse completamente en la parte inferior y retire el DMEM con los restos de tejido. Repita este paso de lavado por lo menos seis veces.
Nota: No trate de descartar completamente el sobrenadante. Tenga cuidado de no eliminar cualquier DRGs con DMEM sobrenadante. - Transferencia de los DRGs a un tubo cónico de 15 mL, utilizando una pipeta azul (1000 μL) con un final de corte. Luego pipetee hacia arriba y hacia abajo suavemente por lo menos 15 veces con una punta azul (1000 μL) para hacer una suspensión homogénea. Evitar hacer burbujas y tratar de no tocar el fondo de tubo cónico con una punta de pipeta.
- Centrifugar el tubo a 239 x g durante 3 min y cuidadosamente descarte el sobrenadante con flotante de residuos. Añadir 1 mL de Neurobasal suplementado con B27 (2.0% v/v) y resuspender el precipitado de células mediante pipeteo suavemente arriba y abajo de 5 a 10 veces.
- Pasar la suspensión celular a través de un tamiz de celular 70 μm overlaid encima de un tubo cónico de 50 mL. Espere 2 minutos y luego vierta medio Neurobasal/B-27 en el filtro con un aspirador.
- Todos recogidas neuronas DRG (un total de aproximadamente 2 x 106 DRG las neuronas de un ratón) en dos pozos de la placa de 6 pozos de la placa. Las neuronas DRG de un ratón adulto cubren dos pocillos de una placa de 6 pozos. Luego coloque la placa en un incubador de CO2 a 37 ° C hasta que el macrófago Co culturas.
2. la cultura de los macrófagos peritoneales rimary P en A cultura de célula introducir
Nota: Establecer las culturas Co 4 h después de la chapa inicial de las neuronas DRG disociadas
- Macrófagos peritoneales primarios son preparados de ratones machos adultos C57BL6 entre 8 semanas a 12 semanas de edad. Eutanasia a un animal en una cámara de CO2 . Haga una incisión en la piel abdominal con delicadeza, exponer el peritoneo y evitar cortar el peritoneo para evitar una fuga del líquido de lavado.
- Punción del peritoneo utilizando una jeringa con una aguja de 22G e inyectar 10 mL de helado salin con tampón fosfato (PBS) en la cavidad peritoneal. Masajee suavemente el peritoneo durante 1-2 minutos. Entonces, saque la aguja y exprimir el PBS a través del sitio de punción de aguja y recoja el líquido de lavado en un tubo cónico de 50 mL.
Nota: Antes de usarlo, ponga la jeringa en el hielo para mantener la frialdad de la PBS. - Centrifugar el líquido del lavado a 239 x g por 10 min a 4 ° C para que sedimenten los componentes celulares. Resuspender el precipitado con 3 mL del tampón de lisis de glóbulos rojos (gr) por 3 min a temperatura ambiente. Luego Centrifugue la suspensión de células en 239 x g por 10 min a 4 ° C. Resuspender el precipitado con 3 mL de PBS y Centrifugue la suspensión de células otra vez para eliminar cualquier resto tampón de lisis RBC.
Nota: Asegúrese de que el tampón de lisis RBC se quita totalmente. De lo contrario tampón de lisis RBC restante puede ser tóxica para los macrófagos cultivados. - Resuspender las células concentradas en 1 mL de medio de Neurobasal/B-27. La mitad de todos los macrófagos recogidos (un total de 3 × 106 a 6 x 106 células) en un cultivo celular insertar con el área efectiva de 4,2 cm2, que se coloca en la parte superior del pozo de la placa disociado DRG.
Nota: Durante el período de la cultura, los macrófagos se cultivan en medio de cultivo de neuronas de Neurobasal/B-27. Adecuada sobrevivencia de macrófagos bajo esta condición fue confirmada.
3. tratamiento del campo de la Db y colección de macrófagos CM
Nota: Iniciar el tratamiento de la db-campo 4 h después de los co-cultivos de neurona-macrófago.
