El protocolo actual presenta procedimientos experimentales para estimular macrófagos cultivados para ser dotado de capacidad para liberar factores moleculares que promueven la consecuencia del neurite. Tratamiento de entrenamiento de los co-cultivos de neurona-macrófago induce a los macrófagos para producir medio condicionado que posee fuerte neurite consecuencia actividad.
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Artículo de método
Co-cultivos de neurona y macrófagos para activar macrófagos secretando factores moleculares con actividad Neurite consecuencia
En este artículo
Resumen
Resumen
Hay fuerte evidencia que los macrófagos pueden participar en la regeneración o la reparación del sistema nervioso lesionado. Aquí, describimos un protocolo en el que los macrófagos son inducidos a producir acondicionado medio (CM) que promueve la consecuencia del neurite. Las neuronas del ganglio (DRG) de adultos raíz dorsal agudo disociadas y plateadas. Después de que las neuronas se unen estable, macrófagos peritoneales son cultivados conjuntamente en una inserción de cultura celular superpuesta en el mismo bien. Cyclophosphate que amperio cíclico (campo de la db) se aplica a las culturas Co durante 24 h, después de que el cultivo celular insertar que contiene los macrófagos se traslada a otro pozo para recoger CM 72 h. La CM de los co-cultivos tratados con db-campamento, cuando se aplica a una cultura de neurona adulta independiente DRG, muestra robusta neurite consecuencia actividad. Los CM Obtenido de los cultivos tratados con db y campamento que consta de un solo tipo de células sólo, neurona DRG o macrófago peritoneal, no mostró actividad de consecuencia del neurite. Esto indica que la interacción entre las neuronas y los macrófagos es indispensable para la activación de los macrófagos que secretaban factores moleculares con actividad de consecuencia del neurite en CM. Así, nuestro paradigma de la cultura también será útil para el estudio de señalización intercelular en la interacción macrófago-neurona para estimular a los macrófagos a ser dotado de un fenotipo pro-regenerativa.
Introducción
Una variedad de estudios han intentado mejorar la regeneración del axon de CNS después de las lesiones de la médula espinal o el cerebro. Las reacciones inflamatorias, que inevitablemente acompaña a las lesiones en el sistema nervioso, tradicionalmente se cree que participan en procesos patológicos secundarios conduce a resultados deletéreos de1,2. De hecho, metilprednisolona que puede suprimir las reacciones inflamatorias es la única terapia aprobada para lesiones de médula espinal aguda3. Sin embargo, estudios más recientes han proporcionado evidencia que los macrófagos, un tipo de cé....
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Protocolo
Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el institucional Animal cuidado y uso Comité de Ajou University School of Medicine.
1. cultura preparación de neurona disociado DRG adultos
- Antes de configurar la cultura, la capa de una placa de 6 pozos con poly-D-lisina y laminina. Incubar una placa de 6 pozos con 0.01% poly-D-lisina a 37° C por 2 h o a 4° C durante la noche. Luego, lave la placa dos veces con agua destilada.
- Incube la placa con solución de laminina en una concentración de 3 μg/mL en 2 h a temperatura ambiente y lavar la placa dos veces con agua destilada. Secar la placa a temperatura ambiente al....
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Resultados
Se describe un protocolo que puede generar macrófagos capaces de secretar factores moleculares con actividad de consecuencia del neurite. El macrófago CM obtenida de los co-cultivos tratados con db-campo dio lugar a la consecuencia del neurite robusto cuando se aplica a una cultura separada de neurona DRG (figura 2A). En comparación, CM de co-cultivos tratados con PBS no indujo la consecuencia del neurite en nuestra duración 15h cultura (.......
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Discusión
Hay varios pasos fundamentales para la generación de este sistema de co-cultivo. Es importante asegurarse de que las neuronas de ratón DRG y macrófagos peritoneales están preparados frescos y saludables. Hemos experimentado disminución neurite consecuencia actividad del CM cuando la disección de los DRGs tomó más de 30 minutos. Además, la contaminación de los componentes de la sangre en los macrófagos peritoneales también condujo a una disminución de la actividad de consecuencia del neurite en el CM. Con el fin de genera.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este protocolo es apoyado por una subvención de NRF-2015R1A2A1A01003410 del Ministerio de ciencia, TIC y planeación de futuro, República de Corea.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Inserto de cultivo celular membrana PET transparente 0.4μ m tamaño de poro | Corning,Falcon | 353090 | Membrana PET transparente con 0.4-μ m tamaño de poro, para placa de 6 pocillos |
| 70-μ m colador de células de nylon | Corning, Falcon | 352350 | |
| portaobjetos de cultivo de 8 pocillos | Biocoat | 354632 | con una aplicación uniforme de Poly-D-Lisina |
| Tampón de lisis de glóbulos rojos | Qiagen | 158904 | |
| Colagenasa de Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C9407-100MG | |
| Medio neurobasal | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 21103-049 | Contiene un 1% de glutamax y un 1% de penicilina-estreptomicina |
| B-27 suplemento, sin suero | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 17504-044 | solución extracelular |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 35050-061 | |
| Penicilina-estreptomicina | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 15140-122 | |
| Poly-D-lisina Hidrobromuro | Sigma-Aldrich | P6407-5MG | |
| Laminina | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | 23017-015 | |
| Adenosina 3', 5'-monofosfato cíclico, N6,O2'-dibutiril-, sal de sodio | Merck Millipore Corporation, Calbiochem | 28745 | |
| 10% Suero de cabra normal | Thermo Fisher Scientific | 16210072 | |
| Triton-X-100 | Daejung Chemical and Metal Co | 8566-4405 | |
| Anti y beta; III tubulina (Tuj-1) | Promega Corporation | G7121 | Anticuerpo monoclonal |
| ratón Anticuerpo secundario IgG (H+L) anti-ratón | de cabra Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | A11005 | |
| Hemacitómetro | Marienfeld-Superior N | /A | |
| Cultivo celular CO2 incubadora | Panasonic | N/A | |
| Microscopio estereoscópico | de disecciónCarl Zeiss | Stemi DV4 | |
| Agitador | FINEPCR | Tw3t | |
| Centrífuga de sobremesa | Sorvall | N/A | |
| Microscopio confocal | Olympus America Inc | IX71 | |
| FBS (Suero fetal bovino) | VWR International, Hyclone | SH30919.03 | |
| Friedman Pearson Rongeurs | FST (Fine Science Tools) | 16021-14 | Acero inoxidable, 14 cm, curvado, acción de una sola junta |
| Tijeras finas - Carburo de tungsteno & ToughCut | FST (Fine Science Tools) | 14558-11 | afilado, dentado |
| Pinzas Dumont #7 FST | (Fine Science Tools) | 11272-30 | Dumoxel, 0,07 x 0,04 mm, curvo |
| Tijeras de resorte Vannas | FST (Fine Science Tools) | 15000-00 | recta, 3 mm de filo, afilada |
| Microcentrífuga Qualitron DW-41 | Grupo de Tecnología Artesanal | DW-41 | Voltaje de entrada: 115VAC |
Referencias
- Donnelly, D. J., Popovich, P. G. Inflammation and its role in neuroprotection, axonal regeneration and functional recovery after spinal cord injury. Exp Neurol. 209 (2), 378-388 (2008).
- Festoff, B. W., et al.
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