- Añadir 2 μl de solución de db-campo de 100 μm a los co-cultivos de neurona-macrófago. Añadir el mismo volumen de PBS para un experimento de control.
- Después de 24 h, llenar un pozo vacío con 1 mL de medio de cultivo de macrófagos en la misma placa de 6 pozos. Transferencia del célula cultura inserto en las culturas de la neurona y macrófagos al pozo vacío con medio de cultivo de macrófagos. Mantener las células en la misma condición durante 72 h sin cambiar el medio.
Nota: Agregamos sólo 1 mL de medio de cultivo de macrófagos durante colección de CM para hacer concentrado CM. Durante la colección de CM, si es necesario, agregamos más para cubrir completamente los macrófagos dentro de la inserción. - Después de 72 h, centrifugar el macrófago CM a 239 x g durante 5 min eliminar los componentes celulares. Pasar el sobrenadante a través de un filtro de 0.2 μm para eliminar los residuos celulares restantes. Almacenar el CM recogida a-70 ° C hasta su uso.
4. Neurite consecuencia ensayo recogido cm
- Antes de configurar una cultura de neuronas DRG adultos separada, la capa de una diapositiva 8-pozo cámara siguiendo el mismo procedimiento descrito en 1.1 y 1.2.
- Obtener disociado adulto neuronas DRG Neurobasal suplementado con B27 utilizando los mismos métodos descritos de 1,3 a 1.10. Placa de 5 x 104 células por pocillo en la diapositiva de cámara 8-bien prelacado.
- Coloque el portaobjetos de la cámara en una incubadora de 37 ° C por 2 h, permitiendo que las células en las partes inferiores. Luego, sustituir el medio de cultivo con el CM descongelada que es precalentado a 37 ° C.
Nota: Tenga cuidado de no tocar la parte inferior de la diapositiva 8-pozo cámara al retirar el medio de cultivo y agregar los centímetros recogidos. - 15 h después de la primera chapa, quitarlo del medio y lavar las células con PBS una vez. A continuación, añadir 200 μL de solución de paraformaldehído al 4% helada a los pozos e incubar las células con la solución de paraformaldehído por 20 min a 4 ° C
Nota: La cultura de neuronas DRG para ensayo de neurite consecuencia debería restringirse precisamente a 15 h. Bajo esta condición, no hay ninguna consecuencia apreciable de la neurita. - Lavar tres veces con PBS helado y luego realizar el bloqueo con 10% suero normal de cabra (NGS) con 0,1% Triton-X 30 min incubar las células fijas con solución de anticuerpo primario (anti-Tuj-1) diluida con 10% NGS (en una concentración de 1 μg/mL) durante 4 h en la sala de temperatura o durante la noche a 4 ° C.
- Lavar tres veces con PBS y luego incubar las células con solución de anticuerpo secundario (cabra anti ratón) por 2 h a temperatura ambiente. Luego, Lave dos veces con PBS y Monte la corredera de la cultura con un cubreobjetos (24 × 50 m m) con solución de montaje.
- Tomar imágenes utilizando un microscopio de fluorescencia para visualizar la consecuencia del neurite.
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Representative Results
Se describe un protocolo que puede generar macrófagos capaces de secretar factores moleculares con actividad de consecuencia del neurite. El macrófago CM obtenida de los co-cultivos tratados con db-campo dio lugar a la consecuencia del neurite robusto cuando se aplica a una cultura separada de neurona DRG (figura 2A). En comparación, CM de co-cultivos tratados con PBS no indujo la consecuencia del neurite en nuestra duración 15h cultura (figura 2B). Cuando db-campo se trata a la cultura con macrófagos solo, CM obtenida de esta condición no era eficaz en apoyo a consecuencia del neurite (figura 2). Esto sugiere que la interacción macrófago-neurona es indispensable para estimular macrófagos a ser dotado de una capacidad de proregenerative. También Probamos si CM había obtenida de cultura sólo la neurona tratados con db y campamento y no encontrado ninguna consecuencia del neurite (Figura 2D).
Figura 1: un diagrama esquemático que ilustra los procedimientos para obtener acondicionado medio que contiene actividad de consecuencia del neurite. Las neuronas adultas DRG (2 x 106 células por cada pozo) se cultivan durante 4 horas. Entonces, los macrófagos peritoneales son cultivados en insertar bien, situada sobre el pozo en que DRG fueron cultivadas las neuronas. 4 h después de la galjanoplastia, PBS o cyclophosphate campo se trata. Después de 24 h de incubación, el inserto bien es transferido a otro pozo con medio ml alrededor de 1. Entonces, el transferido bien se incuba durante 72 h. A continuación, se recoge el medio condicionado incubado (CM). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: resultados representativos del neurite consecuencia ensayo uso acondicionado medio Obtenido de varias condiciones. (A, B) Adulto neuronas DRG fueron muy disociadas y cultivadas para exactamente 15 h. 2 h después de la galjanoplastia, medio de cultivo fue substituido por medio condicionado (CM) Obtenido de co-cultivos de neurona y macrófagos tratados con PBS (A) o cyclophosphate cAMP (campamento de db) (B). Sólo el CM tratado con db-campo mostraron robusto neurite consecuencia actividad. (C, D) CM obtenida de las culturas consisten o macrófagos (C) o neurona (D) solo que fue tratada con db-campo no era compatible con consecuencia del neurite. Barras de escala indican 200 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Hay varios pasos fundamentales para la generación de este sistema de co-cultivo. Es importante asegurarse de que las neuronas de ratón DRG y macrófagos peritoneales están preparados frescos y saludables. Hemos experimentado disminución neurite consecuencia actividad del CM cuando la disección de los DRGs tomó más de 30 minutos. Además, la contaminación de los componentes de la sangre en los macrófagos peritoneales también condujo a una disminución de la actividad de consecuencia del neurite en el CM. Con el fin de generar interacción macrófago-neurona robusto por db-campo, lavar bien sería también un paso crítico para asegurar la completa eliminación de restos de tejido y eliminación de los restantes potencialmente citotóxicos componentes, tales como colagenasa o tampón de lisis RBC. Otro punto a reiterarse es que las raíces atadas GRD deben eliminarse tanto como sea posible. Restante de recibos de raíces aumentaría la contaminación de las células de Schwann en la cultura de neuronas DRG. Las células de Schwann pueden producir gran cantidad de factores neurotróficos en la cultura que podrían confundir los resultados.
En este protocolo, disociado de los macrófagos fueron plateados sobre un inserto de cultura celular separado las neuronas DRG plateadas en la parte inferior de la placa de la pozo. Nuestro anterior estudio no mostró diferencias significativas en el grado de actividad de neurite consecuencia entre el CMs de co-cultivos directas (que permite el contacto físico entre los dos tipos celulares) y los co-cultivos con los dos tipos celulares separaron por una cultivo celular insertar11. Este resultado indica que las neuronas y los macrófagos se comunican con uno a través de moléculas solubles liberadas de cualquier tipo de celular, no por contacto físico directo. Fue demostrado que CCL2, secretada de las neuronas DRG, es responsable de activar los macrófagos en un fenotipo pro-regenerador en esta cultura Co modelo14. Así pues, nuestro sistema de co-cultivo permitirá la aclaración de más señalización intercelular que media la activación de los macrófagos pro-regenerativa.
La cultura era precisamente limita a 15 h durante el ensayo de consecuencia del neurite en este protocolo. En experiencias piloto, examinamos varios tiempo de cultura diferentes y encontró que con un mínimo grado de consecuencia del neurite en condición de control (15 h), consecuencia del neurite muy robusta se logró con la CM tratada con db-campo. Las neuronas DRG de ratón, si no precondicionada, no crecen cualquier neurites significativos dentro de este marco de tiempo. Si las neuronas DRG se cultivan más de 15 h, sin embargo, comienzan a mostrar algún grado de consecuencia del neurite en control, condición no previo, que oscurecería cualquier efecto de la CM tratados con db y campamento en la consecuencia del neurite. Resultado similar fue reportado en el análisis de consecuencia del neurite usando las neuronas DRG de rata en un estudio anterior de16.
Algunos estudios anteriores usaron zymosan, una preparación de la pared celular de levadura, para activar macrófagos con un fenotipo pro-regenerativa7,9. Sin embargo, los macrófagos estimulados por zymosan lanzado no sólo de moléculas pro-regenerativa, sino también de factores citotóxicos. Cuando los componentes de la proteína en macrófagos tratado con zymosan CM fueron separados por cromatografía de gel filtración, derivadas de macrófagos factores ≥ 30 kDa fueron citotóxicos mientras que factores ≤ 30 kDa había promovido axon regeneración7. Además, inyección de zymosan a la médula espinal puede conducir a la muerte abierta de neuronas y axones9. En comparación, nuestro protocolo para generar pro-regenerativa macrófagos ha demostrado para ser más fisiológica que la anterior con zymosan. De hecho, db-campo inyección a las neuronas DRG había mejorado su capacidad de axones de crecimiento después de una lesión a la rama central sin ningún informe sobre daños celulares17,18. A lo largo de una serie de nuestros experimentos, no hemos observado nunca ninguna disminución significativa de la densidad de neuronas DRG en la cultura después de la aplicación del CM tratados con db y campamento. Especulamos que nuestro protocolo nos permite producir macrófagos únicamente pro-regenerativa sin neurotoxicidad concurrente. Por lo tanto, el protocolo y modelo experimental reportaron aquí sería útil para identificar firmas moleculares de macrófagos pro-regenerativa y comprender por qué mecanismos el fenotipo pro-regenerativa es evolucionado.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este protocolo es apoyado por una subvención de NRF-2015R1A2A1A01003410 del Ministerio de ciencia, TIC y planeación de futuro, República de Corea.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture insert transparent PET membrane 0.4μm pore size | Corning,Falcon | 353090 | Transparent PET membrane with 0.4-μm pore size, for 6-well plate |
| 70-μm nylon cell strainer | Corning, Falcon | 352350 | |
| 8-well culture slide | Biocoat | 354632 | with a uniform application of Poly-D-Lysine |
| Red blood cell lysis buffer | Qiagen | 158904 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C9407-100MG | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 21103-049 | Containing 1% glutamax and 1% penicilin-streptomycin |
| B-27 supplement, serum free | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 17504-044 | extracellular solution |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 35050-061 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 15140-122 | |
| Poly-D-lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P6407-5MG | |
| Laminin | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | 23017-015 | |
| Adenosine 3', 5'-cyclic monophosphate, N6,O2'-dibutyryl-, sodium salt | Merck Millipore Corporation, Calbiochem | 28745 | |
| 10% Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | 16210072 | |
| Triton-X-100 | Daejung Chemical and Metal Co | 8566-4405 | |
| Anti β III tubulin (Tuj-1) | Promega Corporation | G7121 | Mouse monoclonal antibody |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | A11005 | |
| Hemacytometer | Marienfeld-Superior | N/A | |
| Cell culture CO2 incubator | Panasonic | N/A | |
| Dissecting stereomicroscope | Carl Zeiss | Stemi DV4 | |
| Twist shaker | FINEPCR | Tw3t | |
| Tabletop centrifuge | Sorvall | N/A | |
| Confocal microscope | Olympus America Inc | IX71 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | VWR International, Hyclone | SH30919.03 | |
| Friedman Pearson Rongeurs | FST (Fine Science Tools) | 16021-14 | Stainless steel, 14cm, curved, single joint action |
| Fine Scissors - Tungsten Carbide & ToughCut | FST (Fine Science Tools) | 14558-11 | sharp, serrated |
| Dumont #7 Forceps | FST (Fine Science Tools) | 11272-30 | Dumoxel, 0.07 x 0.04mm, curved |
| Vannas Spring Scissors | FST (Fine Science Tools) | 15000-00 | straight, 3mm cutting-edge, sharp |
| Qualitron DW-41 Micro-Centrifuge | Artisan Technology Group | DW-41 | Input Voltage: 115VAC |
References
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